含碳納米籠的還原刺激響應(yīng)藥物載體及制備方法和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種含碳納米籠的還原刺激響應(yīng)藥物載體及制備方法和應(yīng)用，以碳納米籠CNC為核心，由樹枝狀高分子包覆在CNC表面，在CNC之間、高分子之間、以及CNC與高分子之間均有二硫鍵連接，所述的樹枝狀高分子為低代數(shù)G0、G1、G2和/或G3的聚酰胺?胺樹枝狀高分子PAMAM，末端基團(tuán)為氨基的PAMAM?NH2或末端為羧基的PAMAM?COOH。本發(fā)明還提供了制備方法和作為藥物載體的應(yīng)用。本發(fā)明所提供的納米載體有很高的裝載能力，在還原劑如谷胱甘肽的刺激下能靈敏地釋藥，激光照射也能促進(jìn)藥物釋放。因腫瘤組織含高濃度的谷胱甘肽，本發(fā)明提供的載藥粒子在腫瘤靶向治療中有重要的藥用前景。
【專利說明】
含碳納米籠的還原刺激響應(yīng)藥物載體及制備方法和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種含碳納米籠的還原刺激響應(yīng)藥物載體及制備方法和應(yīng)用，尤其是一種以樹枝狀高分子包覆的碳納米籠(簡稱CNC)及制備方法和應(yīng)用，由二硫鍵將樹枝狀高分子和CNC相互交聯(lián)而成的納米復(fù)合粒子，及其制備方法，該納米復(fù)合粒子在載藥后具有刺激響應(yīng)性釋藥特別是還原刺激響應(yīng)性釋藥的特點(diǎn)，屬于生物材料領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]碳基納米材料如石墨烯、碳納米管、納米鉆石、富勒烯等在藥物輸送領(lǐng)域有重要的應(yīng)用前景，它們的共同特點(diǎn)是生物相容性好，載藥量高。為使藥物緩釋，往往希望藥物載體為三維立體多孔結(jié)構(gòu)或空心結(jié)構(gòu)。石墨烯和納米鉆石作為藥物載體，藥物只能吸附在載體表面;碳納米管是由石墨烯卷曲而成的中空管，但內(nèi)徑很小，一般不超過5 nm，藥物也主要結(jié)合在碳納米管外表面；富勒烯是籠狀的碳納米粒子，最常見的是由60個碳原子構(gòu)筑而成的空心足球狀粒子(即C6Q)，直徑僅為0.71 nm，藥物可吸附在粒子表面，而內(nèi)部空腔幾乎不能裝載藥物。
[0003]近年來，內(nèi)部空腔遠(yuǎn)比富勒烯大得多的CNC備受關(guān)注，這種CNC的殼層主要為石墨結(jié)構(gòu)，石墨殼層中富含孔隙，孔徑主要分布在2-50nm之間，內(nèi)部空腔直徑主要分布在10-100nm之間。這種CNC，不僅內(nèi)部空腔能裝載藥物，殼層的內(nèi)外表面亦能吸附藥物，而且由于殼層為多孔結(jié)構(gòu)，因此，CNC的比表面積比碳納米管大得多，是非常好的藥物載體。
[0004]當(dāng)前，CNC作為載體，主要用于對重金屬離子的吸附[David M.Burke , et al.Carbon nanocages as heavy metal 1n adsorbents.Desalinat1n 280 (2011) 87-94];對兒茶素、茶單酸、組氨酸、維生素E、內(nèi)分泌干擾物壬基酚的吸附[Katsuhiko Ariga，et al.0ne-Pot Separat1n of Tea Components through Selective Adsorpt1n onPore-Engineered Nanocarbon, Carbon Nanocage.J.AM.CHEM.SOC.2007，129，11022—11023; Ajayan Vinu, et al.Carbon nanocage: a large—pore cage-typemesoporous carbon material as an adsorbent for b1molecules.J Porous Mater(2006) 13: 379-383.]、對溶菌酶的吸附[Ajayan Vinuj et al.Large pore cage typemesoporous carbon, carbon nanocage: a super1r adsorbent for b1materials.J.Mater.Chem., 2005，15，5122-5127];以及對香煙煙霧中的酚類化合物(如苯二酚)和總顆粒物(如焦油和尼古丁)的吸附[Guangda Li，et al.General synthesis of carbonnanocages and their adsorpt1n of toxic compounds from cigarette smoke.Nanoscale, 2011，3，3251-3257.]。未見CNC作為載體對腫瘤化療藥物、光敏劑等藥物的吸附的報(bào)道。
[0005]作為輸送藥物的載體，希望其能將藥物靶向釋放到病灶(如腫瘤)，以減少藥物對正常組織的傷害。研究表明，刺激響應(yīng)性藥物載體可以選擇性地將藥物釋放到腫瘤部位，是近年來腫瘤靶向治療研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。根據(jù)刺激方式的不同，這類載體主要有還原刺激響應(yīng)性載體、熱敏感性載體、pH敏感性載體、超聲波刺激響應(yīng)性載體、電刺激響應(yīng)性載體等。由于腫瘤組織中具有較強(qiáng)還原性的谷胱甘肽濃度是正常組織的約500倍以上，細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽濃度是細(xì)胞外約1000倍以上，基于人體(或動物體)內(nèi)這種極顯著差異的生物環(huán)境，還原刺激響應(yīng)性載體能非常好地將其所攜載的藥物選擇性地釋放到腫瘤組織，其基本原理是:還原刺激響應(yīng)性載體一般由二硫鍵交聯(lián)而成，該載體在體內(nèi)輸送藥物的過程中，在正常組織中保持載體結(jié)構(gòu)的完整性，藥物很少釋放，一旦到達(dá)腫瘤組織尤其進(jìn)入腫瘤細(xì)胞時，高濃度的谷胱甘肽將使載體中的二硫鍵斷裂，載體破壞，從而促使載體釋放藥物。這類谷胱甘肽還原刺激響應(yīng)性的藥物載體，由于其在腫瘤組織中的釋藥靈敏性高，因而具有重要臨床應(yīng)用前景。
[0006]還原刺激響應(yīng)性載體基本由高分子構(gòu)成，尤其是兩親性高分子，它們在水相中能夠自組裝成納米粒子，可包埋脂溶性藥物，也可包埋水溶性藥物。然而，載體的載藥量較低。
[0007]例如:水溶性化療藥物阿霉素在由二硫鍵連接的聚乙二醇-聚己內(nèi)酯共聚物[poly(ethylene glycol)-b-poly(ε-caprolactone) (PEG-S-S-PCL)]形成的納米粒子內(nèi)的載藥量(藥物質(zhì)量與載體質(zhì)量的比)僅6.0% [Huanli Sun, et al.B1degradable micelleswith sheddable poly(ethylene glycol) shells for triggered intracellularrelease of doxorubicin.B1materials 30 (2009) 6358-6366];由二硫鍵連接的聚乙二醇-聚乳酸共聚物[poly(ethylene glycol )-b-poIy(lactic acid) (MPEG-S-S-PLA)]自組裝形成的納米粒子對脂溶性化療藥物紫杉醇的載藥量最高為9.07% [Na Song, et al.Preparat1n and in vitro properties of redox-responsive polymericnanoparticles for paclitaxel delivery.Colloids and Surfaces B: B1interfaces87 (2011) 454-463];再如:由二硫鍵連接的聚乙二醇-聚賴氨酸-聚己內(nèi)酯共聚物[poly(ethylene glycol)-b-poIy(lysine)-b-poly(caprolactone) bearing a disulfidebond (PEG-b-PLys-S-S-PCL)]自組裝形成的納米粒子，可同時包埋水溶性和脂溶性化療藥物，對水溶性阿霉素和脂溶性喜樹堿的載藥量分別是7.2%和4.4% [Thavasyappan Thambi，et al.B1reducible polymersomes for intracellular dual-drug delivery.J.Mater.Chem., 2012，22，22028-22036]。這些載藥粒子中的藥物與載體的質(zhì)量比均比較小。
[0008]此外，還原刺激響應(yīng)性的載體，在動物體內(nèi)刺激藥物釋放的方式主要是腫瘤組織及細(xì)胞內(nèi)的還原劑谷胱甘肽使載體中的二硫鍵斷裂，單一的刺激方式難以使藥物充分釋放。
[0009]而且，目前的還原刺激響應(yīng)性載體的作用主要是運(yùn)載藥物，自身沒有治療腫瘤的功能。而腫瘤治療需要功能強(qiáng)大的載藥粒子。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明目的在于:提供一種含碳納米籠的還原刺激響應(yīng)藥物載體，由二硫鍵相互交聯(lián)的樹枝狀高分子包覆的碳納米籠。
[0011 ]本發(fā)明的再一目的在于:提供所述樹枝狀高分子包覆的碳納米籠的制備方法。
[0012]本發(fā)明的又一目的在于:提供所述樹枝狀高分子包覆的碳納米籠的用途。
[0013]本發(fā)明所示的一種含碳納米籠的還原刺激響應(yīng)藥物載體，以碳納米籠(簡稱CNC)為核心，由樹枝狀高分子包覆在CNC籠表面，在CNC之間、高分子之間、以及CNC與高分子之間均有二硫鍵連接，所述的樹枝狀高分子為指低代數(shù)GO、G1、G2和/或G3的聚酰胺-胺樹枝狀高分子PAMAM，末端基團(tuán)為氨基的PAMAM-NH2或末端為羧基的PAMAM-COOH。
[0014]所述的CNC是指殼層具有石墨結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的空心多孔碳納米粒子，表面含有羧基，粒徑在20?10nm之間。
[0015]這種樹枝狀高分子包覆的CNC，制備過程在油包水型微乳中進(jìn)行，包括下述步驟: 步驟一，配制如下各微乳:
(1)配制CNC油包水型微乳，微乳的水相是去離子水分散的CNC，水相中CNC濃度在0.05?2 mg/mL之間；
(2)配制EDC油包水型微乳，或“EDC+NHS”的油包水型微乳，所述的EDC，全稱為1-(3-Dimethylaminopropyl )-3~e thy lcarbodi imide hydrochloride，也京尤是 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽;所述的NHS，全稱為N-Hydroxysuccinimide，也就是N-輕基琥珀酰亞胺。EDC微乳的水相是去離子水溶解的EDC，“EDC+NHS”微乳的水相是去離子水溶解的EDC與NHS的混合物，EDC與NHS的質(zhì)量比為1: (I?5)之間；
(3)配制PAMAM-NH2油包水型微乳，微乳的水相是去離子水溶解的PAMAM-NH2,水相中PAMAM-NH2濃度在0.25-100 mg/mL之間；
(4 )配制PAMAM-C00H油包水型微乳，微乳的水相是去離子水溶解的PAMAM-C00H，水相中PAMAM-C00H濃度在0.25-100 mg/mL之間；
(5)配制胱胺油包水型微乳，微乳的水相是去離子水溶解的胱胺，水相中胱胺濃度在2?500 yg/mL之間；
(6)配制二硫代二丙酸油包水型微乳，微乳的水相是去離子水溶解的二硫代二丙酸，水相中二硫代二丙酸濃度在0.01-10 mg/mL之間；
其中，所述的油包水型微乳，是由環(huán)己烷、Triton X-100、正己醇、水相溶液混合而成，在微乳體系中，Triton X-100與正己醇的體積比在(1:1)?(3:1)之間，環(huán)己烷與“TritonX-100 +正己醇”混合溶液的體積比在(3:1)?(3:2)之間。向環(huán)己烷、Triton X-100與正己醇三者的混合溶液所加入的水相體積的量保證混合體系不發(fā)生渾濁。
[0016]步驟二，進(jìn)行如下合成反應(yīng):
(I)當(dāng)采用PAMAM-NH2時，納米載體制備方法為:將CNC微乳與EDC的微乳或與“EDC+NHS”的微乳混合0.5-3h，然后加入胱胺微乳，混合0.5_5h之后，加入PAMAM-NH2微乳，混合0.5_3h，獲得含CNC和PAMAM-NH2的微乳；同時，將二硫代二丙酸微乳與EDC/NHS微乳混合0.5_3h，然后，將該二硫代二丙酸微乳與含CNC和PAMAM-NH2的微乳混合0.5_5h，最后離心，用乙醇沉淀和去離子水洗滌，即得PAMAM包覆CNC的納米復(fù)合粒子，該復(fù)合粒子中，CNC之間以二硫鍵相連、PAMAM之間以二硫鍵相連、CNC與PAMAM之間以酰胺鍵相連;反應(yīng)體系中，CNC與PAMAM的質(zhì)量比為1: (5-50)，
EDC的量是使CNC上的部分或全部羧基活化的量，EDC與CNC的質(zhì)量比最小為1:10000，胱胺與EDC質(zhì)量比為1: (2-10)，二硫代二丙酸與PAMAM-NH2的質(zhì)量比為1: (10?25)。
[0017](2)當(dāng)采用PAMAM-C00H時，納米載體制備方法為:將CNC微乳與PAMAM-C00H微乳混合，然后加入EDC/NHS微乳，混合0.5-3h ；再加入胱胺微乳，混合0.5_5h ；最后離心，用乙醇沉淀和去離子水洗滌，即得PAMAM包覆CNC的納米復(fù)合粒子，該復(fù)合粒子中，CNC之間、PAMAM之間以及CNC與PAMAM之間均以二硫鍵相連；反應(yīng)體系中，CNC與PAMAM的質(zhì)量比為1: (5-50)，EDC的量是使CNC上的部分或全部羧基活化的量，EDC與CNC的質(zhì)量比最小為1:10000，胱胺與EDC質(zhì)量比為1: (2-10)。
[0018]本發(fā)明提供一種用途，在所述的樹枝狀高分子包覆的CNC納米復(fù)合粒子中用物理吸附法裝載腫瘤化療藥物和/或光敏劑，制成載藥納米粒子，這種載藥納米粒子在還原劑和激光照射雙重刺激下響應(yīng)釋藥，可作為腫瘤靶向治療的材料。
[0019]將本發(fā)明構(gòu)建的載藥納米粒子可通過腫瘤組織中谷胱甘肽的還原作用和外加近紅外激光照射共同刺激而釋放藥物，近紅外激光照射還誘導(dǎo)載藥納米粒子中的CNC產(chǎn)生光熱轉(zhuǎn)化，通過溫?zé)嵝?yīng)協(xié)同藥物殺傷腫瘤細(xì)胞，抑制腫瘤生長，在腫瘤治療領(lǐng)域有重要應(yīng)用前景。
[0020]本發(fā)明提供一種全新的刺激響應(yīng)性藥物載體及其應(yīng)用方法。本發(fā)明的載體由CNC與樹枝狀高分子經(jīng)二硫鍵交聯(lián)而成，不僅具有高的載藥能力，而且可通過三種刺激方式釋藥，即由還原劑谷胱甘肽刺激載體釋藥；由激光照射使載體產(chǎn)生還原性電子，進(jìn)攻二硫鍵而使載體結(jié)構(gòu)破壞，進(jìn)而釋藥;激光照射誘導(dǎo)CNC載體產(chǎn)生光熱轉(zhuǎn)換，熱效應(yīng)促進(jìn)藥物釋放。此外，本發(fā)明的藥物載體，其自身在激光照射下可對腫瘤進(jìn)行光熱治療，兼具載體和治療雙重功能。
[0021]本發(fā)明與單純的樹枝狀高分子形成的納米粒子和單純的CNC相比，優(yōu)越性在于:本發(fā)明制備的由二硫鍵相互交聯(lián)的CNC與樹枝狀高分子構(gòu)建而成的納米復(fù)合粒子在載藥能力、藥物刺激響應(yīng)釋放方式、對腫瘤的治療能力這三方面具有顯著優(yōu)勢和很大進(jìn)步;本發(fā)明制得的所述納米復(fù)合粒子有更高的載藥能力，不僅能在還原劑(如谷胱甘肽)的刺激下響應(yīng)釋藥，還可以通過近紅外激光照射促進(jìn)藥物釋放，而且，近紅外激光還誘導(dǎo)納米復(fù)合粒子中的CNC產(chǎn)生光熱轉(zhuǎn)換，使納米復(fù)合粒子通過藥物治療和熱療的協(xié)同作用治療腫瘤。
【附圖說明】
[0022]附圖1:(CNC-S-S-CNC)-CO-NH-(PAMAM-S-S-PAMAM)納米復(fù)合粒子結(jié)構(gòu)示意圖；
附圖2: CNC透射電子顯微鏡圖；
附圖3:納米復(fù)合粒子(CNC-S-S-CNC) -CO-NH- (PAMAM-S-S-PAMAM)透射電子顯微鏡圖； 附圖4: (CNC-S-S-CNC)-S-S-(PAMAM-S-S-PAMAM)納米復(fù)合粒子結(jié)構(gòu)示意圖；
附圖5:裝載藥物的(CNC-S-S-CNC)-S-S-(PAMAM-S-S-PAMAM)在谷胱甘肽作用下釋放藥物示意圖；
附圖6:裝載藥物的(CNC-S-S-CNC)-S-S-(PAMAM-S-S-PAMAM)在谷胱甘肽作用之后經(jīng)過近紅外激光照射所導(dǎo)致的藥物釋放和載體的光熱轉(zhuǎn)化示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0023]實(shí)施例1
含碳納米籠的還原刺激響應(yīng)藥物載體及其制備方法:
微乳中合成“聚酰胺-胺樹枝狀高分子包覆的碳納米籠”(高分子為末端基團(tuán)為氨基的GO型PAMAM-NH2):
(I)具體合成方法
A.高溫?zé)岱纸夂铣商技{米籠(Carbon nanocage, CNC) 稱取Ig草酸亞鐵溶于10 mL無水乙醇中，溶液密封于不銹鋼反應(yīng)釜。將此反應(yīng)釜置于馬弗爐中于550° C加熱反應(yīng)，12h后停止加熱，在爐中自然冷卻至室溫。取出樣品，置于50 mL圓底燒瓶中，加入30 mL濃度為10 %的鹽酸，于70°C恒溫回流12 h。將反應(yīng)溶液離心，收集沉淀，用去離子水洗滌3次。向洗滌后的沉淀中加入30 mL硝酸，于70°C恒溫回流12 h。然后將該反應(yīng)液進(jìn)行離心，沉淀經(jīng)去離子水洗滌5次，洗滌后的沉淀進(jìn)行冷凍干燥，所得CNC富含羧基。
[0024]B.制備微乳
將環(huán)己燒、正己醇、Triton X-100按如下體積比混合:正己醇:Triton X_100=3:2，環(huán)己烷:(正己醇+Triton Χ_100)=3:1.67，也就是，將環(huán)己烷(72 mL)、Triton X-100 (24mL)、正己醇(16 mL)混合，得微乳前液，然后制備如下微乳:
?制備表面富含羧基的CNC的微乳:稱取CNC 10 mg，分散于10 mL去離子水中，超聲波處理10 min，取該CNC溶液I mL，并取微乳前液10 mL，二者混合，室溫振蕩2_3 min，即得CNC微乳；
?制備PAMAM-NH2微乳:稱取PAMAM-NH2 10 mg，溶于2 mL去離子水中，然后與20 mL微乳前液混合，室溫振蕩2-3 min，即得PAMAM-NH2微乳；
?制備EDC/NHS微乳:稱取10 mg的EDC和50 mg的NHS，共同溶于I mL去離子水中，然后與10 mL微乳前液混合，室溫振蕩2-3 min，即得EDC/NHS微乳；
?制備胱胺微乳:稱取胱胺1mg，溶于1mL去離子水中。稱取該混合液ImL，溶于5mL去離子水中，取0.1mL，與ImL “微乳母液”混合，室溫振蕩2_3min，即得胱胺微乳。
[0025]?制備二硫代二丙酸微乳:
稱取二硫代二丙酸1 m g，溶于1 m L水溶液中攪拌2 h。稱取該混合液I m L，然后于1 m L“微乳母液”混合，室溫振蕩2-3min，即得活化二硫代二丙酸微乳。
[0026]C.微乳中合成二硫鍵相互交聯(lián)的聚酰胺-胺樹枝狀高分子/CNC納米復(fù)合粒子，結(jié)構(gòu)式為(CNC-S-S-CNC) -CO-NH-(PAMAM-S-S-PAMAM):
在10 mL的CNC微乳中加入1.1yL的EDC/NHS微乳，搖床中室溫振蕩2 h;然后與I mL胱胺微乳混合，搖床中室溫振蕩反應(yīng)2 h，使CNC在微乳的納米水核中以二硫鍵相互交聯(lián)，即CNC-S-S-CNC;然后，向其中加入20 mL PAMAM-NH2微乳，室溫振蕩30 min，使PAMAM-NH2與CNC以酰胺鍵連接，即得(CNC-S-S-CNC) -C0-NH-PAMAM ；
同時，向10 mL二硫代二丙酸微乳中加入5 mL的EDC/NHS微乳，搖床中室溫振蕩I h;將該微乳加入到上述(CNC-S-S-CNC)-C0-NH-PAMAM微乳中，搖床中室溫振蕩2 h，使PAMAM之間以二硫鍵交聯(lián)的微乳反應(yīng)體系，獲得:
(CNC-S-S-CNC)-CO-NH-(PAMAM-S-S-PAMAM)；
將該微乳反應(yīng)體系進(jìn)行在5000轉(zhuǎn)/分鐘離心15 min，用乙醇沉淀，洗滌3次;然后再用去離子水洗滌3次，即得二硫鍵相互交聯(lián)的聚酰胺-胺樹枝狀高分子/CNC納米復(fù)合粒子，也就是:(CNC-S-S-CNC)-CO-NH-(PAMAM-S-S-PAMAM)，其結(jié)構(gòu)示意圖如附圖1。
[0027](2)透射電子顯微鏡(TEM)下分析微觀形貌
取少許(CNC-S-S-CNC)-CO-NH-(PAMAM-S-S-PAMAM)沉淀分散于去離子水中，將其滴于銅網(wǎng)上，于TEM(JSM-6360LV，JEOL, Japan)下觀察分析。
[0028](3)載藥精確稱取5-氟尿嘧啶(5-Fu，一種腫瘤化療藥物)5 mg，溶于I mL去離子水中，然后加入上述制備的(CNC-S-S-CNC)-⑶-NH-(PAMAM-S-S-PAMAM)約5 mg，于搖床中室溫振蕩2 h，然后離心，沉淀用去離子水誰洗滌I次，收集上清液和洗液，并保存沉淀。沉淀即為載藥粒子(CNC-S-S-CNC)-CO-NH-(PAMAM-S-S-PAMAM)-(5_Fu)。
[0029]同時，測定266nm波長處不同濃度的5-Fu的紫外吸收光譜，制備5-Fu的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得Y = 110.8 X - 0.001(1?2=0.999)。￥為5-Fu的濃度(mg/mL)，X是266nm波長處的吸光度。
[0030](4)藥物釋放實(shí)驗(yàn)
將上述制備的(CNC-S-S-CNC)-C0-NH-(PAMAM-S-S-PAMAM)-(5-Fu)沉淀分散于去離子水中，然后等分2份，分別裝入透析袋中，其中一個透析袋置于20 mL含20 mM的谷胱甘肽水溶液中，另一個透析袋置于20 !^含0.2 mM的谷胱甘肽水溶液中，均于搖床中振搖，于
0.5 h取透析外液，于266nm波長檢測所取樣品的吸光度，根據(jù)5-Fu的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算5-Fu濃度。
[0031]實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
透射電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，所獲得的CNC為空心納米球，空心球的粒徑為20-50 nm左右，如附圖2所示。
[0032]制備的分散于去離子水中的“聚酰胺-胺樹枝狀高分子包覆的碳納米籠(CNC-S-S-CNC)-CO-NH-(PAMAM-S-S-PAMAM)為直徑在150-350 nm左右的復(fù)合粒子，形貌與單純的CNC顯著不同，復(fù)合粒子中可見大量空心粒子，這些空心粒子即為CNC，如附圖3所示。
[0033](CNC-S-S-CNC)-⑶-NH-(PAMAM-S-S-PAMAM)對腫瘤化療藥物 5-Fu 的裝載能力很高，每100 mg的載體能負(fù)載72 mg的5-Fu。
[0034]在谷胱甘肽還原刺激下，(CNC-S-S-CNC)-CO-NH-(PAMAM-S-S-PAMAM)-(5-Fu)響應(yīng)釋藥非常敏感，載藥粒子透析30min時，含20 mM谷胱甘肽的透析外液使載藥粒子釋放71.0%的藥物，而含0.2 mM谷胱甘肽的透析外液僅使載藥粒子釋放12.0%的藥物，前者是后者的近6倍，顯示出還原刺激響應(yīng)釋藥的特點(diǎn)。
[0035]實(shí)施例2
微乳中合成“聚酰胺-胺樹枝狀高分子包覆的碳納米籠”(高分子為末端基團(tuán)為羧基的GO型PAMAM-COOH):
(I)具體合成方法 A.制備微乳
將環(huán)己燒(45 mL)、Triton X-100 (15 mL)、正己醇(15 mL)混合，它們的體積比約為:正己醇:Triton X-1OO=1:1，環(huán)己燒:(正己醇+Triton X_100)=3:2，該混合溶液稱為微乳前液，然后制備如下微乳:
?制備表面富含羧基的CNC的微乳:配制I mL濃度為2 mg/mL的CNC水分散液，超聲波處理10 min，將其與10 mL的微乳前液混合，室溫振蕩2_3 min，即得CNC微乳；
?制備PAMAM-⑶OH微乳:配制2 mL濃度為100 mg/mL的PAMAM-⑶OH水中，然后與20mL微乳前液混合，室溫振蕩2-3 min，即得PAMAM-C00H微乳；
?制備EDC/NHS微乳:稱取10 mg的EDC和50 mg的NHS，共同溶于10 mL去離子水中，取2 mL，將其與10 mL微乳前液混合，室溫振蕩2-3 min，即得EDC/NHS微乳；
?制備胱胺微乳:配制500 yg/mL的胱胺水溶液2 mL，與1mL微乳前液混合，室溫振蕩2-3min，即得胱胺微乳。
[0036]B.微乳中合成“二硫鍵相互交聯(lián)的聚酰胺-胺樹枝狀高分子/碳納米籠”納米復(fù)合粒子(CNC-S-S-CNC) -S-S- (PAMAM-S-S-PAMAM)
將CNC-COOH微乳與PAMAM-COOH微乳混合，室溫振蕩2_3min后，向該微乳中加入EDC/NHS微乳，搖床中室溫振蕩I h，然后向該混合微乳中加入胱胺微乳，搖床中室溫振蕩反應(yīng)5 ho然后通過離心(5000轉(zhuǎn)/分鐘，15 min)，使微乳中反應(yīng)物沉淀，乙醇洗滌該沉淀3次，去離子水洗滌3次，獲得的沉淀即為(CNC-S-S-CNC)-S-S-(PAMAM-S-S-PAMAM)，其結(jié)構(gòu)示意圖如附圖4所示。
[0037](2)TEM分析、裝載藥物5-Fu及谷胱甘肽刺激釋藥實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)方法與實(shí)施例1相同。
[0038]實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
所獲得的納米復(fù)合粒子(CNC-S-S-CNC)-S-S-(PAMAM-S-S-PAMAM)為 150_500nm 的粒子。粒子中隱約可見空心粒子，這些空心粒子即為CNC，其表面包覆PAMAM。
[0039]載藥納米復(fù)合粒子結(jié)構(gòu)對還原劑的刺激很敏感，在谷胱甘肽溶液中進(jìn)行透析發(fā)現(xiàn)，透析0.5h時，20 mM的谷胱甘肽使載藥粒子釋放5-Fu的量是0.2 mM谷胱甘肽釋藥量的約6.5倍。同樣表現(xiàn)出良好的還原刺激響應(yīng)釋藥特性。
[0040]實(shí)施例3
(I)具體合成方法 A.制備微乳
將環(huán)己燒(60 mL)、Triton X-100 (15 mL)、正己醇(5 mL)混合，它們的體積比約為:正己醇:Triton X-1OO=1: 3，環(huán)己燒:(正己醇+Triton X_100)=3:1，然后用該微乳前液制備以下微乳:
?制備表面富含羧基的CNC的微乳:配fim mL濃度為0.05 mg/mL的CNC水分散液，超聲波處理10 min，將其與10 mL的微乳前液者混合，室溫振蕩2_3 min，即得CNC微乳；
?制備PAMAM-C00H微乳:配制2 mL濃度為0.25 mg/mL的PAMAM-C00H水中，然后與20mL微乳前液混合，室溫振蕩2-3 min，即得PAMAM-C00H微乳；
?制備EDC/NHS微乳:稱取10 mg的EDC和10 mg的NHS，共同溶于10 mL去離子水中，取該溶液20 yL與10 mL微乳前液混合，室溫振蕩2-3 min，即得EDC/NHS微乳；
?制備胱胺微乳:配制2 yg/mL的胱胺水溶液，取其I mL，與1mL微乳前液混合，室溫振蕩2_3min，即得胱胺微乳。
[0041 ] B.微乳中合成“二硫鍵相互交聯(lián)的聚酰胺-胺樹枝狀高分子/碳納米籠”納米復(fù)合粒子(CNC-S-S-CNC) -S-S- (PAMAM-S-S-PAMAM)
按實(shí)施例2相同的方法將上述配制的微乳進(jìn)行混合，然后離心，應(yīng)用乙醇和去離子水洗滌，獲得的沉淀即為(CNC-S-S-CNC)-S-S-(PAMAM-S-S-PAMAM)。
[0042](3)TEM分析、裝載藥物5-Fu及谷胱甘肽刺激釋藥實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)方法與實(shí)施例1相同。
[0043]實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
所獲得的納米復(fù)合粒子(CNC-S-S-CNC) -S-S- (PAMAM-S-S-PAMAM)為 100_250nm 的接粒子，粒子較實(shí)施例1和實(shí)施例2的要小。被PAMAM包覆的CNC在電鏡下仍然可以觀察到。裝載藥物的能力和在谷胱甘肽刺激下釋藥的敏感性與實(shí)施例1相似，如透析0.5 h時，外液是20 mM的谷胱甘肽時，載藥粒子的釋藥量約70%，而外液是0.2 mM谷胱甘肽時，透析0.5 h時的釋藥量約20%。
[0044]實(shí)施例4
(I)同時裝載化療藥物和光敏劑藥物:
按實(shí)施例2相同的方法制備(CNC-S-S-CNC)-S-S-(PAMAM-S-S-PAMAM)，將其分散于I mL去離子水中，其中CNC的濃度為4 mg/mL。同時，將順鉑溶解于含1%二甲基亞砜的水溶液(ImL)，順鉑濃度為4mg/mL，另配制I mL濃度為4 mg/mL的葉綠素銅鈉水溶液。將上述三種溶液混合，在搖床中室溫下避光振蕩24 h。離心，沉淀用去離子水洗滌2次，然后再分散于2 mL去離子水中，避光保存。
[0045](2)谷胱甘肽還原刺激響應(yīng)釋藥:
取上述載藥納米粒子混懸液0.2 mL，加入0.2 mL的谷胱甘肽水溶液(I mg/mL)，搖床中室溫避光振蕩20 min，離心，收集上清液。作為對照，向另一份0.2 mL的載藥納米粒子混懸液中加入0.2 mL去離子水，同樣進(jìn)行避光振蕩20 min，然后離心，收集上清液。
[0046](3 )低功率密度的671 -nm激光照射下的藥物釋放:
將0.2 mL的載藥粒子置于無色透明小玻璃瓶中，玻璃瓶內(nèi)徑約6 mm，以671-nm激光(功率密度:0.2W/cm2)從玻璃瓶側(cè)面對樣品進(jìn)行照射20 min。然后對樣品進(jìn)行離心，收集上清液。對照實(shí)驗(yàn)中，將0.2 mL的載藥粒子避光靜置20 min，然后離心，收集上清液。
[0047](4)谷胱甘肽和671-nm激光共同刺激藥物釋放:
將0.2 mL的載藥粒子與0.2 mL的谷胱甘肽水溶液(I mg/mL)混合振蕩20 min，然后將樣品移入與上述相同的小玻璃瓶中，以671-nm激光照射20 min，然后離心，收集上清液。對照實(shí)驗(yàn)中，將0.2 mL的載藥粒子與0.2 mL去離子水混合40 min，然后離心，收集上清液。
[0048]因?yàn)橐粋€順鉑分子含有I金屬鉑(Pt)原子，一個葉綠素銅鈉分子含有I個銅(Cu)原子，因此，采用電感耦合等離子發(fā)射光譜儀(ICP-AES)檢測各上清液中Pt和Cu的濃度，即可獲得藥物釋放的量。
[0049]實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
藥物釋放方式與效果示意圖如附圖5和附圖6所示。附圖5是裝載藥物的納米復(fù)合粒子(CNC-S-S-CNC) -S-S- (PAMAM-S-S-PAMAM)在谷胱甘肽作用下釋放藥物示意圖，附圖6是裝載藥物的納米復(fù)合粒子(CNC-S-S-CNC) -S-S- (PAMAM-S-S-PAMAM)在谷胱甘肽作用之后經(jīng)過近紅外激光照射所導(dǎo)致的藥物釋放和載體的光熱轉(zhuǎn)化示意圖。
[0050]谷胱甘肽能顯著提升載藥納米粒子的藥物釋放速率，在與谷胱甘肽混合20min后，通過離心，發(fā)現(xiàn)載藥粒子的上清溶液為綠色，而對照組中(即與去離子水混合20 min)，樣品的上清液接近無色，表明包埋在(CNC-S-S-CNC) -CO-NH- (PAMAM-S-S-PAMAM)納米粒子中的葉綠素銅鈉在谷胱甘肽作用下快速釋放。
[0051 ] ICP-AES檢測結(jié)果顯示，加入谷胱甘肽的載藥粒子的上清液中，Pt和Cu的含量分別是對照組的約5.0倍和4.5倍。
[0052 ] 671 -nm激光照射亦能明顯促進(jìn)藥物釋放，經(jīng)6 71 _nm激光照射20 mi η的載藥納米粒子在離心后，其上清液為淺綠色，而未照射樣品的上清液接近無色。
[0053]谷胱甘肽作用20min，再經(jīng)過671-nm激光照射20min的載藥納米粒子樣品，在經(jīng)過離心后，其上清液中Pt和Cu的含量比單獨(dú)以谷胱甘肽還原刺激或激光照射刺激的樣品上清液中的含量要高，分別是對照組(無谷胱甘肽、無激光照射)的6.0和5.4倍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種含碳納米籠的還原刺激響應(yīng)藥物載體，以碳納米籠CNC為核心，其特征在于，由樹枝狀高分子包覆在CNC表面，在CNC之間、高分子之間、以及CNC與高分子之間均有二硫鍵連接，所述的樹枝狀高分子為低代數(shù)GO、G1、G2和/或G3的聚酰胺-胺樹枝狀高分子PAMAM，末端基團(tuán)為氨基的PAMAM-NH2或末端為羧基的PAMAM-COOH。2.如權(quán)利要求1所述的含碳納米籠的還原刺激響應(yīng)藥物載體，，其特征在于，所述的CNC是指殼層具有石墨結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的空心多孔碳納米粒子，表面含有羧基，粒徑在20?10nm之間。3.如權(quán)利要求1或2所述的含碳納米籠的還原刺激響應(yīng)藥物載體的制備方法，其特征在于:制備過程在油包水型微乳中進(jìn)行，包括下述步驟: 步驟一，配制如下各微乳: (I)配制CNC油包水型微乳，微乳的水相是去離子水分散的CNC，水相中CNC濃度在0.05?2 mg/mL之間； (2 )配制EDC油包水型微乳，或“EDC+NHS”的油包水型微乳，所述的EDC的全稱為1- (3-Dimethylaminopropyl )-3~ethylcarbodiimide hydrochloride，也京尤是 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽，EDC微乳的水相是去離子水溶解的EDC;所述的NHS的全稱為N-Hydroxysuccinimide，也就是N-輕基琥泊酰亞胺；EDC+NHS微乳的水相是去離子水溶解的EDC與NHS的混合物，EDC與NHS的質(zhì)量比為1: (I?5)之間； (3 )配制PAMAM-NH2油包水型微乳，微乳的水相是去離子水溶解的PAMAM-NH2，水相中PAMAM-NH2濃度在0.25-100 mg/mL之間； (4)配制PAMAM-C00H油包水型微乳，微乳的水相是去離子水溶解的PAMAM-C00H，水相中PAMAM-C00H濃度在0.25-100 mg/mL之間； (5)配制胱胺油包水型微乳，微乳的水相是去離子水溶解的胱胺，水相中胱胺濃度在2?500 yg/mL之間； (6)配制二硫代二丙酸油包水型微乳，微乳的水相是去離子水溶解的二硫代二丙酸，水相中二硫代二丙酸濃度在0.01-10 mg/mL之間； 其中，所述的油包水型微乳，是由環(huán)己烷、Triton X-100、正己醇、水相溶液混合而成，在微乳體系中，正己醇與Triton X-100的體積比在1: (1-3)之間，環(huán)己燒與“Triton X-100+正己醇”混合溶液的體積比在(3:1)?(3:2)之間。向環(huán)己烷、Triton X-100與正己醇三者的混合溶液所加入的水相體積的量保證混合體系不發(fā)生渾濁； 步驟二，進(jìn)行如下合成反應(yīng): (I)當(dāng)采用PAMAM-NH2時，納米載體制備方法為:將CNC微乳與EDC的微乳或與“EDC+NHS”的微乳混合0.5-3h，然后加入胱胺微乳，混合0.5_5h之后，加入PAMAM-NH2微乳，混合0.5_3h，獲得含CNC和PAMAM-NH2的微乳；同時，將二硫代二丙酸微乳與EDC/NHS微乳混合0.5_3h，然后，將該二硫代二丙酸微乳與含CNC和PAMAM-NH2的微乳混合0.5_5h，最后離心，用乙醇沉淀和去離子水洗滌，即得PAMAM包覆CNC的納米復(fù)合粒子，該復(fù)合粒子中，CNC之間以二硫鍵相連、PAMAM之間以二硫鍵相連、CNC與PAMAM之間以酰胺鍵相連;反應(yīng)體系中，CNC與PAMAM的質(zhì)量比為1: (5-50)， EDC的量是使CNC上的部分或全部羧基活化的量，EDC與CNC的質(zhì)量比最小為1:10000，胱胺與EDC質(zhì)量比為1: (2-10)，二硫代二丙酸與PAMAM-NH2的質(zhì)量比為1: (10?25)； (2)當(dāng)采用PAMAM-COOH時，納米載體制備方法為:將CNC微乳與PAMAM-C00H微乳混合，然后加入EDC/NHS微乳，混合0.5-3h;再加入胱胺微乳，混合0.5_5h;最后離心，用乙醇沉淀和去離子水洗滌，即得PAMAM包覆CNC的納米復(fù)合粒子，該復(fù)合粒子中，CNC之間、PAMAM之間以及CNC與PAMAM之間均以二硫鍵相連；反應(yīng)體系中，CNC與PAMAM的質(zhì)量比為1: (5_50)，EDC的量是使CNC上的部分或全部羧基活化的量，EDC與CNC的質(zhì)量比最小為1:10000，胱胺與EDC質(zhì)量比為1:(2-10)。4.如權(quán)利要求1或2所述的含碳納米籠的還原刺激響應(yīng)藥物載體的用途，其特征在于:在所述的樹枝狀高分子包覆的CNC納米復(fù)合粒子中，用物理吸附法裝載腫瘤化療藥物和/或光敏劑，制成載藥納米粒子，在還原劑和激光刺激下響應(yīng)釋藥，作為腫瘤革E向治療的材料。5.如權(quán)利要求1或2所述的含碳納米籠的還原刺激響應(yīng)藥物載體的用途，其特征在于:所述的載藥納米粒子通過腫瘤組織中谷胱甘肽的還原作用和外加近紅外激光照射共同刺激而釋放藥物，近紅外激光照射還誘導(dǎo)載藥納米粒子中的CNC產(chǎn)生光熱轉(zhuǎn)化，對腫瘤產(chǎn)生熱療，作為腫瘤靶向治療的材料。
【文檔編號】A61K47/04GK106074451SQ201610520370
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年7月5日
【發(fā)明人】儲茂泉, 韓春哲
【申請人】同濟(jì)大學(xué)