地包括由適當(dāng)?shù)牟牧闲纬傻慕饘倬W(wǎng) 盤(pán)，稱(chēng)為"柵格"。該適當(dāng)?shù)牟牧峡梢园ń饘?。柵格典型地用有孔的無(wú)定形碳的薄層覆蓋。 柵格可以具有規(guī)則排列的孔。有孔的無(wú)定形碳的薄層可以包括規(guī)則排列的孔。還可以使用 不規(guī)則的"花邊形"碳基底。要理解的是，在低溫-EM的情況下，通常使用透明性冰將樣品封 裝在形成在無(wú)定形碳中的孔中。因?yàn)楸墙^緣體并且無(wú)定形碳是不良且高度可變的導(dǎo)體， 二者都累積大量移動(dòng)的表面電荷，這可以使電子束偏轉(zhuǎn)并施加強(qiáng)靜電力在樣品上，這如圖2 和圖3中所示。此外，如果通過(guò)高能電子束輻射無(wú)定形碳，則無(wú)定形碳可能經(jīng)受可以改變密 度并因此改變無(wú)定形碳支撐材料的形狀的化學(xué)變化，從而導(dǎo)致樣品中單獨(dú)的粒子的移動(dòng)。
[0080]
[0081] ?何更詳細(xì)的討論實(shí)施方案之前，首先將提供一個(gè)概述。本文描述的多個(gè)方面 和多個(gè)實(shí)施方案可以提供超穩(wěn)定樣品支架，所述樣品支架可以改善、減輕或消除以上描述 的用于電子顯微鏡的支架具有的每個(gè)問(wèn)題。
[0082]圖4a示例性說(shuō)明根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案的電子顯微鏡支架的剖視圖、平面圖和側(cè)視 圖。圖4a說(shuō)明一種電子顯微鏡樣品支架，所述電子顯微鏡樣品支架包括:支架元件，在這個(gè) 實(shí)例中，是一種連同金屬柵格和金屬箱一起的基本上環(huán)形的部件，所述金屬箱在金屬柵格 的相鄰桁架之間延伸。金屬箱包括多孔區(qū)域。支架元件被配置成提供結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性給多孔金 屬箱。金屬箱的多孔區(qū)域被配置成接收電子顯微鏡樣品。在某些實(shí)施方案中，電子顯微鏡支 架包括安裝在金網(wǎng)柵格上的穿孔的金箱。
[0083]圖4b更詳細(xì)地示例性說(shuō)明示于圖4a中的電子顯微鏡支架的一部分。具體地，圖4b 示出柵格上懸浮的有孔箱膜的近視圖。圖4b的插入圖詳細(xì)地顯示支架結(jié)構(gòu)。
[0084]圖5a至5c示出根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案的設(shè)備的光學(xué)和電子圖像。顯示了每張圖像的比 例尺。圖5a示出根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案的設(shè)備的區(qū)域的低倍光學(xué)圖像。示出的實(shí)施方案包括被 覆蓋在懸浮的有孔金的薄箱中的3_金的金屬網(wǎng)"柵格"。
[0085]圖5b是示于圖5a中的設(shè)備的更高倍的圖像，并示出單獨(dú)的柵格正方形?？梢栽跂?格支架之間的薄金箱中看到規(guī)則排列的孔。
[0086]圖5c是圖5a實(shí)施方案的箱中單獨(dú)的孔的透射電子顯微圖像。所示出的孔含有包括 包埋在薄冰層中的70S核糖體的樣品。
[0087]要理解的是，為了構(gòu)造適合感興趣的一些列電子顯微鏡的支架，可以改變根據(jù)多 個(gè)方面和多個(gè)實(shí)施方案的支架的各個(gè)的參數(shù)。具體地，可以調(diào)整包括本文列出的那些的參 數(shù)以提供適合感興趣的樣品的支架。
[0088] 材料的選擇
[0089] 在示于圖4和圖5中的實(shí)施方案中，選擇金作為用于多孔金屬箱和支架結(jié)構(gòu)這二者 的合適的金屬材料。圖4和圖5的實(shí)施方案的支架結(jié)構(gòu)采取柵格的形式，其自身被安裝在環(huán) 形支架上。金是高傳導(dǎo)性的（電阻系數(shù)2.3μΩ cm，相比與無(wú)定形碳的~1400μΩ cm)，并且穿 孔的金箱在金柵格上部上的放置產(chǎn)生沒(méi)有不連續(xù)熱膨脹系數(shù)的連續(xù)電接地平面。
[0090] 此外，產(chǎn)生自金基底的二次電子的數(shù)量遠(yuǎn)大于來(lái)自碳基底或確實(shí)來(lái)自許多其他候 選金屬的數(shù)量。所產(chǎn)生的二次電子的數(shù)量在支架設(shè)計(jì)中可以是重要的考慮因素，因?yàn)楫?dāng)電 子顯微鏡的電子束撞擊基底時(shí)產(chǎn)生的二次電子起到將樣品上任何正的表面電荷中和的作 用。
[0091] 金具有與碳相似的力學(xué)穩(wěn)定性。金的楊氏模量與無(wú)定形碳的相當(dāng)：金79GPa，而碳 為~lOOGPa)。相反，金不容易經(jīng)受化學(xué)轉(zhuǎn)變并且因此在電子束中更穩(wěn)定。
[0092] 要理解的是，材料性質(zhì)的這種組合使得金成為特別適合的金屬，以用于形成樣品 支架的穿孔箱。其他具有相似性質(zhì)的金屬也是合適的基底，例如鉑、鈀、銠或鉿。
[0093]金箱的厚度
[0094]穿孔的金屬箱層的厚度（圖4b中的t)是根據(jù)本文描述的多個(gè)方面和多個(gè)實(shí)施方案 的支架的可調(diào)參數(shù)。金屬箱的最小厚度由被蒸發(fā)的金屬顆粒的尺寸確定。以金箱為例。樣品 支架的金箱必須比金顆粒更厚以提供足夠的力學(xué)穩(wěn)定性和均勻的電導(dǎo)性。穿孔的金屬(例 如金)箱的厚度也影響例如填充箱中的孔并將樣品保持在那些孔中合適的位置的冰的厚 度。可以根據(jù)期望的冰的厚度選擇最大的金屬箱厚度，期望的冰的厚度進(jìn)而由樣品粒子尺 寸確定?？紤]這些因素，在一個(gè)實(shí)例中提供穿孔的金箱應(yīng)當(dāng)是~5001或所感興趣的樣品粒 子的尺寸，以更大的為準(zhǔn)。
[0095]孔的縱橫比
[0096]當(dāng)設(shè)計(jì)支架時(shí)，對(duì)于金屬箱中孔的縱橫比（圖4中t/d)可能有實(shí)際的限制。那些限 制可以由例如構(gòu)造中的實(shí)際約束和所感興趣的電子顯微鏡的視場(chǎng)的尺寸決定。在一些實(shí)施 方案中，可以選擇孔的直徑(d)與所感興趣的電子顯微鏡的視場(chǎng)匹配，以使得顯微鏡電子束 可以布置成均勻照射金屬箱中的孔，該容納有可以將樣品封裝在其中的冰的孔與金屬(例 如金)的"環(huán)"一起包圍并環(huán)繞金屬箱中穿孔的邊緣。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)在選擇的圖像 放大倍數(shù)下滿足以上標(biāo)準(zhǔn)的最小尺寸給出最優(yōu)直徑。更大的孔可能典型地遭受增加的充電 和束誘導(dǎo)的運(yùn)動(dòng)，因?yàn)樗鼈儼蟮慕^緣冰區(qū)域。例如，對(duì)于在現(xiàn)有電子顯微鏡中典型的 成像條件，在39,000X放大倍數(shù)下并具有1.2μπι的束直徑，可以計(jì)算最優(yōu)箱穿孔孔尺寸為d約 等于Ιμπι。
[0097] 石墨烯裝置
[0098] 根據(jù)一些實(shí)施方案，樣品支架還可以包括石墨烯層。在這些實(shí)施方案中，可以將石 墨烯層結(jié)合到支架基底中。這種石墨烯層可以被布置成使得將其位于穿孔的金屬箱的上部 上。在一些實(shí)施方案中，石墨烯層可以布置為位于支架柵格和穿孔的金屬箱之間。
[0099] 石墨烯層在支架中的提供可以使得石墨烯層可以起到進(jìn)一步降低積累的表面電 荷的作用。那種進(jìn)一步降低可能是作為石墨烯傳導(dǎo)性質(zhì)的結(jié)果產(chǎn)生的。根據(jù)其中結(jié)合石墨 烯的實(shí)施方案，石墨烯被布置成與金屬箱歐姆接觸。石墨烯還可以與支架歐姆接觸。石墨烯 層在支架中的提供可以使得其起到提高基底力學(xué)強(qiáng)度的作用。
[0100] 在其中將石墨烯層提供在金屬箱之上的支架布置中，該石墨烯層的提供可以使得 基本上均勻的涂層可以被布置成延伸穿過(guò)所述石墨烯層，所述涂層包含一種或多種用于分 析的樣品或樣本。這種布置可以允許控制包含一種或多種樣品的涂層的厚度。在這種布置 中，可以獨(dú)立于金屬箱的厚度而控制涂層(例如包含蛋白質(zhì)樣品的冰層)的厚度。
[0101]在其中將石墨烯層提供在金屬箱之下的支架布置中，石墨烯層可以被布置使得含 有一種或多種用于分析的樣品的基底可以被石墨烯支撐在金屬膜中的孔或小孔中。
[0102] 石墨烯層在根據(jù)一些實(shí)施方案的支架中的設(shè)置可以使得提高支架和/或用于分析 的樣品的力學(xué)穩(wěn)定性。
[0103] 此外，合適的石墨烯的選擇可以使得當(dāng)檢查生物學(xué)樣品時(shí)這種層的加入可以是有 用的，因?yàn)槠淇梢栽试S蛋白質(zhì)在支架上可控的沉積。
[0104] 生產(chǎn)方法
[0105] 要理解的是，可以使用多種生產(chǎn)方法構(gòu)建根據(jù)本文描述的多個(gè)方面和多個(gè)實(shí)施方 案的樣品支架。僅以舉例的方式，為了生產(chǎn)根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案的設(shè)備的一個(gè)實(shí)施方案，可以 使用在頂部具有懸浮的穿孔無(wú)定形碳層的金柵格作為模板。要理解的是，可以使用其他類(lèi) 型的模板，包括:花邊碳(lacey carbon)、納米孔聚碳酸酯和其他圖案化塑料。然后將金蒸 發(fā)到懸浮的模板上。隨后通過(guò)將裝置暴露到低能氧/氬等離子體而將模板移除?？梢哉{(diào)整等 離子體使得其與所有含碳材料有非常強(qiáng)烈的反應(yīng)但對(duì)金沒(méi)有影響。這種布置允許用于選擇 性移除基本上所有的模板層，留下直接附著到純金網(wǎng)柵格上的穿孔的純金箱。
[0106] 圖6示出測(cè)試實(shí)例電子顯微鏡支架中金粒子在透明性冰中的運(yùn)動(dòng)的一個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié) 果。通過(guò)成像金粒子可以看出，當(dāng)在根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案的超穩(wěn)定樣品支架上成像時(shí)，樣品運(yùn) 動(dòng)減少。圖6的左邊說(shuō)明，在通?；咨系谋械臉悠返湫偷倪\(yùn)動(dòng)軌跡(紅色曲線)對(duì)在我們 的超穩(wěn)定柵格上的冰中的樣品的典型的軌跡(黑色曲線）。圖6的右邊顯示，當(dāng)使用根據(jù)一個(gè) 實(shí)施方案的支架時(shí)所確定的五個(gè)獨(dú)立的樣品的軌跡?？梢钥闯?，運(yùn)動(dòng)比可以用于定位樣品 的精確度小，也就是說(shuō)，小于每個(gè)時(shí)間點(diǎn)一埃CAngstrom)。注意圖6右邊的刻度是以像素計(jì) 的位移。
[0107] 支架的實(shí)驗(yàn)使用
[0108] 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)放置在電子束中時(shí)，在根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案的超穩(wěn)定樣品支架上制備 的樣品和樣本顯示電荷減少。"蜂群效果"是低放大倍數(shù)下圖像粒度的波動(dòng)并且是表面充電 的結(jié)果。已經(jīng)將通常的支架的"蜂群效果"與當(dāng)使用根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案的超穩(wěn)定基底時(shí)經(jīng)歷 的效果相比較，并且發(fā)現(xiàn)該效果被大大降低，表明當(dāng)使用根據(jù)本文描述的多個(gè)方面和多個(gè) 實(shí)施方案的支架時(shí)，可能減少了樣品/樣本的充電。
[0109] 可以設(shè)計(jì)實(shí)施方案使得在成像期間電子顯微鏡的電子束照射金屬，所述金屬在容 納有樣品（在一些情況下，包封在透明性冰中）的多孔性孔的整個(gè)周邊的附近。這種布置可 以允許用于通過(guò)金屬箱均勻產(chǎn)生二次電子。那些二次電子可以將箱的小孔中的冰內(nèi)或冰的 表面上產(chǎn)生的正電荷中和。當(dāng)電子束布置成相對(duì)于孔偏心時(shí)，電子束不接觸小孔整個(gè)周邊 的金屬(例如金），并且可以觀察到所得圖像中的模糊。這種模糊可以表明來(lái)自金屬(例如金 箱）的二次電子在將由樣品經(jīng)歷的任何充電現(xiàn)象中和方面是重要的。<