相關(guān)光學(xué)和帶電粒子顯微鏡的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種被裝配成執(zhí)行相關(guān)光學(xué)顯微術(shù)和帶電粒子顯微術(shù)的裝置，該裝置包括:
?帶電粒子柱(column),示出用于沿著粒子光軸產(chǎn)生一束帶電粒子的帶電粒子源和包括用于使所述帶電粒子束聚焦的兩個(gè)極靴的磁性物鏡，
?樣本位置，位于極靴之間，
? 一種用于對(duì)位于樣本位置處的薄平樣本進(jìn)行成像的光學(xué)顯微鏡，該光學(xué)顯微鏡示出了垂直于粒子光軸的光軸，
?樣本保持器，用于將薄平樣本保持在其中可以用粒子光軸對(duì)薄平樣本進(jìn)行成像的取向中和在其中薄平樣本垂直于光軸的另一取向中，
本發(fā)明還涉及一種使用此類(lèi)裝置的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]根據(jù)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)US7，671，333已知此類(lèi)裝置。本已知專(zhuān)利描述了一種具有安裝在其中樣本所存在的平面中的可縮回掃描光學(xué)顯微鏡(SOM)的透射式電子顯微鏡(TEM), SOM的光軸垂直于且橫斷TEM的電光軸。通過(guò)使樣本朝著光學(xué)顯微鏡傾斜，可以通過(guò)用掃描激光束來(lái)照射樣本而實(shí)現(xiàn)熒光圖像。此射束激發(fā)樣本中的熒光標(biāo)記。響應(yīng)于所述激勵(lì)，生成光子，其被光學(xué)透鏡的物鏡所收集且隨后被檢測(cè)。使得這些標(biāo)記附著于例如組織的特定部分，作為其結(jié)果，熒光圖像示出例如脂質(zhì)層或特定酶等。此信息然后被用來(lái)限定用于TEM的感興趣區(qū)域。
[0003]應(yīng)注意的是在TEM中，不需要在樣本垂直于TEM的粒子光軸的同時(shí)對(duì)其進(jìn)行成像，而是常常以不同的角度成像，例如當(dāng)制作斷層照片時(shí)。在極端情況下，在樣本相對(duì)于垂直位置以例如70度傾斜的同時(shí)對(duì)其進(jìn)行成像。
[0004]還應(yīng)注意的是還已知使用相關(guān)顯微術(shù)，將來(lái)自光學(xué)和電子顯微術(shù)的不同種類(lèi)的信息組合。
[0005]值得提到的是在透射電子顯微術(shù)中也使用標(biāo)記，但是通常這些包括重金屬(例如金或銀簇(cluster)),在生物材料方面由于其高Z組成而形成對(duì)比。還已知例如金納米粒子的使用，其充當(dāng)熒光標(biāo)記和重金屬標(biāo)記兩者。
[0006]SOM的使用是相當(dāng)昂貴的，并且非掃描顯微鏡的使用從金融角度來(lái)說(shuō)將是優(yōu)選的。然而，已知專(zhuān)利認(rèn)為這是不切實(shí)際的，因?yàn)橥哥R桿(pole)之間的空間是有限的，并且安裝在透鏡桿之間的透鏡必要地在其數(shù)值孔徑(NA)方面被限制。
[0007]NA被定義為sin( Θ )，其中Θ是最大接受角，并且采取等于一的折射率(η = I)，如在空氣和真空中的情況一樣。
[0008]因此，已知專(zhuān)利針對(duì)使用沒(méi)有色彩修正的簡(jiǎn)單透鏡。
[0009]而且，即使SOM并未遭受色像差(chromatic aberrat1n),由于與位置準(zhǔn)確度有關(guān)的激發(fā)光束是單色的，所以等于0.61 λ /NA的衍射限制分辨率極限受到透鏡的NA的限制，如靈敏度一樣，其與物鏡的接受立體角成比例，因此與(NA)2成比例。
[0010]另一此類(lèi)裝置是具有由美國(guó)俄勒岡州Hillsboro的FEI公司出售的iCorr?的商售 Tecnai ?,如在產(chǎn)品數(shù)據(jù)表 DS0126-12-2012 “Tecnai ? with iCorr ? , enablingcorrelative microscopy on the Tecnai TEM”中所描述的。此類(lèi)儀器也稱(chēng)為相關(guān)光-光學(xué)和電子顯微鏡(CLEM)。此裝置使用與透射式電子顯微鏡相結(jié)合的基于LED的熒光顯微鏡。在其中薄平樣本垂直于光光軸(light optical axis)的第二取向上，光顯微鏡在反射和/或熒光模式下收集圖像。此裝置將標(biāo)準(zhǔn)、非掃描裝備(set-up)用于熒光顯微鏡且因此需要消色差物鏡。此類(lèi)透鏡比單色物鏡更加復(fù)雜得多，并且物鏡是15X/0.5 NA透鏡，因?yàn)楦笸哥R(具有更高NA)并未安裝在桿件之間。
[0011]0.5的此透鏡的NA限制熒光顯微鏡的分辨率:衍射限制分辨率等于0.61 λ /NA，其中，λ是光的波長(zhǎng)。
[0012]由于物鏡的接受立體角是受限的，所以靈敏度也是受限的(靈敏度與透鏡所接受的立體角成比例，因此與NA2成比例)。
[0013]存在對(duì)一種具有改進(jìn)光學(xué)顯微鏡的裝置的需要，其在磁性透鏡的桿件的物理約束內(nèi)提供與高靈敏度組合的高分辨率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014]本發(fā)明旨在提供一種裝配有此類(lèi)改進(jìn)光學(xué)顯微鏡的裝置以及一種用于使用裝配有此類(lèi)改進(jìn)光學(xué)顯微鏡的裝置的方法，而不改變磁性透鏡的桿件或所述桿件之間的距離。
[0015]為此，根據(jù)本發(fā)明的裝置的特征在于光學(xué)顯微鏡具有物鏡，其是非旋轉(zhuǎn)對(duì)稱(chēng)的且被截短以安裝在磁性物鏡的桿件之間，并且平行于粒子光軸的尺寸小于垂直于粒子光軸的尺寸，從而在兩個(gè)方向上示出不同的數(shù)值孔徑以及由此的在兩個(gè)方向上的不同分辨率，并且用于收集光的接受立體角大于安裝在桿件之間的最大旋轉(zhuǎn)對(duì)稱(chēng)透鏡的接受角。
[0016]在下文中，透鏡的ΝΑ(Φ)可以是Φ的函數(shù)，其中Φ是垂直于光軸的透鏡取向。因此，一個(gè)取向上的透鏡的ΝΑ(Φ)可以不同于另一取向上的同一透鏡的NA。由于透鏡被截短以安裝在桿件之間，所以在平行于粒子光軸的方向上的NA將是最小NA，而與之垂直發(fā)生最大NA。
[0017]本發(fā)明是基于這樣的理解，即旋轉(zhuǎn)對(duì)稱(chēng)透鏡的直徑在物理上限制磁性透鏡桿之間的接近(access)。較大直徑僅在與樣本位置具有較大距離的情況下是可能的，并且因此用較大的直徑并未改善接受立體角(以及由此的靈敏度)。其也適用于分辨率。
[0018]發(fā)明人認(rèn)識(shí)到通過(guò)例如通過(guò)對(duì)透鏡的一部分進(jìn)行截短來(lái)使得透鏡非旋轉(zhuǎn)對(duì)稱(chēng)或者使用卵形透鏡，可能具有較大接受立體角(因此:靈敏度)以及在一個(gè)方向上比在另一方向上更高的衍射限制分辨率(與最大直徑相關(guān)聯(lián)的取向示出最高分辨率)。
[0019]應(yīng)注意的是“非旋轉(zhuǎn)對(duì)稱(chēng)”在這里意味著透鏡的前表面并未示出旋轉(zhuǎn)對(duì)稱(chēng)。本文并不旨在暗示透鏡是示出并非旋轉(zhuǎn)對(duì)稱(chēng)的焦距的透鏡，諸如在圓筒形透鏡的情況下發(fā)生的。
[0020]應(yīng)注意的是通過(guò)限定在兩個(gè)方向上具有不同ΝΑ(Φ)的透鏡，假設(shè)此透鏡限定射束限制，并且如果其它光學(xué)元件呈現(xiàn)物理限制，則也將這些截短。
[0021]應(yīng)注意的是美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)US2013/0119267A1公開(kāi)了一種具有用以使激光束聚焦到樣本上的光學(xué)部件的樣本保持器。在其
[0019]段中，其提到了也可以將這些部件用于陰極發(fā)光的檢測(cè)。該光學(xué)系統(tǒng)被配置成與垂直于粒子束取向的樣本一起工作。該公開(kāi)并未公開(kāi)在樣本遠(yuǎn)離粒子束傾斜的同時(shí)用于樣本的光學(xué)顯微檢查或成像的光學(xué)系統(tǒng)。
[0022]歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)EP1724809A1公開(kāi)了一種用以形成樣本的光學(xué)圖像的非球面(a-spherical)透鏡。該光學(xué)系統(tǒng)被配置成與垂直于粒子束取向的樣本一起工作。樣本未被放置在粒子光學(xué)顯微鏡的物鏡的桿件之間。
[0023]美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)US2008/0283777A1公開(kāi)了又一光學(xué)系統(tǒng)，包括被配置成與垂直于粒子束取向的樣本一起工作的反射鏡/棱鏡。樣本未被放置在粒子光學(xué)顯微鏡的物鏡的桿件之間。
[0024]在實(shí)施例中，樣本保持器在第二取向上被裝配成在垂直于光軸的平面中使樣本旋轉(zhuǎn)超過(guò)90度。
[0025]當(dāng)制作一個(gè)圖像時(shí)，由于兩個(gè)方向上的物鏡的NA方面的差異，圖像將在一個(gè)方向上示出比在與之垂直的方向上更好的(衍射限制)分辨率?，F(xiàn)在通過(guò)為裝置裝配可以在垂直于光軸的平面中使樣本旋轉(zhuǎn)超過(guò)90度的樣本保持器，可以形成兩個(gè)圖像，每個(gè)在垂直于另一個(gè)的最佳分辨率的方向上具有其最佳分辨率。
[0026]通過(guò)將兩個(gè)圖像組合，可以形成具有比可用未截短透鏡獲得的分辨率更好的分辨率的圖像。此類(lèi)組合可以通過(guò)例如將每個(gè)圖像的傅立葉變換相加且然后使用相加的傅立葉變換來(lái)重構(gòu)圖像而實(shí)現(xiàn)。這可以是相互垂直的兩個(gè)圖像的相加，而且也可以是在不同角度下的許多圖像的相加。
[0027]應(yīng)注意的是可以在傅立葉變換之前或者在傅立葉變換之后執(zhí)行對(duì)準(zhǔn)，但是明顯地應(yīng)在將圖像組合之前完成。
[0028]技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到的是本實(shí)施例還包括超過(guò)兩個(gè)圖像的成像、對(duì)準(zhǔn)和組合，每個(gè)圖像具有不同的取向。
[0029]在優(yōu)選實(shí)施例中，帶電粒子源是電子源且?guī)щ娏Ｗ邮请娮邮?br>[0030]本實(shí)施例包括裝配有透射式電子顯微鏡(TEM)柱、掃描透射式電子顯微鏡(STEM)柱或能夠作為STEM和TEM柱(也被稱(chēng)為(S) TEM柱)進(jìn)行操作的柱的裝置。
[0031 ] 在另一實(shí)施例中，光學(xué)顯微鏡的物鏡是可縮回的。
[0032]通過(guò)使得透鏡可縮回，透鏡的玻璃表面在用粒子光束進(jìn)行成像期間被從樣本位置去除。從而，避免了非期望效果，諸如由于例如電子而引起的透鏡表面的充電。還避免了可能導(dǎo)致降低的透鏡透明度的透鏡污染。
[0033]在又一實(shí)施例中，用薄導(dǎo)電透明層、更具體地一層氧化銦錫(ITO)來(lái)涂敷物鏡的至少一部分。
[0034]通過(guò)使得面對(duì)帶電粒子束的物鏡的表面導(dǎo)電，避免了充電。
[0035]在本發(fā)明的一方面，根據(jù)本發(fā)明的使用裝置的方法包括步驟:對(duì)樣本進(jìn)行定位，使得表面面對(duì)光學(xué)顯微鏡；以及用光學(xué)顯微鏡獲得第一圖像，其特征在于在獲得第一圖像之后，使樣本在垂直于光軸的平面中旋轉(zhuǎn)，并且用光學(xué)顯微鏡來(lái)獲取第二圖像；以及使第一和第二圖像對(duì)準(zhǔn)并組合以形成與第一圖像在平行于粒子光軸的方向上示出的相比具有更高分辨率的圖像。
[0036]在本方法的實(shí)施例中，旋轉(zhuǎn)是超過(guò)90度的旋轉(zhuǎn)。
[0037]在本方法的另一實(shí)施例中在使用光學(xué)顯微鏡獲取圖像之后且在用帶電粒子柱獲取圖像之前使物鏡縮回。
[0038]例如為了避免充電，優(yōu)選地在形成帶電粒子圖像之前使光學(xué)顯微鏡的物鏡縮回以避免由于透鏡的充電而引起的射束擾動(dòng)，并避免透鏡上的污染。
[0039]在又一實(shí)施例中，組合包括形成每個(gè)圖像的傅立葉變換，將傅立葉變換相加，并基于相加傅立葉變換而重構(gòu)圖像。
[0040]優(yōu)選地，執(zhí)行加權(quán)，使得圖像中的每個(gè)中的高頻信息被增強(qiáng)，使得在重構(gòu)圖像中，正確地表示高空間頻率。
[0041]在又一實(shí)施例中，組合包括首先將圖像相加且然后抑制每個(gè)的低頻或首先抑制圖像中的每個(gè)中的低頻且然后將圖像相加。
[0042]這具有與先前提到的傅立葉變換幾乎相同的效果。可以通過(guò)用高通內(nèi)核(highpass kernel)來(lái)處理圖像而執(zhí)行抑制。在組合(相加)圖像中可以實(shí)現(xiàn)類(lèi)似的結(jié)果。
[0043]在該方法的又一實(shí)施例中，該方法還包括使用粒子光學(xué)柱來(lái)獲得圖像。
[0044]優(yōu)選地，此高分辨率圖像(其可以是光學(xué)反射圖像、熒光圖像、拉曼圖像等)的形成后面是使樣本在垂直于粒子光軸的平面中旋轉(zhuǎn)并用帶電粒子柱來(lái)形成圖像，更具體地電子光學(xué)圖像。
【附圖說(shuō)明】
[0045]現(xiàn)在使用附圖來(lái)進(jìn)一步闡述本發(fā)明，其中相同的參考數(shù)字指的是對(duì)應(yīng)特征。
[0046]為此:
圖1示意性地示出了裝配有光學(xué)顯微鏡的透射式電子顯微鏡的