專利名稱:具有增加的組氨酸含量的動(dòng)物飼料組合物的制作方法
相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用本申請(qǐng)要求2004年5月28日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)60/575,628以及2004年6月4日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)60/577,363的優(yōu)先權(quán)，這些文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容引入本文作為參考。
發(fā)明背景所有動(dòng)物均需要氨基酸(AA)，其是最佳生長(zhǎng)、繁殖、哺乳和維持生活所需的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)單元。牛小腸吸收的氨基酸來(lái)源于微生物蛋白質(zhì)和在其瘤胃中未降解的膳食蛋白質(zhì)。小腸內(nèi)消化的蛋白質(zhì)必須補(bǔ)充10種不能由牛產(chǎn)生的必需氨基酸(EAA)，其包括精氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、色氨酸和纈氨酸。理想地，所吸收的各EAA的相對(duì)比例將與牛的需要量精確地匹配，因?yàn)槿狈σ环N就可能限制其它氨基酸的利用。
反芻動(dòng)物(牛、羊)具有復(fù)雜的蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)，因?yàn)樗鼈冇羞M(jìn)行消化的前胃。在前兩個(gè)室瘤胃和網(wǎng)胃中，共生細(xì)菌和原生動(dòng)物群體使飼料發(fā)酵，并利用非蛋白氮源如氨或尿素生長(zhǎng)。這些細(xì)菌可消化植物纖維，使牛能夠從這些飼料中獲得能量。它們還由廉價(jià)的副產(chǎn)物合成蛋白質(zhì)。微生物蛋白質(zhì)產(chǎn)量直接與微生物生長(zhǎng)有關(guān)，其主要由碳水化合物例如淀粉、中性洗滌纖維(NDF)、糖以及殘余非纖維碳水化合物(例如果膠和β-葡聚糖)存在決定。微生物群體不斷地從瘤胃中沖洗出進(jìn)入真胃(即皺胃)中，在該處被消化以給牛補(bǔ)充氨基酸。
除從微生物產(chǎn)生的蛋白質(zhì)獲得氨基酸以外，反芻動(dòng)物還從經(jīng)由瘤胃到皺胃未降解的必需氨基酸(UEAA)獲得氨基酸。哺乳反芻動(dòng)物在乳汁中分泌比在牛膳食消耗以及小腸中出現(xiàn)的更多的特定氨基酸(例如組氨酸)。這些缺乏的氨基酸稱作限制氨基酸。給動(dòng)物補(bǔ)充限制氨基酸可提高產(chǎn)奶量和奶組分組成。可以以UEAA形式提供限制氨基酸。

發(fā)明內(nèi)容本文提供了通常引起奶牛及其它反芻動(dòng)物產(chǎn)奶量增加的組合物和方法。喂養(yǎng)反芻動(dòng)物以獲得最佳畜產(chǎn)品產(chǎn)量包括了解氨基酸、脂肪酸和碳水化合物營(yíng)養(yǎng)。本文提供了提高所述反芻動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)，特別是氨基酸營(yíng)養(yǎng)的組合物和方法。本文還提供通過(guò)給反芻動(dòng)物喂食具有增加含量的一種或多種限制氨基酸的飼料，來(lái)減少氨基酸限制并提高哺乳反芻動(dòng)物產(chǎn)奶量和奶組分組成的方法。
通過(guò)給奶牛喂食特定的遞送平衡改善的十種必需氨基酸的飼料組合物，可增加牛的產(chǎn)奶量。特別地，所述飼料組合物可具有增加含量的一種或多種限制氨基酸，該含量由牛用于維持生活、生長(zhǎng)和產(chǎn)奶量的氨基酸需要量所確定。限制氨基酸可包括組氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸和/或蘇氨酸。所述飼料組合物可配制成遞送平衡改善的過(guò)瘤胃必需氨基酸。
所述飼料組合物一般包含至少一種具有增加的組氨酸含量的成分，且該成分一般來(lái)源于非動(dòng)物源(例如細(xì)菌、酵母和/或植物)。例如，所述組合物可包含組氨酸源，所述組氨酸源包含L-組氨酸和產(chǎn)組氨酸微生物發(fā)酵中形成的生物質(zhì)。在另一實(shí)施例中，所述飼料組合物包含組氨酸源，所述組氨酸源可包含L-組氨酸和產(chǎn)組氨酸微生物發(fā)酵中形成的溶解和懸浮成分。在其它實(shí)施方案中，所述飼料組合物可具有粗蛋白質(zhì)部分，所述粗蛋白質(zhì)部分包含至少一種非動(dòng)物源的富含組氨酸的蛋白質(zhì)(即由細(xì)菌、酵母和/或植物生產(chǎn)的富含動(dòng)物或非動(dòng)物組氨酸的蛋白質(zhì))。另外，所述飼料組合物可包含由重組細(xì)菌、酵母和/或植物(例如通過(guò)重組細(xì)菌發(fā)酵)產(chǎn)生的富含動(dòng)物或非動(dòng)物組氨酸的蛋白質(zhì)。例如，可對(duì)細(xì)菌、酵母和/或植物進(jìn)行工程化來(lái)生產(chǎn)存在于血粉中的富含組氨酸的蛋白質(zhì)(例如血紅素α鏈)。所有所述飼料組合物通常包含至少一種附加營(yíng)養(yǎng)組分。
所述飼料組合物可包含至少約1g/kg的所述組氨酸源。在一些實(shí)施方案中，所述飼料組合物包含至少約2g/kg的所述組氨酸源。所述飼料組合物可包含高達(dá)約10g/kg的所述組氨酸源。
如本文所述，L-組氨酸包括作為游離氨基酸的組氨酸和組氨酸鹽(例如組氨酸(HCl))。當(dāng)本文提及L-組氨酸的量時(shí)，所述量是指以基于游離氨基酸計(jì)的組氨酸。
所述飼料組合物可包含產(chǎn)組氨酸微生物發(fā)酵中形成的發(fā)酵成分。如本文所述，“發(fā)酵成分”可包含來(lái)自發(fā)酵液的任何適合的成分。例如，發(fā)酵成分可包含來(lái)自發(fā)酵液的溶解和/或懸浮成分。所述懸浮成分可包含(例如在溶液中一種或多種組分過(guò)飽和的情況下)未溶解的可溶成分和/或所述發(fā)酵液中存在的不可溶物質(zhì)。所述發(fā)酵成分還可包含至少部分發(fā)酵中形成的生物質(zhì)。所述發(fā)酵成分可包含發(fā)酵結(jié)束時(shí)存在的基本所有干固體(例如通過(guò)噴霧干燥發(fā)酵液和由發(fā)酵生產(chǎn)的生物質(zhì))或者可包含其一部分。例如，可將產(chǎn)組氨酸微生物發(fā)酵得到的粗發(fā)酵產(chǎn)物分級(jí)分餾和/或部分純化以增加除組氨酸之外可能還含有發(fā)酵成分的物質(zhì)中的組氨酸含量。
所述飼料組合物可包含組氨酸含量至少約2.8重量％的粗蛋白質(zhì)部分。在合適的實(shí)施方案中，所述粗蛋白質(zhì)部分的組氨酸含量可為至少約3％，至少約5％，至少約10％，至少約15％，在合適的實(shí)施方案中至少約20％。通常，所述飼料組合物可包含組氨酸含量高達(dá)約7.0重量％的粗蛋白質(zhì)部分。更通常地，所述飼料組合物可包含組氨酸含量為約2.8-5.0重量％，更通常為3.0-4.0重量％的粗蛋白質(zhì)部分。
基于游離氨基酸計(jì)，所述飼料組合物可包含組氨酸含量為至少約300克/kg干固體的組氨酸源。在合適的實(shí)施方案中，基于游離氨基酸計(jì)，所述組氨酸源的組氨酸含量為至少約400克/kg干固體，至少約500克/kg干固體，至少約600克/kg干固體，至少約700克/kg干固體和/或至少約800克/kg干固體。
所述飼料組合物可包含瘤胃保護(hù)的組氨酸源，所述瘤胃保護(hù)的組氨酸源可包含瘤胃保護(hù)的L-組氨酸和/或非動(dòng)物源的富含瘤胃保護(hù)的組氨酸的蛋白質(zhì)。可通過(guò)將L-組氨酸和/或富含組氨酸的蛋白質(zhì)與至少一種還原碳水化合物(例如還原糖)反應(yīng)來(lái)對(duì)所述L-組氨酸和/或所述富含組氨酸的蛋白質(zhì)進(jìn)行瘤胃保護(hù)。適合的還原碳水化合物可包括木糖、乳糖和/或葡萄糖。可通過(guò)將L-組氨酸和/或所述富含組氨酸的蛋白質(zhì)用至少一種脂肪酸包衣來(lái)對(duì)所述L-組氨酸和/或所述富含組氨酸的蛋白質(zhì)進(jìn)行瘤胃保護(hù)。適合的脂肪酸可包括至少部分氫化的植物油，例如大豆油。
所述瘤胃保護(hù)的組氨酸源可能能夠過(guò)瘤胃地遞送至少約40％的瘤胃保護(hù)的組氨酸。更通常地，所述瘤胃保護(hù)的組氨酸源可能能夠過(guò)瘤胃地遞送至少約50％、60％、70％、80％或90％的瘤胃保護(hù)的組氨酸。
可以采用包括但不限于全料形式、濃縮物形式、摻合形式和基礎(chǔ)混合形式的幾種形式來(lái)使用所述組合物。美國(guó)專利5,145,695和美國(guó)專利5,219,596描述了通過(guò)經(jīng)組合物的特定全料、濃縮物、摻合或基礎(chǔ)混合形式來(lái)平衡必需氨基酸以增加奶牛產(chǎn)奶量的飼料形式，這些文獻(xiàn)公開(kāi)的內(nèi)容全部引入本文作為參考。
如果所述組合物為全料形式，蛋白水平百分比(粗蛋白含量)可為約10至約25％，更合適地為約14至約24％(或約14至約19％)；然而，如果所述組合物為濃縮物形式，所述蛋白水平可為約30至約50％，更合適地為約32至約48％。如果所述組合物為摻合形式，所述組合物中的蛋白水平可為約20至約30％，更合適地約24至約26％；如果所述組合物為基礎(chǔ)混合形式，所述組合物的蛋白水平可為約55至約65％。除非本文另作說(shuō)明，百分比表示以重量百分比計(jì)。
所述全料形式組合物可包含粗小麥粉、玉米、大豆粉、玉米面筋粉、酒糟或酒糟殘液、鹽、常量礦物質(zhì)、痕量礦物質(zhì)和/或維生素。其它成分一般可包括但并不限于葵籽餅粉、芥花粉(canola meal)、棉籽粉、全棉籽、啤酒糟、亞麻籽餅粉、麥芽根和大豆皮。
所述濃縮物形式組合物通常包含粗小麥粉、玉米、大豆粉、玉米面筋粉、酒糟或酒糟殘液、鹽、常量礦物質(zhì)、痕量礦物質(zhì)和維生素?？蛇x的成分一般包括但并不限于葵籽餅粉、芥花粉、棉籽粉、全棉籽、啤酒糟、亞麻籽餅粉和麥芽根。所述摻合形式組合物通常包括粗小麥粉、玉米面筋粉、酒糟或溶性酒糟、鹽、常量礦物質(zhì)、痕量礦物質(zhì)和/或維生素。可選的成分一般包括但并不限于玉米、大豆粉、葵籽餅粉、棉籽粉、全棉籽、啤酒糟、亞麻籽餅粉、麥芽根和大豆皮。
所述基礎(chǔ)形式組合物通常包括粗小麥粉、玉米面筋粉和/或酒糟或酒糟殘液。其它成分一般包括但并不限于大豆粉、葵籽餅粉、棉籽粉、全棉籽、啤酒糟、亞麻籽餅粉、麥芽根、常量礦物質(zhì)、痕跡礦物質(zhì)和/或維生素。
所述全料形式組合物、濃縮物形式組合物、摻合形式組合物和基礎(chǔ)形式組合物還可包含對(duì)一種或多種所選的氨基酸具有增加的氨基酸含量的產(chǎn)品。特別地，所述產(chǎn)品對(duì)一種或多種產(chǎn)奶限制氨基酸具有增加的氨基酸含量。由于產(chǎn)品中游離氨基酸存在和/或產(chǎn)品中含有所述氨基酸的蛋白質(zhì)或肽存在，所述產(chǎn)品可具有增加的氨基酸含量。例如，所述產(chǎn)品可具有增加含量的作為游離氨基酸存在的組氨酸和/或存在于富含組氨酸的蛋白質(zhì)中的組氨酸。一般地，所述產(chǎn)品來(lái)自非動(dòng)物來(lái)源，例如微生物(如細(xì)菌和酵母)和/或植物。所述產(chǎn)品可包含非動(dòng)物和/或動(dòng)物蛋白質(zhì)(例如重組細(xì)菌、酵母和/或植物生產(chǎn)的富含組氨酸的動(dòng)物蛋白質(zhì))。
所述產(chǎn)品可具有增加含量的一種或多種氨基酸，特別是一種或多種確定為限制產(chǎn)奶量的必需氨基酸。限制氨基酸可包括組氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和/或色氨酸，其可以作為游離氨基酸或作為富含所選氨基酸的蛋白質(zhì)或肽存在于所述產(chǎn)品中。例如，所述產(chǎn)品可包含至少一種富含組氨酸的蛋白質(zhì)。如本文所定義，富含組氨酸的蛋白質(zhì)一般將具有至少約5％組氨酸殘基/蛋白質(zhì)的總氨基酸殘基，更一般地至少約10％組氨酸殘基/蛋白質(zhì)的總氨基酸殘基。在合適的實(shí)施方案中，富含組氨酸的蛋白質(zhì)可具有至少約15％組氨酸殘基和/或至少約20％組氨酸殘基/蛋白質(zhì)的氨基酸殘基總量。
相對(duì)于產(chǎn)品中的總氨基酸含量的重量(由產(chǎn)品中的粗蛋白含量確定)，具有增加含量的組氨酸的產(chǎn)品的組氨酸含量(包括游離組氨酸和存在于蛋白質(zhì)或肽中的組氨酸)一般為至少約2.8重量％，更一般地為至少約3.0重量％，4.0重量％，在合適的實(shí)施方案中，相對(duì)于產(chǎn)品中的總氨基酸含量，重量為5.0重量％。
可以以微生物發(fā)酵方法生產(chǎn)具有增加含量的組氨酸的產(chǎn)品。在一個(gè)實(shí)施例中，將過(guò)量產(chǎn)組氨酸的細(xì)菌或酵母在發(fā)酵系統(tǒng)中培養(yǎng)，并進(jìn)一步加工發(fā)酵液和/或發(fā)酵生物質(zhì)以生產(chǎn)具有增加含量的組氨酸的產(chǎn)品?？蓪l(fā)酵液和/或生物質(zhì)干燥(例如噴霧干燥)，以生產(chǎn)具有增加含量的組氨酸的產(chǎn)品。
組氨酸或具有增加含量的組氨酸的產(chǎn)品可從發(fā)酵液或溶解生物質(zhì)中至少部分被純化。例如，可根據(jù)組氨酸的等電點(diǎn)分離組氨酸或富含組氨酸的蛋白質(zhì)，和/或可根據(jù)所述分子中存在的咪唑基團(tuán)分離組氨酸。類似地，可根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，用富含組氨酸的蛋白質(zhì)中組氨酸的存在來(lái)分離所述蛋白質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，可使用重組技術(shù)改變富含組氨酸的蛋白質(zhì)所期望的等電點(diǎn)，從而改變所述蛋白質(zhì)的氨基酸組成(例如產(chǎn)生具有所選的組氨酸含量和期望的等電點(diǎn)的蛋白質(zhì))。
與其它氨基酸相比組氨酸的獨(dú)特等電點(diǎn)(pI)可使得組氨酸選擇性沉淀，優(yōu)先萃取入有機(jī)溶劑中，或與各種離子交換樹(shù)脂或金屬螯合基質(zhì)結(jié)合。例如，組氨酸的獨(dú)特pI可導(dǎo)致富含組氨酸的蛋白質(zhì)的特定且獨(dú)特的pI值，由此使得隨后用于飼料或食品中的這些蛋白質(zhì)從其它細(xì)胞蛋白質(zhì)中選擇性沉淀。
富含組氨酸的蛋白質(zhì)可顯示出可促進(jìn)所述蛋白質(zhì)分離的獨(dú)特結(jié)合性能。例如，一段六(6)個(gè)組氨酸殘基序列稱作組氨酸標(biāo)記，其與過(guò)渡金屬例如鎳(Ni)結(jié)合，可用于促進(jìn)蛋白質(zhì)分離(例如將組氨酸標(biāo)記的蛋白質(zhì)與含鎳基質(zhì)結(jié)合)。除鎳之外，可使用其它的過(guò)渡金屬，比如銅(Cu)。
組氨酸的咪唑基團(tuán)也可促進(jìn)組氨酸和/或富含組氨酸的蛋白質(zhì)的分離。例如，咪唑基團(tuán)可允許使用尺寸排阻色譜和離子交換樹(shù)脂的獨(dú)特組合來(lái)從包含其它氨基酸和副產(chǎn)物的發(fā)酵液中分離組氨酸。
富含組氨酸的蛋白質(zhì)可選自文獻(xiàn)所述的富含組氨酸的蛋白質(zhì)，例如來(lái)自惡性瘧原蟲(chóng)(Plasmodium falciparum)的富含組氨酸蛋白II和/或一種或多種來(lái)自稱作“histatin”的一類蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)，其表現(xiàn)出抗細(xì)菌和抗真菌活性。富含組氨酸的蛋白質(zhì)還可包含與全長(zhǎng)天然蛋白質(zhì)相比具有增加的組氨酸含量的已知富含組氨酸的蛋白質(zhì)的特定片段。例如，來(lái)自惡性瘧原蟲(chóng)的富含組氨酸蛋白II的組氨酸組成為約32％。然而，該蛋白質(zhì)的氨基酸61至130片段的組氨酸組成為約44％，該蛋白質(zhì)的氨基酸58至80片段的組氨酸組成為約55％。富含組氨酸的蛋白質(zhì)無(wú)需保持其原來(lái)的功能來(lái)適應(yīng)本文所述的組合物或方法。
富含組氨酸的蛋白質(zhì)可以是重組工程化蛋白質(zhì)。例如，如上所述，因?yàn)榫劢M氨酸基序與過(guò)渡金屬例如鎳結(jié)合，一般將稱作“組氨酸標(biāo)記”的聚組氨酸基序加入蛋白質(zhì)中以助于純化。然而，所述重組工程化蛋白質(zhì)除組氨酸外還具有增加含量的其它氨基酸。特別地，所述蛋白質(zhì)可具有增加含量的一種或多種必需氨基酸，或所述蛋白質(zhì)可具有增加含量的一種或多種其它產(chǎn)奶限制氨基酸，所述限制氨基酸可包括賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和色氨酸。因而，可將所述重組工程化蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)成包含所選氨基酸譜(profile)。除產(chǎn)奶限制氨基酸外，還可將所述蛋白質(zhì)工程化成包含半胱氨酸殘基，以使得形成分子內(nèi)和/或分子間二硫鍵。所述重組工程化蛋白質(zhì)中的氨基酸比例可改變或設(shè)計(jì)以與基于奶牛飼料研究或預(yù)測(cè)所預(yù)期的最佳比例相匹配。在一個(gè)實(shí)施方案中，例如在重組生產(chǎn)的蛋白質(zhì)中所選氨基酸譜與血粉譜相似。當(dāng)已經(jīng)設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)且其基因已經(jīng)克隆入表達(dá)載體中后，所述蛋白質(zhì)可用微生物宿主(例如大腸桿菌(E.coli.)、棒狀桿菌(Corynebacterium)、短桿菌(Brevibacterium)、芽孢桿菌(Bacillus)、酵母)和植物等在重組系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)(或過(guò)表達(dá))。
為優(yōu)化蛋白質(zhì)在宿主中的表達(dá)，可將編碼所述蛋白質(zhì)的基因設(shè)計(jì)成利用在宿主中占優(yōu)勢(shì)的特定tRNA?；蛘?，所選的tRNA可在宿主中共表達(dá)以促進(jìn)所述蛋白質(zhì)的表達(dá)。
所述重組工程化蛋白質(zhì)可包含特定序列以促進(jìn)蛋白質(zhì)純化。例如，所述蛋白質(zhì)可包含組氨酸標(biāo)記。所述蛋白質(zhì)還可包含“前導(dǎo)序列”，其將所述蛋白質(zhì)靶定到宿主細(xì)胞中的特定位置例如胞外質(zhì)，或靶定所述蛋白質(zhì)分泌。例如，所述宿主細(xì)胞可為細(xì)菌，且蛋白質(zhì)可包含非細(xì)菌性分泌信號(hào)序列，例如果膠裂解酶分泌信號(hào)序列。
所述重組工程化蛋白質(zhì)還可包含蛋白酶切割位點(diǎn)，以促進(jìn)皺胃中蛋白質(zhì)的切割，并增加所述蛋白質(zhì)中氨基酸到小腸的傳遞。例如，一種這樣的蛋白酶為胃蛋白酶，其是牛皺胃中的一種蛋白質(zhì)消化酶。證明胃蛋白酶優(yōu)先在P1和P1′位的疏水殘基，優(yōu)選芳族殘基處切割肽。特別地，胃蛋白酶在苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸和亮氨酸殘基的羧基側(cè)切割蛋白質(zhì)。因而，所述蛋白質(zhì)可包含一個(gè)或多個(gè)胃蛋白酶切割位點(diǎn)。
在另一實(shí)施例中，所述產(chǎn)品可包含用具有增加含量的其它氨基酸特別是限制氨基酸的肽或蛋白質(zhì)擴(kuò)增的富含組氨酸的蛋白質(zhì)。例如，產(chǎn)品可包含具有增加含量的一種或多種相同或不同氨基酸的一種或多種蛋白質(zhì)。因而，產(chǎn)品可包含多種蛋白質(zhì)、肽和/或氨基酸。
所述富含組氨酸的蛋白質(zhì)或肽可在微生物宿主(例如埃希氏菌、棒狀桿菌、短桿菌、芽孢桿菌、酵母)和植物等中過(guò)表達(dá)?？蓪⒄麄€(gè)微生物生物質(zhì)進(jìn)行噴霧干燥并用于動(dòng)物飼料，或者所述富含組氨酸的蛋白質(zhì)和相關(guān)蛋白質(zhì)或肽可從所述生物質(zhì)至少部分被純化?；蛘?，當(dāng)所述微生物宿主分泌組氨酸和/或富含組氨酸的蛋白質(zhì)時(shí)，可從發(fā)酵產(chǎn)生的生物質(zhì)中分離出富含組氨酸的發(fā)酵液，并可將澄清的發(fā)酵液例如以液體形式或噴霧干燥形式用作動(dòng)物飼料成分。在一個(gè)實(shí)施方案中，可通過(guò)將所述蛋白質(zhì)中的組氨酸標(biāo)記與包含鎳金屬的基質(zhì)結(jié)合來(lái)純化富含組氨酸的蛋白質(zhì)。
可能希望使用不含有具有內(nèi)毒素作用的脂多糖(“LPS”)的微生物宿主，例如革蘭氏陽(yáng)性菌，如棒狀桿菌和短桿菌。革蘭氏陰性菌，例如大腸桿菌，通常含有具有內(nèi)毒素作用的LPS。當(dāng)要制備生物質(zhì)并將其用作組氨酸源時(shí)，選擇不包含內(nèi)毒素性LPS的細(xì)菌可能是特別重要的，因?yàn)長(zhǎng)PS的大部分仍然與細(xì)菌結(jié)合，且除非所述細(xì)菌溶解，否則其基本上不釋放到發(fā)酵液中。因而，預(yù)期發(fā)酵后內(nèi)毒素性LPS將定位在生物質(zhì)中。
所述產(chǎn)品可包含已經(jīng)處理的以促進(jìn)過(guò)瘤胃的成分。例如，所述產(chǎn)品可包含處理的組氨酸和/或處理的富含組氨酸的蛋白質(zhì)。所述組氨酸和/或富含組氨酸的蛋白質(zhì)可與一種或多種還原碳水化合物(例如木糖、乳糖、葡萄糖等)反應(yīng)。在各種實(shí)施方案中，組氨酸和/或富含組氨酸的蛋白質(zhì)可用聚合化合物、定型蛋白質(zhì)(formalized protein)、脂肪、脂肪和鈣的混合物、脂肪和蛋白質(zhì)的混合物包衣或用長(zhǎng)鏈脂肪酸的金屬鹽包衣。組氨酸和/或富含組氨酸的蛋白質(zhì)可用可被修飾的植物油(例如大豆油)包衣，該植物油可以被修飾。例如，組氨酸和/或富含組氨酸的蛋白質(zhì)可用至少部分氫化的植物油包衣。特別地，組氨酸和/或富含組氨酸的蛋白質(zhì)可用脂肪酸金屬鹽(例如硬脂酸鋅)和脂肪酸(例如硬脂酸)的混合物包衣。組氨酸和/或富含組氨酸的蛋白質(zhì)也可用pH敏感的聚合物包衣。pH-敏感的聚合物在瘤胃pH下是穩(wěn)定的，但當(dāng)其接觸皺胃pH時(shí)分解，在皺胃中釋放出用于消化的蛋白質(zhì)，并在小腸中吸收。
一方面，所公開(kāi)的方法包括幾個(gè)步驟。首先，合成氨基酸或富含一種或多種氨基酸的蛋白質(zhì)。如上所述，適合的氨基酸可為組氨酸，而適合的蛋白質(zhì)可為富含組氨酸的蛋白質(zhì)?？捎梦⑸锇l(fā)酵系統(tǒng)來(lái)生產(chǎn)發(fā)酵生物質(zhì)以合成所述氨基酸和/或富含氨基酸的蛋白質(zhì)，可將發(fā)酵生物質(zhì)干燥(例如噴霧干燥)得到干燥的發(fā)酵生物質(zhì)?；蛘?，所述氨基酸和/或蛋白質(zhì)可存在于發(fā)酵液中，(例如通過(guò)過(guò)濾)可將所述發(fā)酵液與發(fā)酵生物質(zhì)分離，并噴霧干燥以制得具有增加含量的氨基酸和/或蛋白質(zhì)的干發(fā)酵液。另外，可在制備干產(chǎn)品之前從所述生物質(zhì)和/或發(fā)酵液中分離或至少部分純化所述氨基酸和/或富含氨基酸的蛋白質(zhì)。所述干發(fā)酵生物質(zhì)、干發(fā)酵液和/或干制品可包以包衣，以提供包衣產(chǎn)品和/或(例如通過(guò)使所述干發(fā)酵生物質(zhì)、干發(fā)酵液和/或干制品與還原碳水化合物例如木糖反應(yīng))來(lái)進(jìn)行處理。所述包衣可是疏水性的。所述包衣和/或處理可保護(hù)所述產(chǎn)品，并使其經(jīng)過(guò)瘤胃降解減少，并向皺胃和/或小腸傳遞至少一部分所述產(chǎn)品。因而，所述包衣和/或處理使所述包衣和/或處理的產(chǎn)品繞過(guò)瘤胃(即過(guò)瘤胃)。可給反芻動(dòng)物喂食所述包衣和/或處理的產(chǎn)品以提高產(chǎn)奶量以及提高奶蛋白質(zhì)組成。
附圖簡(jiǎn)述圖1是微生物生長(zhǎng)模式的簡(jiǎn)圖。NDF-“中性洗滌纖維”；NFC-“非纖維碳水化合物”；VFA-“揮發(fā)性脂肪酸”；RDP-“瘤胃可降解蛋白質(zhì)”；rH-“瘤胃的pH”。
圖2是用于包封產(chǎn)品的一般旋轉(zhuǎn)盤方法的簡(jiǎn)圖。
圖3顯示了游離組氨酸和包衣組氨酸的體外組氨酸降解速率對(duì)組氨酸濃度圖。
具體實(shí)施方式認(rèn)為組氨酸是反芻動(dòng)物飼料中一種初級(jí)速率(primary rate)的限制氨基酸，其在飼料中的濃度與奶牛的產(chǎn)奶量直接相關(guān)。目前動(dòng)物飼料中使用血粉，其富含組氨酸源。另外，血粉中存在的組氨酸在瘤胃中不顯著地降解。血粉替代物缺乏相似的組氨酸含量，且缺乏血粉的飼料將需要補(bǔ)充組氨酸以滿足氨基酸需求。另外，隨著奶產(chǎn)量增加，除組氨酸之外，對(duì)其它氨基酸的需求也相應(yīng)增加。也需要滿足這種對(duì)其它氨基酸的需求。
蛋白質(zhì)必須避免瘤胃降解，并到達(dá)小腸以補(bǔ)充足量的氨基酸。所開(kāi)發(fā)的防止氨基酸發(fā)酵性消化的主要方法包括(1)用保護(hù)所述產(chǎn)品免于在瘤胃中降解的組合物包衣具有增加含量的氨基酸的產(chǎn)品和(2)對(duì)所述氨基酸進(jìn)行結(jié)構(gòu)處理以產(chǎn)生證明在瘤胃中降解減少的氨基酸類似物。瘤胃中的單個(gè)組氨酸殘基比存在于蛋白質(zhì)或肽中的組氨酸更易于降解，因此，富含組氨酸的蛋白質(zhì)可能提供優(yōu)于單個(gè)組氨酸殘基的優(yōu)勢(shì)。另外，具有重要二級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)(例如二硫鍵)的蛋白質(zhì)可顯示出更好的瘤胃保護(hù)。
除提供用于反芻動(dòng)物飼料的組氨酸源外，富含組氨酸的蛋白質(zhì)還可與血粉中存在的“富含組氨酸”蛋白質(zhì)極其類似。例如，血粉可包含牛血紅素α鏈，SwissProt.登記號(hào)為P01966，其組氨酸含量超過(guò)7％(組氨酸殘基/總殘基)，氨基酸序列為
1 mvlsaadkgn vkaawgkvgg haaeygaeal ermflsfptt ktyfphfdls51 hgsaqvkghg akvaaaltka vehlddlpga lselsdlhah klrvdpvnfk101 llshsllvtl ashlpsdftp avhasldkfl anvstvltsk yr。
從文獻(xiàn)中已知其它富含組氨酸的蛋白質(zhì)，其包括來(lái)自惡性瘧原蟲(chóng)的富含組氨酸蛋白II，登記號(hào)為AAC47453，其組氨酸含量超過(guò)32％(組氨酸殘基/總殘基)，氨基酸序列為1 mvsfsknkvl saavfasvll ldnnnsafnn nlcsknakgl nlnkrllhet51 qahvddahha hhvadahhah haadahhahh aadahhahha adahhahhaa101 dahhahhaay ahhahhaada hhahhasdah haadahhaay ahhahhaada151 hhahhasdah haadahhaay ahhahhaada hhaadahhat dahhahhaad201 arhatdahha adahhatdah haadahhaad ahhatdahha adahhatdah251 haadahhaad ahhatdahha hhaadahhaa ahhatdahha tdahhaaahh301 eaathclrh。
如上所述，蛋白質(zhì)片段可適于用作富含組氨酸的蛋白質(zhì)或肽。例如，可在蛋白質(zhì)的N-末端或C-末端截?cái)嘁陨筛缓M氨酸的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)包含富含組氨酸的內(nèi)部氨基酸序列。片段可為任何長(zhǎng)度，不過(guò)特別適合的片段可包含至少約20個(gè)氨基酸。來(lái)自惡性瘧原蟲(chóng)的富含組氨酸蛋白II的氨基酸61至130片段的組氨酸含量為約44％(組氨酸殘基/總殘基)，而該蛋白質(zhì)的氨基酸58至80片段的組氨酸含量為約55％。因而，這些片段可特別適用作富含組氨酸的蛋白質(zhì)。
另一富含組氨酸的蛋白質(zhì)為來(lái)自小家鼠(Mus musculus)的富含組氨酸糖蛋白，登記號(hào)為AAH11168，其組氨酸含量超過(guò)10％(組氨酸殘基/總殘基)，氨基酸序列為
1 mkvlttalll vtlqcshals ptncdasepl aekvldlink grrsgyvfel51 lrvsdahldr agtatvyyla ldviesdcwv lstkaqddcl psrwqseivi101 gqckviatry snesqdlsvn gyncttssvs salrntkdsp vlldffedse151 lyrkqarkal dkyktdngdf asfrveraer virarggert nyyvefsmrn201 cstqhfprsp 1vfgfcrall sysietsdle tpdsidince vfniedhkdt251 sdmkphwghe rplcdkhlck lsgsrdhhht hktdklgcpp ppegkdnsdr301 prlqegalpq lppgypphsg anrthrpsyn hscnehpchg hrphghhphs351 hhppghhshg hhphghhphs hhshghhppg hhphghhphg hhphghhphg401 hhphghdfld ygpcdppsns qelkgqyhrg ygpphghsrk rgpgkglfpf451 hhqqigyvyr lpplnigevl tlpeanfpsf slpncnrslq peiqpfpqta501 srscpgkfes efpqiskffg ytppk該蛋白質(zhì)的氨基酸331至406片段的組氨酸含量超過(guò)50％(組氨酸殘基/總殘基)，因此，該片段可特別適用作富含組氨酸的蛋白質(zhì)。
另一富含組氨酸的蛋白質(zhì)為來(lái)自歐洲榿木(Alnus glutinosa)的actinorizal nodulin AgNOD-GHRP，登記號(hào)為AAD00171，其組氨酸含量大約15％(組氨酸殘基/總殘基)，氨基酸序列為1 mgysktflll glafavvlli ssdvsasela vaaqtkenmq tdgveedkyh51 ghrhvhghgh ghvhgngneh ghghhhgrgh pghgaaadet etetetnqn該蛋白質(zhì)的氨基酸50至83片段的組氨酸含量超過(guò)44％(組氨酸殘基/總殘基)，因此，該片段可特別適用作富含組氨酸的蛋白質(zhì)。
另一富含組氨酸的蛋白質(zhì)為人富含組氨酸的鈣結(jié)合蛋白，前體，登記號(hào)為AAH69795，其組氨酸含量大約12％(組氨酸殘基/總殘基)，氨基酸序列為1 mqhhrpwlha svlwagvasl llppamtqql rqdqlgfrnr nnstqvagls
51 eeasaelrhh 1hsprdhpde nkdvstengh hfwshpdrek ededvskeyg101 hllpghrsqd hkvgdegvsg eevfaehggq arghrghgse dtedsaehrh151 hlpshrshsh qdededevvs sehhhhilrh ghrghdgedd egeeeeeeee201 eeeeasteyg hqahrhrghg seededvsdg hhhhgpshrh qgheeddddd251 dddddddddd dvsieyrhqa hrhqghgiee dedvsdghhh rdpshrhrsh301 eeddnddddv steyghqahr hqdhrkeeve avsgehhhhv pdhrhqghrd351 eeededvste rwhqgpqhvh hglvdeeeee eeitvqfghy vashqprghk401 sdeedfqdey ktevphhhhh rvpreedeev saelghqaps hrqshqdeet451 ghgqrgsike mshhppghtv vkdrshlrkd dseeekekee dpgsheedde501 sseqgekgth hgsrdqedee deeeghglsl nqeeeeeedk eeeeeeedee551 rreeraevga plspdhseee eeeeegleed eprftiipnp ldrreeagga601 sseeesgedt gpqdaqeygn yqpgslcgyc sfcnrctece schcdeenmg651 ehcdqcqhcq fcylcplvce tvcapgsyvd yfssslyqal admletpep該蛋白質(zhì)的氨基酸211至371片段的組氨酸含量超過(guò)22％(組氨酸殘基/總殘基)，因此，該片段可特別適用作富含組氨酸的蛋白質(zhì)。
其它富含組氨酸的蛋白質(zhì)包括稱作“histatin”的一類蛋白質(zhì)。Histatin為富含組氨酸的蛋白質(zhì)，其存在于唾液中，并具有抗真菌和抗細(xì)菌性能。例如參見(jiàn)Neuman等，(1996)Electrophoresis17266-270。這些富含組氨酸的蛋白質(zhì)或肽可用作動(dòng)物飼料例如奶牛動(dòng)物飼料的組氨酸源。因?yàn)閔istatin具有抗真菌和抗細(xì)菌性能，除了用作組氨酸源外，其還可以使動(dòng)物飼料的保存期更長(zhǎng)。
氨基酸需求?？赏ㄟ^(guò)向動(dòng)物飼料中補(bǔ)充限制氨基酸來(lái)向動(dòng)物提供所述限制氨基酸，從而增加所選畜產(chǎn)品(例如奶)的產(chǎn)量?？赏ㄟ^(guò)分析所選畜產(chǎn)品的氨基酸譜(即產(chǎn)出譜)來(lái)鑒定限制氨基酸，并將該譜與提供給動(dòng)物的氨基酸譜(即輸入譜)進(jìn)行比較。本領(lǐng)域公知確定氨基酸需要量的方法，并在美國(guó)專利5,145,695和美國(guó)專利5,219,596中有描述，該兩篇文獻(xiàn)以其全部?jī)?nèi)容引入本文作為參考。
氨基酸補(bǔ)充。反芻動(dòng)物氨基酸來(lái)自兩個(gè)來(lái)源(1)由微生物生長(zhǎng)決定的微生物蛋白質(zhì)；和(2)瘤胃中未降解的蛋白質(zhì)(即“瘤胃未降解蛋白質(zhì)”或“RUP”)?？筛鶕?jù)瘤胃中發(fā)酵可獲得的碳水化合物(例如淀粉、糖、中性洗滌纖維、果膠和β-葡聚糖)、瘤胃可降解蛋白質(zhì)的供應(yīng)以及瘤胃的pH預(yù)測(cè)微生物生長(zhǎng)。因?yàn)槲⑸锏鞍踪|(zhì)是不可完全消化的，必須根據(jù)所述蛋白質(zhì)的消化率調(diào)整由微生物蛋白質(zhì)補(bǔ)充的微生物氨基酸的供應(yīng)，以提供可消化的微生物氨基酸值。
氨基酸的第二來(lái)源是經(jīng)瘤胃至皺胃后仍未降解的飼料成分(即所述繞過(guò)的蛋白質(zhì)部分)。由瘤胃中的微生物以不同的速度加工并利用(即降解)飼料成分內(nèi)的氨基酸。因而，不同的氨基酸將具有不同的未降解必需氨基酸(“UEAA”)值。此外，可根據(jù)小腸中氨基酸的消化率來(lái)調(diào)整UEAA值，以得到可消化的UEAA值。通過(guò)瘤胃的必需氨基酸的量可使用Craig等，“Amino Acids Released During ProteinDegradation by Rumen Microbes”(1984)Journal of Animal Science，58436-443中描述的方法來(lái)計(jì)算?？上奈⑸锇被岷涂上腢EAA的總和為將提供給小腸的可消化的氨基酸值。對(duì)于奶牛來(lái)說(shuō)，對(duì)所述氨基酸而言，有時(shí)其是指奶可消化氨基酸(“ddAA”)，例如牛奶可消化組氨酸(“ddAA HIS”)。
在膳食制劑中，從動(dòng)物氨基酸需要量中減去預(yù)計(jì)的從瘤胃發(fā)酵得到的可消化微生物氨基酸值，其由動(dòng)物譜確定。需要以UEAA形式由飼料補(bǔ)充的氨基酸量為動(dòng)物氨基酸需要量與由可消化微生物氨基酸補(bǔ)充的氨基酸之間的差。
可將奶的氨基酸譜與動(dòng)物消化道內(nèi)微生物生產(chǎn)的氨基酸譜(即微生物氨基酸譜)相比較。微生物和奶氨基酸譜之間的差異表明其中的氨基酸可能過(guò)量或限制。然而，該氨基酸譜的對(duì)比僅提供了增強(qiáng)所選畜產(chǎn)品的產(chǎn)量所需的部分信息。還必須考慮機(jī)體將小腸中的氨基酸摻入所選畜產(chǎn)品中的效率。通過(guò)確定產(chǎn)出/輸入氨基酸譜比例和確定摻入效率，可確定牛奶的可消化氨基酸需求。已經(jīng)建立，組氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和蘇氨酸可能是奶牛產(chǎn)奶的限制氨基酸。可對(duì)肌肉的氨基酸譜進(jìn)行類似的測(cè)定。
富含組氨酸產(chǎn)品的合成。富含組氨酸的產(chǎn)品可包括具有增加含量的做為游離氨基酸的組氨酸產(chǎn)品和/或包含富含組氨酸的蛋白質(zhì)的產(chǎn)品?？梢杂帽绢I(lǐng)域公知的方法生產(chǎn)富含組氨酸的產(chǎn)品。例如，可將富含組氨酸的發(fā)酵液用作組氨酸源。可由選擇的過(guò)量產(chǎn)生或工程化以過(guò)量產(chǎn)生組氨酸的單細(xì)胞生物體(例如微生物如細(xì)菌或酵母)和/或植物生產(chǎn)所述富含組氨酸的發(fā)酵液。適合的微生物可包括屬于埃希氏菌、芽孢桿菌、細(xì)桿菌、節(jié)桿菌、沙雷氏菌和棒狀桿菌屬的微生物。已知革蘭氏陰性菌生產(chǎn)脂多糖(“LPS”)，其是內(nèi)毒素。因而，可能期望選擇革蘭氏陽(yáng)性菌作為宿主細(xì)胞(例如棒狀桿菌和短桿菌)，尤其是要制備生物質(zhì)時(shí)。因?yàn)長(zhǎng)PS的大部分仍與宿主細(xì)胞結(jié)合，且直至所述宿主細(xì)胞溶解才釋放入發(fā)酵液中，因此革蘭氏陰性菌例如大腸桿菌可適用于生產(chǎn)組氨酸發(fā)酵液。
可將所述富組氨酸的發(fā)酵液進(jìn)行噴霧干燥，直接作為組氨酸源使用或可將發(fā)酵液濃縮。在另一實(shí)施方案中，組氨酸可從所述發(fā)酵培養(yǎng)基和生物質(zhì)至少部分被純化。所述微生物生產(chǎn)的組氨酸可根據(jù)過(guò)瘤胃技術(shù)制備，并以所需的水平加入飼料中。
或者，可對(duì)微生物進(jìn)行工程化以積聚并保留組氨酸，并可將所述微生物制備成噴霧干燥的生物質(zhì)產(chǎn)品。任選地，所述生物質(zhì)可通過(guò)已知的方法例如離析、潷析、離析和潷析組合、超濾或微濾進(jìn)行分離。可將所述生物質(zhì)產(chǎn)品進(jìn)行進(jìn)一步處理以促進(jìn)過(guò)瘤胃。在一實(shí)施方案中，可從發(fā)酵介質(zhì)中分離出所述生物質(zhì)產(chǎn)品，噴霧干燥，并任選進(jìn)行包衣以促進(jìn)過(guò)瘤胃，并作為組氨酸源加入飼料中。
在另一實(shí)施方案中，可對(duì)微生物進(jìn)行工程化以生產(chǎn)富含組氨酸的蛋白質(zhì)。富含組氨酸的蛋白質(zhì)可包括已知的和表征的蛋白質(zhì)(例如來(lái)自惡性瘧原蟲(chóng)的富含組氨酸蛋白II和/或histatin)和工程化的蛋白質(zhì)(例如設(shè)計(jì)成具有所選的氨基酸譜的蛋白質(zhì))。例如，可將來(lái)自惡性瘧原蟲(chóng)的富含組氨酸蛋白II或所選的histatin克隆到表達(dá)載體中并引入合適的宿主細(xì)胞中?；蛘撸蓪⒕哂兴x氨基酸譜的重組工程化蛋白質(zhì)克隆到表達(dá)載體中，并引入到合適的宿主細(xì)胞(例如微生物)中。
所述富含組氨酸的蛋白質(zhì)可被分泌入發(fā)酵介質(zhì)中，或者，所述富含組氨酸的蛋白質(zhì)可在所述微生物中積聚?？蓪⑺鑫⑸镏苽涑蓢婌F干燥的生物質(zhì)產(chǎn)品，或可從所述微生物質(zhì)中分離出所述富含組氨酸的蛋白質(zhì)或肽，以得到富含組氨酸的產(chǎn)品。不論是那種情況，均可以對(duì)所述富含組氨酸的產(chǎn)品進(jìn)行進(jìn)一步處理以增強(qiáng)過(guò)瘤胃。然后可將處理的產(chǎn)品作為組氨酸源加入飼料中。
富含組氨酸的蛋白質(zhì)(HRP)或肽在微生物宿主大腸桿菌中的構(gòu)建和表達(dá)?？扇缦率鰳?gòu)建富含組氨酸的蛋白質(zhì)構(gòu)建體HrcpET30(Xa/LIC)。設(shè)計(jì)具有與pET30(Xa/LIC)載體(Novagen，Madison，MI)相容的突出端的引物，以克隆小家鼠富含組氨酸的鈣結(jié)合蛋白基因(Hrc)。pET載體在Xa/LIC位點(diǎn)的5′端具有12個(gè)堿基的單鏈突出端，且在Xa/LIC位點(diǎn)的3′端具有15個(gè)堿基的單鏈突出端。將所述質(zhì)粒設(shè)計(jì)成不需要連接的克隆(ligation independent cloning)，具有N-末端His和S-標(biāo)記以及任選的C-末端His-標(biāo)記。Xa蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)(IEGR)位于感興趣基因的起始密碼子的前面，這樣可以去除融合蛋白標(biāo)記。
用于小家鼠Hrc基因pET30 Xa/LIC克隆的下列引物可購(gòu)得正向5′-GGTATTGAGGGTCGCATGGGCTTCCAGGGGCCATGG-3′和反向5′AGAGGAGAGTTAGAGCCTCACGACCTGTTCTGTTCTC3′。小家鼠Hrc基因的核酸序列和相應(yīng)的蛋白質(zhì)序列可從GenBank獲得，登記號(hào)BC021623，由Strausberg等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99(26)，16899-16903(2002)提交，列于表1(所述基因的DNA序列)和表2(所述編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列)中?？稍O(shè)計(jì)Hrc基因內(nèi)部引物，使得所生成的肽比天然蛋白質(zhì)序列具有更高的組氨酸殘值/總氨基酸百分比。
表1小家鼠富含組氨酸的鈣結(jié)合蛋白mRNA的cDNA序列
1 ccacgcgtcc gccaagacct gaggaagata gagaggcaga gagtgggagc tataccacga61 caaaagggac aatctgaaag tcaaagccaa aaaggcacaa ggacccatca gaggcagctg121 aagccagcct ggtcagacgc tcagctgcta aacgtcccca tgggcttcca ggggccatgg181 ttgcacactt gtctcctttg ggccacagtg gccatcctgc tggtccctcc agtggtgacc241 caggagttga gaggggccgg tctgggcctg ggcaactgga acaacaatgc aggcatccct301 gggtcctcag aggacctatc aactgagttt ggtcaccaca tccaccgggg atatcaaggt361 gagaaggaca gaggccacag agaagagggt gaagacttct ccagggaata tggccacagg421 gtccaagacc acaggtaccc tggccgcgag gttggagagg agaatgtctc tgaagaggtc481 ttcagagggc atgttagaca gctccacggg caccgggaac atgacaatga agatttagga541 gactcggcag agaaccacct ccccagacag aggagccaca gccacgaaga tgaggatggc601 attgtctcca gtgagtatca ccgtcacgtc cccaggcatg cccaccatgg ccacggagag661 gaagatgatg acgatgatgg aggagaggag gaggagaggg tggatgtgat ggaggactct721 gatgataatg aacaccaggt ccatggtcac cagagccact caaaggagag agatgaactc781 catcatgccc acagccacag gcaccaaggc cacagtgatg atgacgatga cgatggtgtc841 tctactgagc atggacacca agctcacaga tatcaggatc atgaggagga agacgatggg901 gactcagatg aagacagtca cacccacaga gttcaaggcc gagaagatga aaatgatgat961 gaagacggtg actctggtga atacagacac catacccagg accaccaagg ccacaacgaa1021 gagcaagatg acgatgatga tgatgatgat gatgatgaag ataaagaaga ctccactgag1081 caccggcacc agacccaagg ccacaggaag gaagaagatg aggatgagtc agatgaagat1141 gatcatcatg tctccaggca tggacgccaa ggctatgaag aagaagaaga tgatgatgat1201 gatgatggag atgatgactc tactgagcat gtgcatcaag cccacagaca cagagaccat1261 gagcacaaag atgatgagga tgactcagaa gaagactacc atcatgtccc cggagtcctc1321 cggattgctc tctcgactgc cagtggggca gccgctgcct actcagcgcc ttgcctcaac1381 ttccccatca gtaccaacac cccctttacc ctcgtgtgga gcctaagaga acagaacagg1441 tcgtgaagcc agcaaagaaa agttctgtcg cgtttgtgaa cctttttttt tttttaatca1501 aatcgacaac aaacattaaa actttttttt ttraaaaagg acgttaaaaa atttaaaaag1561 tatatgagct tcatgggact aactcatcgc cttcccttgc gtacttcaga ttgtagccat1621 acttttaaaa aaaaaggcaa agaggataat gacatttttt atcagtattg tgaataaact1681 tgaacacaaa tacagaagtt ctatgtcctg tcttcagttg tagaagttgt cttctgcaag1741 gtacaaccac ccacttgaac ttcctctgat gacacaatcc acaattctat aagggaatca1801 gtgttcacgt ctctgtatat atttatttat gtgtaattta atgggatttg taaatatggt1861 gagtctgttt taaacctttt tttatttatc tggtgatctc gtttacctcc tgtttagtgg1921 gctttggatc ctccctgtta gttcttcatg tggttttact tagaaatcca aggtttgggt1981 aagactcccc ctccccaccc cttttctcca attcatggat ttagccccgt ggtagcatgt2041 taaacgatta taatgaaaca gctgaacaaa aacattttta aggtaaaata aaaatttata2101 tataattagt aaaaaaaaaa aaaaaaa
表2小家鼠富含組氨酸的鈣結(jié)合蛋白的氨基酸序列MGFQGPWLHTCLLWATVAILLVPPVVTQELRGAGLGLGNWNNNAGIPGSSEDLSTEFGHHIHRGYQGEKDRGHREEGEDFSREYGHRVQDHRYPGREVGEENVSEEVFRGHVRQLHGHREHDNEDLGDSAENHLPRQRSHSHEDEDGIVSSEYHRHVPRHAHHGHGEEDDDDDGGEEEERVDVMEDSDDNEHQVHGHQSHSKERDELHHAHSHRHQGHSDDDDDDGVSTEHGHQAHRYQDHEEEDDGDSDEDSHTHRVQGREDENDDEDGDSGEYRHHTQDHQGHNEEQDDDDDDDDDDEDKEDSTEHRHQTQGHRKEEDEDESDEDDHHVSRHGRQGYEEEEDDDDDDGDDDSTEHVHQAHRHRDHEHKDDEDDSEEDYHHVPGVLRIALSTASGAAAAYSAPCLNFPISTNTPFTLVWSLREQNRS據(jù)報(bào)道tRNA濃度和氨酰tRNA合成酶的變化影響氨基酸生物合成。另外，tRNA通過(guò)減少蛋白質(zhì)產(chǎn)物的氨基酸順序的翻譯和誤差，可對(duì)微生物表達(dá)系統(tǒng)中異源基因的表達(dá)和過(guò)表達(dá)有大的影響。(例如參見(jiàn)O′Neill等，J.Bacteriol.1990 Nov；172(11)6363-71)；Smith等，Biotechnol Prog.1996 Jul-Aug；12(4)417-22)；Dieci等，Protein ExprPurif.2000 Apr；18(3)346-54)。因此，例如為增加富含組氨酸的蛋白質(zhì)的表達(dá)，同時(shí)表達(dá)相應(yīng)的組氨酰tRNA基因也是有利的。還可設(shè)計(jì)引物以將小家鼠Hrc基因引入帶有HisSpET30 Xa/LIC的操縱子中，以使得富含組氨酸的鈣結(jié)合蛋白和組氨酰tRNA合成酶共表達(dá)。
根據(jù)特定的富含組氨酸的蛋白質(zhì)源的不同，可改變各基因的密碼子偏好以與宿主微生物密碼子的使用相匹配，從而實(shí)現(xiàn)較高的異源蛋白質(zhì)表達(dá)。(例如參見(jiàn)Baca等，Int′l J.of Parasitology.30113-118)?？蓮亩喾N來(lái)源獲得密碼子使用表。
從ATCC購(gòu)得小家鼠富含組氨酸的鈣結(jié)合蛋白mRNA(cDNA克隆MGC13723 IMAGE3979848)，編號(hào)MGC-13723。所有限制性酶從New England BioLabs(Beverly，MA)購(gòu)得。除非另外說(shuō)明，通過(guò)Intergrated DNA Technologies，Inc(Coralville，IA)合成引物。
下面是PCR方案的一個(gè)版本，其可用于擴(kuò)增小家鼠Hrc基因。在50μL的反應(yīng)中，加入0.1-0.5μg模板、各引物1.5μM、各dNTP 0.4mM、3.5 U Expand High FidelityTM聚合酶和含Mg2+的1×ExpandTM緩沖液(Roche，Indianapolis，IN)。所選的溫度循環(huán)程序包括在96℃下熱啟動(dòng)5分鐘，隨后進(jìn)行29個(gè)循環(huán)，該循環(huán)包括下列步驟94℃30秒、40-65℃ 1分鐘(梯度溫度循環(huán))和72℃ 2分鐘。29個(gè)循環(huán)后，將樣品保持在72℃下10分鐘，然后在4℃下儲(chǔ)存。
PCR產(chǎn)物使用Qiagen凝膠提取試劑盒(Valencia，CA)用0.8或1％的TAE-瓊脂糖凝膠進(jìn)行凝膠純化。在瓊脂糖凝膠上將PCR產(chǎn)物與標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比較定量，然后用T4 DNA聚合酶按以下廠商推薦的Ligation Independent Cloning(Novagen，Madison，WI)方案進(jìn)行處理。
簡(jiǎn)要地，將約0.2pmol純化的PCR產(chǎn)物在22℃下在dGTP存在下用1U T4 DNA聚合酶處理30分鐘。聚合酶從PCR產(chǎn)物的3′端除去連續(xù)的堿基。當(dāng)聚合酶遇到鳥(niǎo)嘌呤殘基時(shí)，該酶的5′至3′聚合酶活性抵消核酸外切酶活性，以有效地防止進(jìn)一步切除。由此產(chǎn)生了與pET Xa/LIC載體相容的單鏈突出端。通過(guò)在75℃下培養(yǎng)20分鐘鈍化聚合酶。
按Novagen的建議對(duì)載體和處理的插入物進(jìn)行退火。將約0.02pmol處理的插入物和0.01pmol的載體在22℃下溫育5分鐘；加入6.25mM EDTA(終濃度)；并再在22℃下進(jìn)行溫育。將退火反應(yīng)物(1μL)加入NovaBlueTMSingles感受態(tài)細(xì)胞(Novagen，Madison，WI)中，然后在冰上放置5分鐘?；旌虾?，將細(xì)胞在42℃下熱休克30秒進(jìn)行轉(zhuǎn)化。將細(xì)胞放在冰上2分鐘，然后在37℃下以225rpm搖動(dòng)使其在250μL的室溫SOC中恢復(fù)30分鐘。將細(xì)胞在含有卡那霉素(25-50μg/mL)的LB板上培養(yǎng)。
將來(lái)自在含有卡那霉素的LB板上生長(zhǎng)的培養(yǎng)物的質(zhì)粒DNA用Qiagen spin miniprep試劑盒(Valencia，CA)純化，并篩選正確的插入物。通過(guò)雙脫氧鏈終止DNA測(cè)序(Seq Wright，Houston，TX)用S-標(biāo)記和T7終止子引物(Novagen)和內(nèi)部引物驗(yàn)證看起來(lái)具有正確插入物的質(zhì)粒的序列。將序列驗(yàn)證的HrcpET30(Xa/LIC)根據(jù)Novagen方案轉(zhuǎn)化入表達(dá)宿主BL21(DE3)中。
可如下進(jìn)行大腸桿菌BL21(DE3)∷HrcpET30(Xa/LIC)細(xì)胞中富含組氨酸的蛋白質(zhì)的表達(dá)。在含有50μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基上制備新鮮的大腸桿菌BL21(DE3)∷小家鼠Hrc/pET30(Xa/LIC)細(xì)胞板。將來(lái)自單個(gè)集落的過(guò)夜培養(yǎng)物(5mL)接種，并在30℃下在含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。一般地，1至5ml接種物用于誘導(dǎo)100ml-500ml含50μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基。細(xì)胞在37℃下生長(zhǎng)，并每小時(shí)取樣直至得到OD600為0.35-0.8。然后將細(xì)胞用0.1mM IPTG誘導(dǎo)。經(jīng)過(guò)約4-10小時(shí)生長(zhǎng)(后誘導(dǎo))后，將全部體積的培養(yǎng)物在4℃下以3500rpm離心20分鐘。傾出上清液，如果不立即分析，將培養(yǎng)液和細(xì)胞(用無(wú)菌蒸餾水沖洗一次)單獨(dú)在-80℃下冷凍。根據(jù)所述Novagen方案用Novagen BugBusterTM試劑和benzonase核酸酶以及Calbiochem蛋白酶抑制劑混合物III制備細(xì)胞提取物用于蛋白質(zhì)分析。通過(guò)SDS-PAGE用4-15％梯度凝膠(Bio-Rad，Hercules，CA)分析細(xì)胞提取物中的蛋白質(zhì)表達(dá)水平。
一旦確定合適的引起富含組氨酸的蛋白質(zhì)最大表達(dá)的誘導(dǎo)條件(例如時(shí)間和溫度)，則在該條件下培養(yǎng)細(xì)胞，并將細(xì)胞沉淀重懸在適當(dāng)量的合適等滲緩沖液例如生理鹽水(0.85％NaCl pH 7.0)中。然后用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，例如在弗氏壓碎器中處理，將該細(xì)胞懸液裂解。在40℃下以10000-15000rpm將裂解的細(xì)胞離心20-30分鐘，以分離生物質(zhì)和細(xì)胞碎片，并產(chǎn)生含有富含組氨酸的蛋白質(zhì)的無(wú)細(xì)胞提取液。將所述含有富含組氨酸的蛋白質(zhì)的提取液進(jìn)行噴霧干燥，以產(chǎn)生富含組氨酸的蛋白質(zhì)的產(chǎn)品，其可原樣加入動(dòng)物飼料中，或進(jìn)行適當(dāng)包封后加入動(dòng)物飼料中以確?；钚缘赝ㄟ^(guò)瘤胃?？墒褂梦墨I(xiàn)所述或下述的方法來(lái)純化和/或濃縮來(lái)自大腸桿菌BL21(DE3)∷HrcpET30(Xa/LIC)細(xì)胞的富含組氨酸的蛋白質(zhì)。
富含組氨酸的重組或合成蛋白質(zhì)或肽(富含組氨酸的蛋白質(zhì)或肽-HRP)或與所選氨基酸組合且與合適的氨酰tRNA合成酶基因一起表達(dá)的組氨酸的構(gòu)建和表達(dá)。可如下構(gòu)建合成的富含組氨酸的蛋白質(zhì)或肽構(gòu)建體HEPpET30(Xa/LIC)?？蓪⒑铣傻碾幕虻鞍踪|(zhì)設(shè)計(jì)成例如具有以下序列MHSCNEHPMH LHRPHLHHMH SHHPMGHHSHGHHLHGHHPH SHHLGHHPF GHHPHLHHPH LHHPHGHHPHFHHPHFHDFL DHHHH，其中組氨酸含量(H，44個(gè)殘基，～52％)、苯丙氨酸含量(F，4個(gè)殘基，～5％)和亮氨酸含量(L，7個(gè)殘基，～8％)。
在設(shè)計(jì)要翻譯成期望的富含組氨酸的肽的合成基因中考慮微生物宿主的密碼子使用，使得不使用稀有密碼子。例如，預(yù)計(jì)大腸桿菌中的密碼子使用與棒狀桿菌的密碼子使用不同。本領(lǐng)域中已知密碼子使用表，并可以獲得。
根據(jù)Stemmer等，Gene 1995 Oct 16；164(1)49-53所述的方案，有可能(1)確定用于設(shè)計(jì)編碼所期望肽的核酸序列的最好密碼子，(2)設(shè)計(jì)跨越所合成核酸長(zhǎng)度的重疊寡核苷酸的所需數(shù)目，和(3)使用PCR以組裝合成基因，所述PCR不依賴于DNA連接酶而是利用DNA聚合酶的特性以在PCR組裝反應(yīng)中構(gòu)建更長(zhǎng)的DNA片段。然后可將編碼富含組氨酸的肽的合成核酸克隆到所期望的含有合適的抗生素/選擇標(biāo)記物的載體中，以確保合成的富含組氨酸的肽在所選宿主例如植物、大腸桿菌、棒狀桿菌、短桿菌、芽孢桿菌和酵母中表達(dá)。
如上所述，已報(bào)道tRNA濃度和氨酰tRNA合成酶的改變影響氨基酸生物合成。另外，tRNA通過(guò)減少蛋白質(zhì)產(chǎn)品的氨基酸序列的翻譯和誤差，可對(duì)微生物表達(dá)系統(tǒng)中異源基因的表達(dá)和過(guò)表達(dá)有大的影響。(例如參見(jiàn)O′Neill等，J.Bacteriol.1990 Nov；172(11)6363-71；Smith等，Biotechnol Prog.1996 Jul-Aug；12(4)417-22)；Dieci等，Protein Expr Purif.2000 Apr；18(3)346-54)。因此，例如，為增加合成或重組富含組氨酸的蛋白質(zhì)的表達(dá)，同時(shí)表達(dá)相應(yīng)的組氨酰tRNA或各自的氨酰tRNA基因也是有利的。
還可以設(shè)計(jì)引物以將用于富含組氨酸的蛋白質(zhì)或肽的合成或重組基因引入帶有HisSpET30 Xa/LIC的操縱子中，使得富含組氨酸的蛋白質(zhì)或肽和組氨酰tRNA合成酶共表達(dá)以增加產(chǎn)物合成。
可如下進(jìn)行大腸桿菌BL21(DE3)∷HrcpET30(Xa/LIC)細(xì)胞中合成或重組的富含組氨酸的蛋白質(zhì)或肽的表達(dá)。在含有50μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基上制備新鮮的大腸桿菌BL21(DE3)合成或重組HEP/pET30(Xa/LIC)細(xì)胞板。將來(lái)自單個(gè)集落的過(guò)夜培養(yǎng)物(5mL)接種，并在30℃下在含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。一般地，將1至5ml接種物用于誘導(dǎo)100ml-500ml含有50μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基。在37℃下培養(yǎng)細(xì)胞，并每小時(shí)取樣直至得到OD600為0.35-0.8。然后將細(xì)胞用0.1mM IPTG誘導(dǎo)。經(jīng)過(guò)約4-10小時(shí)生長(zhǎng)后，將全部量的培養(yǎng)物在4℃下以3500rpm離心20分鐘。傾出上清液，如果不立即分析，將培養(yǎng)液和細(xì)胞(用無(wú)菌雙蒸水沖洗一次)分別在-80℃下凍存。根據(jù)Novagen方案用Novagen BugBusterTM試劑和benzonase核酸酶以及Calbiochem蛋白酶抑制劑混合物III制備細(xì)胞提取物用于蛋白質(zhì)分析。通過(guò)SDS-PAGE用4-15％梯度凝膠(Bio-Rad，Hercules，CA)分析細(xì)胞提取物中的蛋白質(zhì)表達(dá)水平。
一旦確定合適的引起富含組氨酸的蛋白質(zhì)最大表達(dá)的誘導(dǎo)條件(例如時(shí)間和溫度)，則在該條件下培養(yǎng)細(xì)胞，并將細(xì)胞沉淀重懸在適當(dāng)量的合適等滲緩沖液例如生理鹽水(0.85％NaCl pH 7.0)中。然后用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，例如在弗氏壓碎器中處理，將該細(xì)胞懸液裂解。4℃下以10000-15000rpm將裂解的細(xì)胞離心20-30分鐘，以分離生物質(zhì)和細(xì)胞碎片，并產(chǎn)生含有富含組氨酸的蛋白質(zhì)的無(wú)細(xì)胞提取液。將含有富含組氨酸的蛋白質(zhì)的提取液進(jìn)行噴霧干燥，以產(chǎn)生富含組氨酸的蛋白質(zhì)的產(chǎn)品，其可原樣加入動(dòng)物飼料中，或進(jìn)行適當(dāng)包封后加入動(dòng)物飼料中以確?；钚缘赝ㄟ^(guò)瘤胃。
如果必要的話，可對(duì)來(lái)自大腸桿菌BL21(DE3)∷HEPpET30(Xa/LIC)細(xì)胞的富含組氨酸的蛋白質(zhì)進(jìn)行純化或濃縮?？墒褂梦墨I(xiàn)所述或下面的方法將產(chǎn)生的富含組氨酸的蛋白質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步的濃縮和純化。
可如下構(gòu)建組氨酸t(yī)RNA合成酶構(gòu)建體HisSpET30(Xa/LIC)。設(shè)計(jì)具有與pET30(Xa/LIC)載體(Novagen，Madison，WI)相容的突出端的引物以克隆大腸桿菌組氨酸t(yī)RNA合成酶基因(HisS)。pET載體在Xa/LIC位點(diǎn)的5′端具有12個(gè)堿基的單鏈突出端，且在Xa/LIC位點(diǎn)的3′端具有15個(gè)堿基的單鏈突出端。將所述質(zhì)粒設(shè)計(jì)成不需要連接的克隆，具有N-末端His和S-標(biāo)記以及任選的C-末端His-標(biāo)記。Xa蛋白酶識(shí)別部位(IEGR)位于感興趣基因起始密碼子的前面，這樣可去除融合蛋白質(zhì)標(biāo)記。
可購(gòu)得下列用于大腸桿菌組氨酸t(yī)RNA合成酶基因pET30Xa/LIC克隆的引物正 向5′-GGTATTGAGGGTCGCGTGGCAAAAAACATTCAAGC-3′和反向5′-5′AGAGGAGAGTTAGAGCCTTAACCCAGTAACGTGCGCA-3′。
表5提供了大腸桿菌HisS基因的核酸序列，登記號(hào)M1 1843 J01629，表6中提供了用于編碼多肽的氨基酸序列。
表3大腸桿菌組氨酸t(yī)RNA合成酶(hisS)的DNA序列1 gatatgatcg accagctgga agcacgcatt cgtgcgaaag ccagtcagct ggacgaagcg61 cgtcgaattg acgttcagca ggttgaaaaa taataacgtg atgggaagcg cctcgcttcc121 cgtgtatgat tgaacccgca tggctcccga aacattgagg gaagcgttga gggttcattt181 ttatattcag aaagagaata aacgtggcaa aaaacattca agccattcgc ggcatgaacg241 attacctgcc tggcgaaacg gccatctggc agcgcattga aggcacactg aaaaacgtgc301 tcggcagcta cggttacagt gaaatccgct tgccgattgt agagcagacc ccgctattca361 aacgtgcgat tggtgaagtc accgacgtgg ttgaaaaaga gatgtacacc tttgaggatc421 gcaatggcga cagcctgact ctgcgccctg aagggacggc gggctgtgta cgcgccggca481 tcgagcatgg tcttctgtac aatcaggaac agcgtctgtg gtatatcggg ccgatgttcc541 gtcacgagcg tccgcagaaa gggcgttatc gtcagttcca tcagttgggc tgcgaagttt601 tcggtctgca aggtccggat atcgacgctg aactgattat gctcactgcc cgctggtggc661 gcgcgctggg tatttccgag cacgtaactc ttgagctgaa ctctatcggt tcgctggaag721 cacgcgccaa ttaccgcgat gcgctggtgg cattccttga gcagcataaa gaaaagctgg781 acgaagactg caaacgccgc atgtacacta acccgctgcg cgtgctggat tcaaaaaatc841 cggaagtgca ggcgcttctc aacgacgctc cggcattagg tgactatctg gacgaggaat901 ctcgtgagca ttttgccggt ctgtgcaaac tgctggagag cgcggggatc gcttacaccg961 taaaccagcg tctggtgcgt ggtctggatt actacaaccg taccgttttc gagtgggtga1021 ctaacagtct cggctcccag ggcaccgtgt gtgcaggcgg tcgttatgac ggtcttgtgg1081 aacaactggg cggtcgtgca acaccggctg tcggttttgc tatgggcctc gaacgtcttg1141 tattgttagt acaggccgtt aatccggaat ttaaagccga tcctgttgtc gatatatacc1201 tggtggcttc aggtgctgat acacaatctg cggctatggc attagctgag cgtctgcgtg1261 atgaattacc gggcgtgaaa ttgatgacca accacggcgg cggcaacttt aagaaacagt1321 ttgcccgtgc tgataaatgg ggtgcccgcg ttgctgtggt gctgggtgag tctgaagtgg1381 ctaacggcac agcagtagtg aaggatttgc gctctggtga gcaaacggca gttgcgcagg1441 atagcgtagc cgcgcatttg cgcacgttac tgggttaagg aaggagaagg acagcgtgga1501 aatttacgag aacgaaaacg accaggtaga gcggttaaac gcttttttgc tgaaaatggc1561 aaagcactgg ctgttggggt gattttggcg ttggcgcact gattggctgg cgctactgga1621 acagccatca ggttgattct gcacgctccg cttctcttgc ctatcaaaat gcggttacc
表4大腸桿菌組氨酸t(yī)RNA合成酶(hisS)的氨基酸序列MAKNIQAIRGMNDYLPGETAIWQRIEGTLKNVLGSYGYSEIRLPIVEQTPLFKRAIGEVTDVVEKEMYTFEDRNGDSLTLRPEGTAGCVRAGIEHGLLYNQEQRLWYIGPMFRHERPQKGRYRQFHQLGCEVFGLQGPDIDAELIMLTARWWRALGISEHVTLELNSIGSLEARANYRDALVAFLEQHKEKLDEDCKRRMYTNPLRVLDSKNPEVQALLNDAPALGDYLDEESREHFAGLCKLLESAGIAYTVNQRLVRGLDYYNRTVFEWVTNSLGSQGTVCAGGRYDGLVEQLGGRATPAVGFAMGLERLVLLVQAVNPEFKADPVVDIYLVASGADTQSAAMALAERLRDELPGVKLMTNHGGGNFKKQFARADKWGARVAVVLGESEVANGTAVVKDLRSGEQTAVAQDSVAAHLRTLLG由ATCC購(gòu)得大腸桿菌ATCC 10798的大腸桿菌基因組DNA，編號(hào)為10798D。從New England BioLabs(Beverly，MA)購(gòu)得所有限制性酶。除非另外說(shuō)明，通過(guò)Intergrated DNA Technologies，Inc(Coralville，IA)合成引物。
下面是PCR方案的一種版本，其用于擴(kuò)增大腸桿菌HisS基因。在50μL的反應(yīng)中，加入0.1-0.5μg模板、各引物1.5μM、各dNTP 0.4mM、3.5 U Expand high fidelityTM聚合酶和含Mg2+的1×ExpandTM緩沖液(Roche，Indianapolis，IN)。所選的溫度循環(huán)程序包括在96℃下熱啟動(dòng)5分鐘，隨后進(jìn)行29個(gè)循環(huán)，該循環(huán)包括下列步驟94℃30秒、40-65℃ 1分鐘(梯度溫度循環(huán))和72℃ 2分鐘30秒。29個(gè)循環(huán)后，將樣品保持在72C下10分鐘，然后在4℃下儲(chǔ)存。
PCR產(chǎn)物使用Qiagen凝膠提取試劑盒(Valencia，CA)用0.8或1％TAE-瓊脂糖凝膠進(jìn)行凝膠純化。PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上與標(biāo)準(zhǔn)品比較定量，然后按下述廠商推薦的Ligation Independent Cloning方案(Novagen，Madison，WI)用T4 DNA聚合酶處理。
簡(jiǎn)要地，將約0.2pmol純化的PCR產(chǎn)物在22℃下在dGTP存在下用1 U T4 DNA聚合酶處理30分鐘。該聚合酶從PCR產(chǎn)物的3′端除去連續(xù)的堿基。當(dāng)聚合酶遇到鳥(niǎo)嘌呤殘基時(shí)，該酶的5′至3′聚合酶活性抵消了核酸外切酶活性，以有效地防止進(jìn)一步切除。由此產(chǎn)生了與所述pET Xa/LIC載體相容的單鏈突出端。通過(guò)在75℃下溫育20分鐘鈍化聚合酶。
按Novagen的建議將載體和處理的插入物退火。將約0.02pmol處理的插入物和0.01pmol的載體在22℃下溫育5分鐘；加入6.25mMEDTA(終濃度)；并再在22℃下溫育。將退火反應(yīng)物(1μL)加入NovaBlueTMSingles感受態(tài)細(xì)胞(Novagen，Madison，WI)中，然后在冰上放置5分鐘?；旌虾?，將細(xì)胞在42℃下熱休克30秒進(jìn)行轉(zhuǎn)化。將細(xì)胞放在冰上2分鐘，然后在37℃下以225rpm搖動(dòng)使其在250μL的室溫SOC中恢復(fù)30分鐘。將細(xì)胞鋪在含有卡那霉素(25-50μg/mL)的LB板上。
將來(lái)自在含有卡那霉素的LB板上生長(zhǎng)的培養(yǎng)物的質(zhì)粒DNA用Qiagen spin miniprep試劑盒(Valencia，CA)純化，并篩選正確的插入物。通過(guò)雙脫氧鏈終止DNA測(cè)序(Seq Wright，Houston，TX)用S-標(biāo)記和T7終止子引物(Novagen)和內(nèi)部引物驗(yàn)證看起來(lái)具有正確插入物的質(zhì)粒序列。將序列驗(yàn)證的HisSpET30(Xa/LIC)根據(jù)Novagen方案轉(zhuǎn)化入表達(dá)宿主BL21(DE3)中。
發(fā)酵實(shí)驗(yàn)后，可如下純化富含組氨酸的蛋白質(zhì)或肽。首先將表達(dá)富含組氨酸的蛋白質(zhì)或肽的細(xì)胞使用文獻(xiàn)已知的方法，例如在表壓960psi(細(xì)胞內(nèi)～19000psi)下多次通過(guò)弗氏壓碎器來(lái)進(jìn)行破碎。在4℃下以15000rpm離心將細(xì)胞碎片與富含組氨酸的蛋白質(zhì)分離。無(wú)細(xì)胞提取液或上清液中含有富含組氨酸的蛋白質(zhì)，使用其它方法以特異地結(jié)合富含組氨酸的蛋白質(zhì)，并將其與無(wú)細(xì)胞提取液中的其它蛋白質(zhì)分離。
一種純化富含組氨酸的蛋白質(zhì)的方法是基于組氨酸標(biāo)記序列結(jié)合組氨酸結(jié)合樹(shù)脂的能力，通過(guò)使富含組氨酸的蛋白質(zhì)與樹(shù)脂結(jié)合，并進(jìn)行金屬螯合色譜技術(shù)來(lái)進(jìn)行?？蓮腘ovagen商購(gòu)獲得“His BindKit”。將富含組氨酸的蛋白質(zhì)的組氨酸殘基和/或富含組氨酸片段與固定在組氨酸結(jié)合樹(shù)脂上的Ni2+陽(yáng)離子結(jié)合。洗掉非結(jié)合的蛋白質(zhì)，并可用咪唑洗脫來(lái)回收富含組氨酸的蛋白質(zhì)。可對(duì)富含組氨酸的蛋白質(zhì)進(jìn)行透析以除去咪唑，然后進(jìn)行濃縮或噴霧干燥，以原樣加入飼料組合物中，或進(jìn)行適當(dāng)?shù)奶幚砑尤腼暳辖M合物中以使瘤胃中的降解最小化。
除用發(fā)酵系統(tǒng)生產(chǎn)富含組氨酸的產(chǎn)品外，還可用轉(zhuǎn)基因植物系統(tǒng)生產(chǎn)富含組氨酸的產(chǎn)品。本領(lǐng)域公知制備轉(zhuǎn)基因植物系統(tǒng)的方法。
組氨酸和富含組氨酸產(chǎn)品的瘤胃保護(hù)?？蓪?duì)組氨酸和/或富含組氨酸的產(chǎn)品(即組分)進(jìn)行處理和/或包衣或包封，以減少在瘤胃中的降解(即促進(jìn)過(guò)瘤胃)。合適的包衣可具有如下所述的相對(duì)高的熔解溫度。
合適的包衣可包括疏水性高熔點(diǎn)化合物和脂質(zhì)的混合物。一種或多種疏水性高熔點(diǎn)化合物(例如脂肪酸的無(wú)機(jī)鹽，如商品級(jí)的硬脂酸鋅)與一種或多種脂質(zhì)組合，生成能夠保護(hù)被包衣組分的含量和功能的包衣材料?？蓪⑦@些包衣配制成滿足高溫和加壓工藝條件的需要，并保護(hù)有效負(fù)荷的氨基酸免于瘤胃的微生物環(huán)境破壞。美國(guó)專利2003/0148013描述了合適的包衣，該文獻(xiàn)全文引入本文作為參考。
疏水性高熔點(diǎn)化合物一般具有至少約70℃的熔點(diǎn)，更理想地，大于100℃的熔點(diǎn)。特別地，熔點(diǎn)為約115℃至130℃的脂肪酸的鋅鹽是適合的疏水性高熔點(diǎn)化合物。
所述脂質(zhì)組分一般具有至少約0℃，更合適地不低于約40℃的熔點(diǎn)。所述脂質(zhì)組分可包括植物油例如大豆油。在其它實(shí)施方案中，所述脂質(zhì)組分可為熔點(diǎn)約45-75℃的三酰甘油?？蛇x用商品級(jí)硬脂酸作為代表性脂質(zhì)，所述硬脂酸包括但不限于硬脂酸、氫化動(dòng)物脂、動(dòng)物脂(例如牛脂)、植物油(例如天然植物油和/或氫化植物油，部分或完全氫化的植物油)、卵磷脂、軟脂酸、動(dòng)物油、蠟、脂肪酸酯(C8至C24)、脂肪酸(C8至C24)。
相對(duì)于被包衣組分的重量，所述包衣在包衣產(chǎn)品中的量可為1-2000重量％。通常，相對(duì)于被包衣組分的重量，所述包衣為約15至85重量％。更一般地，相對(duì)于被包衣組分的重量，所述包衣為約20至60重量％，和/或30至40重量％。所述包衣可由疏水性混合物制備。所述包衣可包含表面活性劑。
所述包衣可使用一種或多種疏水性不溶性化合物與脂質(zhì)組合。例如，商品級(jí)硬脂酸鋅極其疏水，且完全不溶于水。將商品級(jí)硬脂酸鋅加入所述包衣制劑中，與僅僅脂質(zhì)包衣相比，可以顯著提高所述組分及其功能的保護(hù)水平。例如，通過(guò)將硬脂酸鋅與有些不溶的脂質(zhì)例如商品級(jí)硬脂酸組合，當(dāng)所述包衣產(chǎn)品處于水介質(zhì)中時(shí)，所述包衣化合物可以提供更好地保護(hù)免于淋失(即包衣產(chǎn)品中活性成份的損失)。因而本發(fā)明的包衣組合物的優(yōu)點(diǎn)可以在設(shè)計(jì)用于反芻動(dòng)物過(guò)瘤胃并將活性成份遞送到小腸的飼料中利用。
除了促進(jìn)過(guò)瘤胃之外，所述包衣還用于在生產(chǎn)過(guò)程(制粒和擠出)中保護(hù)被包衣的組分免于經(jīng)受熱和壓力。所述包衣組合物可用于施加熱且使用熱敏感組分的各種生產(chǎn)方法中。可受益于這種保護(hù)形式的組分是那些受熱破壞或降解的組分，例如氨基酸、蛋白質(zhì)、酶、維生素、色素和引誘劑。
除保護(hù)組分免受與熱有關(guān)的損壞或損失外，還需要保護(hù)組分免受由于與其它組分締合或發(fā)生化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的損壞或損失。所述包封方法可防止與其它組分的有害締合。因而，所述包封方法提供預(yù)包裝或?qū)⒅苿┲薪M分組合的能力，其中所述組分通常單個(gè)包裝。
可通過(guò)多種方法制備所述包衣組合物。優(yōu)選地，所述制備方法包括制備鋅有機(jī)鹽組分和脂質(zhì)組分的固體溶液。在一實(shí)施方案中，可將所述鋅有機(jī)鹽和所述脂質(zhì)組分熔化直至兩者溶解形成溶液。然后可將所述溶液固化形成固體溶液。
除所述鋅有機(jī)酸組分和所述脂質(zhì)組分之外，所述包衣可包含其它組分。例如，所述包衣可包含一種或多種乳化劑，例如甘油、多糖、卵磷脂、膠凝劑和肥皂，它們可以提高所述包封方法的速度和效率。另外，所述包衣可包含抗氧化劑以提供改善的抗氧化效果。另外，所述包衣組合物可包含在形成所述固體溶液中可溶或不溶的其它組分。例如，所述包衣組合物可包含少量的氧化鋅及其它元素或化合物。
可由部分氫化的植物油例如大豆油制備合適的包衣。其它合適的至少部分氫化的植物油包括棕櫚油、棉籽油、玉米油、花生油、棕櫚油、巴巴蘇油、向日葵油、紅花油及其混合物。
可由包含部分氫化的植物油和另外的組分例如蠟的混合物制備合適的包衣。合適的蠟包括蜂蠟、石油蠟、米糠蠟、蓖麻蠟、微晶蠟及其混合物。在一些實(shí)施方案中，由包含約85-95％部分氫化的植物油(優(yōu)選為約90％)和約5-15％蠟(優(yōu)選為約10％)的混合物制備合適的包衣。
所述包衣可包含改變所述被包衣基質(zhì)密度的試劑，例如表面活性劑，如聚山梨糖醇酯60、聚山梨糖醇酯85、丙二醇、丁二酸二辛酯磺酸鈉、十二烷基硫酸鈉、脂肪酸乳酰酯、脂肪酸聚甘油酯及其混合物。
可通過(guò)在包含L-組氨酸和/或富含組氨酸的蛋白質(zhì)的基質(zhì)上噴霧包含部分氫化植物油(85％-95％)和蠟(5％-15％)的疏水性混合物來(lái)制備包衣基質(zhì)(或預(yù)包衣基質(zhì))。任選地，可對(duì)所述預(yù)包衣基質(zhì)的表面用表面活性劑噴霧以進(jìn)行進(jìn)一步包衣，形成所述包衣基質(zhì)。所述包衣基質(zhì)可具有下列組成基質(zhì)(40-80％)；疏水性混合物(20-60％)；表面活性劑(0-40％)(任選)。所述包衣基質(zhì)的比重為約0.3-2.0(更適當(dāng)?shù)貫榧s1.3-1.5)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述包衣基質(zhì)包含約50％基質(zhì)；約35％疏水性混合物和約15％表面活性劑。可用疏水性混合物對(duì)所述基質(zhì)進(jìn)行預(yù)包衣，然后用表面活性劑對(duì)所述預(yù)包衣基質(zhì)進(jìn)行包衣來(lái)制備所述包衣基質(zhì)。
制備所述包衣組合物后，可以用其來(lái)制備被保護(hù)的組分。制備所述被保護(hù)組分的一種合適方法使用包封技術(shù)，優(yōu)選微型包封技術(shù)。微型包封是一種將微量氣體、液體或固體組分用第二種材料，在本文中是包衣組合物，封入或圍繞的方法，以保護(hù)所述組分免受周圍環(huán)境破壞。大量微型包封方法可用于制備所述被保護(hù)的組分，例如旋轉(zhuǎn)盤(spinning disk)、噴霧、共擠出以及其它化學(xué)方法例如復(fù)合凝聚、相分離和膠凝方法。一種合適的微型包封方法為旋轉(zhuǎn)盤法。在旋轉(zhuǎn)盤法中，制備所述活性成分和所述包衣組合物的乳液和/或懸浮液，并利用重力進(jìn)料至熱旋轉(zhuǎn)盤的表面上。當(dāng)盤旋轉(zhuǎn)時(shí)，所述乳液/懸浮液在盤的表面鋪展，由于離心力形成薄層。在盤的邊緣，所述乳液/懸浮液斷成不連續(xù)的液滴，在所述液滴中所述包衣包覆所述活性成分。當(dāng)該液滴由盤落入集料斗中時(shí)，所述液滴冷卻形成微型包封的組分(即包衣產(chǎn)品)。(例如參見(jiàn)圖2所示合適的旋轉(zhuǎn)盤包衣系統(tǒng)簡(jiǎn)圖)。由于所述乳液或懸浮液不通過(guò)板孔擠出，該方法可以使用較高粘度的包衣，并在包衣中可以有高負(fù)載量的所述組分。
美國(guó)專利公開(kāi)2003/0148013描述了用于動(dòng)物飼料的組分的包封，該文獻(xiàn)全文引入本文作為參考。
還可以對(duì)氨基酸(例如組氨酸)和/或蛋白質(zhì)(例如富含組氨酸的蛋白質(zhì))進(jìn)行化學(xué)改變以在瘤胃中保護(hù)所述氨基酸，并增加皺胃和小腸中特定氨基酸的供給。例如，已用甲硫氨酸羥基類似物(MHA)作為氨基酸補(bǔ)充物。另外，可以以氨基酸/礦物螯合物形式提供氨基酸。已用甲硫氨酸鋅和賴氨酸鋅絡(luò)合物作為氨基酸補(bǔ)充物。
可包含L-組氨酸和/或富含組氨酸的蛋白質(zhì)的組氨酸源可與還原碳水化合物反應(yīng)以保護(hù)組氨酸免于瘤胃降解(例如通過(guò)美拉德反應(yīng))。例如，L-組氨酸和/或富含組氨酸的蛋白質(zhì)可與還原糖反應(yīng)，該還原糖例如但不限于木糖、葡萄糖、果糖、乳糖、甘露糖、核糖及其混合物。糖來(lái)源可包括玉米產(chǎn)品和玉米產(chǎn)品的水解物(例如至少部分水解的玉米淀粉和/或改性玉米淀粉)、糖蜜和糖蜜水解物、半纖維素和半纖維素水解物、包含于亞硫酸廢液中的糖及其混合物。
包含L-組氨酸和/或富含組氨酸的蛋白質(zhì)的組氨酸源可與于反應(yīng)混合物中的還原糖反應(yīng)以生成處理的組氨酸源。然后可將所述處理的組氨酸源加入飼料組合物中?；蛘?，可將包含L-組氨酸和/或富含組氨酸的蛋白質(zhì)的組氨酸源加入飼料組合物中，以形成補(bǔ)充的飼料組合物。所述補(bǔ)充的飼料組合物可與于反應(yīng)混合物中的還原糖反應(yīng)以保護(hù)所述補(bǔ)充的飼料組合物中存在的氨基酸，其包括存在于所述組氨酸源中的氨基酸。
所述反應(yīng)混合物一般包含至少約1摩爾還原糖/1摩爾游離氨基酸。一般地，所述反應(yīng)混合物包含至少約3-5摩爾還原糖/1摩爾游離氨基酸。所述反應(yīng)混合物的pH一般為約4.0-10.5(合適地為約6.0-8.5)。所述反應(yīng)混合物的含水量一般為約6-40％(合適地為約15-25％)。通常將所述反應(yīng)混合物加熱到約20-150℃(合適地約80-110℃和/或約90-100℃)約0.5-72小時(shí)(合適地約1-4小時(shí))。所述反應(yīng)混合物可進(jìn)行加壓(例如壓力為約2000-3500KPa(約300-500p.s.i.))?？稍诩訜崴龇磻?yīng)混合物之前、期間或之后將所述反應(yīng)混合物加壓。所述反應(yīng)混合物可為擠出的和/或壓片的。
從提供被保護(hù)的產(chǎn)品的角度考慮，酵母可能是表達(dá)富含組氨酸的蛋白質(zhì)和/或氨基酸特別合適的宿主。已經(jīng)證明，賴氨酸累積酵母將賴氨酸從賴氨酸干重4％累積至15％。賴氨酸的大部分包含于液泡中，其用瘤胃液培養(yǎng)時(shí)是穩(wěn)定的，但當(dāng)接觸胃蛋白酶-皺胃的蛋白質(zhì)消化酶之一時(shí)立即釋放。因此，該有機(jī)體可能是表達(dá)蛋白質(zhì)和/或氨基酸并提供可增強(qiáng)可被腸吸收的蛋白質(zhì)和/或氨基酸量的被保護(hù)的飼料補(bǔ)充劑的有用的宿主。
具有增加含量的一種或多種必需氨基酸的飼料制劑。最初，使用經(jīng)驗(yàn)方法來(lái)產(chǎn)生泌乳牛所需的必需氨基酸需要量。將瘤胃微生物蛋白質(zhì)的必需氨基酸組成與奶蛋白質(zhì)的必需氨基酸組成相比較(表5)。(可對(duì)肌肉蛋白進(jìn)行同樣的比較，作為生長(zhǎng)、維持生活和繁殖所需氨基酸需要量的指示)。
然后將預(yù)計(jì)的限制氨基酸作為進(jìn)一步研究的候選物。一旦確定氨基酸的需要量，開(kāi)發(fā)一種滿足這些氨基酸需要量的方法。第一步是計(jì)算瘤胃中微生物氨基酸的產(chǎn)量。圖1中給出了氨基酸生產(chǎn)的微生物模式。通過(guò)微生物生長(zhǎng)測(cè)定微生物氨基酸的產(chǎn)量，而微生物生長(zhǎng)通過(guò)瘤胃中發(fā)酵的包括淀粉、中性洗滌纖維(“NDF”)、糖和殘余非纖維碳水化合物(“RNFC”)例如果膠和β-葡聚糖在內(nèi)的碳水化合物的濃度來(lái)測(cè)定。
為確定瘤胃微生物蛋白質(zhì)對(duì)動(dòng)物飲食的氨基酸的貢獻(xiàn)，將總瘤胃微生物蛋白質(zhì)乘以該蛋白質(zhì)中存在的每種特定氨基酸的百分比。許多研究人員已經(jīng)發(fā)現(xiàn)瘤胃微生物蛋白質(zhì)的氨基酸組成保持非常穩(wěn)定。細(xì)菌氨基酸的消化率假定為每種氨基酸的80％。然后從所述氨基酸需要量中減去由瘤胃微生物蛋白質(zhì)提供得到的氨基酸量。其差值(即所述需要量和由瘤胃微生物蛋白質(zhì)補(bǔ)充的所述氨基酸的差)表示作為未降解的必需氨基酸(UEAA)應(yīng)有利地補(bǔ)充在飼料中的氨基酸的量。
評(píng)價(jià)UEAA(或“繞過(guò)”氨基酸)含量高的飼料組分以確定有效的UEAA源。過(guò)去一般將血粉用作UEAA源。血粉也是良好的組氨酸源(表6)。
動(dòng)物氨基酸需要量。奶牛飼料中所需的氨基酸稱為奶可消化氨基酸(“ddAA”)?？上⑸锇被峒由贤话被岬目上鑫肝唇到獾谋匦璋被?UEAA)濃度總和為ddAA。奶可消化氨基酸表示補(bǔ)充到小腸的總的可消化AA。產(chǎn)奶動(dòng)物的總氨基酸需要量可按如下確定。所需氨基酸(“TAAR”)的總量等于維持生活所需的量(“維持氨基酸”或“MAA”)加上產(chǎn)奶所需的氨基酸量(“奶氨基酸產(chǎn)出”或“MAAO”)加上生長(zhǎng)所需的氨基酸量(“生長(zhǎng)氨基酸”或“GAA”)(即TAAR＝MAA+MAAO+GAA+GAA)。
包封。圖2所示的方法表示旋轉(zhuǎn)盤技術(shù)微型包封。其它微型包封方法包括噴霧、離心共擠出和化學(xué)方法。
該方法以制備所述包衣開(kāi)始，例如使用脂肪包衣使水溶性營(yíng)養(yǎng)物(nutrient)免于溶于水。在脂肪存儲(chǔ)槽中將所述包衣加熱到其熔點(diǎn)直至該包衣液化。所述營(yíng)養(yǎng)物一般為所制備的氨基酸、生物質(zhì)、肽或蛋白質(zhì)干粉。(在一些情況下，如果所述營(yíng)養(yǎng)物粒徑過(guò)大，可將該營(yíng)養(yǎng)物過(guò)篩(例如SWECO篩分機(jī)))。將營(yíng)養(yǎng)物放入容量給料器中，該容量給料器以恒定的速度遞送已知精確濃度的營(yíng)養(yǎng)物(例如干粉)。
使用計(jì)量泵以控制的速度將液體脂肪加入所述漿液容器中。選擇加入速度，以使該液體脂肪與所述營(yíng)養(yǎng)物以所選的比例組合。例如，如果包衣產(chǎn)品具有35％的營(yíng)養(yǎng)物，且以100lbs/小時(shí)的速度來(lái)生產(chǎn)該產(chǎn)品，必須以65lbs/小時(shí)的速度加入所述熔化的脂肪，且所述容量給料器必須以35lbs/小時(shí)的速度遞送營(yíng)養(yǎng)物。
在所述漿液容器中將所述熔化的脂肪和營(yíng)養(yǎng)物混合在一起，以生成乳液或懸浮液。從該容器底部排出該乳液/懸浮液，然后將其以一層施用到該容器下面的轉(zhuǎn)盤上。因?yàn)殡x心力該乳液/懸浮液在盤上鋪展。當(dāng)該層到達(dá)盤的邊緣時(shí)，該層斷成不連續(xù)的顆粒(即液滴或微囊)，顆粒中含有被所述包衣包覆的營(yíng)養(yǎng)物。當(dāng)所述顆粒從盤上落下時(shí)，所述包衣冷卻并固化。所述被包衣的顆粒落入所述集料斗中，并由該集料斗落到轉(zhuǎn)載輸送機(jī)上。該輸送機(jī)批量遞送所述高熔點(diǎn)包衣冷卻物和固化物。所述微囊落入所述集料斗中，沿該集料斗側(cè)壁向下，并向下落到轉(zhuǎn)載輸送機(jī)上。該輸送機(jī)批量遞送顆粒至大容量存儲(chǔ)器進(jìn)行進(jìn)一步包裝。
飼料制劑。飼料制劑中可包含具有增加含量的組氨酸的產(chǎn)品。表7-14提供了具有增加的組氨酸含量的飼料制劑的實(shí)例。
例如，表7給出了具有增加的組氨酸含量的全料的實(shí)例。表7列出了可用于制成該具有增加的組氨酸含量的示例性全料的飼料組分的相對(duì)量。該全料組合物包含組氨酸含量約10％的富含組氨酸的蛋白質(zhì)。表8列出了存在于表7所述的全料組合物中的大量常用營(yíng)養(yǎng)物的量。
表9給出了具有增加的蛋白質(zhì)含量的飼料濃縮物的實(shí)例。表9列出了可用于制成該具有增加的組氨酸含量的示例性飼料濃縮物的飼料組分的相對(duì)量。該飼料濃縮物包含組氨酸含量約10％的富含組氨酸的蛋白質(zhì)。表10列出了存在于表9所述的飼料濃縮物中的大量常用營(yíng)養(yǎng)物的量。

表11給出了具有增強(qiáng)的瘤胃保護(hù)的組氨酸含量的補(bǔ)充物的一個(gè)實(shí)例。表11列出了可用于制成該示例性補(bǔ)充物的飼料組分的相對(duì)量。該補(bǔ)充物包含瘤胃保護(hù)的組氨酸源，例如瘤胃保護(hù)的組氨酸和/或組氨酸含量約為10％的富含瘤胃保護(hù)的組氨酸的蛋白質(zhì)。表12列出了存在于表11所述的補(bǔ)充物中的大量常用營(yíng)養(yǎng)物的量。
表13給出了具有增強(qiáng)的瘤胃保護(hù)的組氨酸含量的全料組合物的一個(gè)實(shí)例。表13列出了可用于制成該示例性飼料組合物的飼料組分的相對(duì)量。該飼料組合物包含瘤胃保護(hù)的組氨酸源，例如瘤胃保護(hù)的組氨酸和/或組氨酸含量約為10％的富含瘤胃保護(hù)的組氨酸的蛋白質(zhì)。表14列出了存在于表13所述的飼料組合物中的大量常用營(yíng)養(yǎng)物的量。

例證性實(shí)施方案以下實(shí)施方案是例證性的，不應(yīng)理解為限制權(quán)利要求
的范圍。
在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種飼料組合物。該飼料組合物包含組氨酸源和至少一種附加營(yíng)養(yǎng)組分。該組氨酸源包含L-組氨酸和來(lái)自產(chǎn)組氨酸微生物發(fā)酵的發(fā)酵成分。所述飼料組合物含有組氨酸含量為至少約2.8重量％的粗蛋白質(zhì)部分。一般地，該飼料組合物的粗蛋白質(zhì)部分中組氨酸含量為約2.8-7.0重量％、2.8-5.0重量％，在合適的實(shí)施方案中為約3.0-4.0重量％。
在一些實(shí)施方案中，所述粗蛋白質(zhì)部分可以占所述飼料組合物的至少約10重量％。一般地，該粗蛋白質(zhì)部分占所述飼料組合物至少約14-19重量％。
至少部分該組氨酸源可以被保護(hù)而免于被瘤胃降解。例如，存在于該組氨酸源中的L-組氨酸可與還原碳水化合物反應(yīng)，和/或用包衣混合物包衣。該包衣混合物可以包含至少一種脂肪酸。該包衣混合物可包含部分氫化的植物油(例如大豆油)和/或表面活性劑。
所述發(fā)酵成分可包含來(lái)自所述產(chǎn)組氨酸微生物發(fā)酵中生成的發(fā)酵液的可溶和/或不可溶成分。所述發(fā)酵成分可包含來(lái)自所述產(chǎn)組氨酸微生物發(fā)酵中生成的發(fā)酵液的溶解和/或未溶解的成分。所述發(fā)酵成分可包含所述產(chǎn)組氨酸微生物發(fā)酵中生成的生物質(zhì)。
在一些實(shí)施方案中，所述產(chǎn)組氨酸微生物為棒狀桿菌。在其它的實(shí)施方案中，所述產(chǎn)組氨酸微生物為短桿菌。
在一些實(shí)施方案中，所述組氨酸源為瘤胃保護(hù)的，且所述飼料組合物能夠提供過(guò)瘤胃的、期望量的存在于瘤胃保護(hù)的組氨酸源中的組氨酸。例如，在一些實(shí)施方案中，所述飼料組合物能夠提供至少約50％的過(guò)瘤胃的瘤胃保護(hù)的組氨酸。例如，存在于瘤胃保護(hù)的組氨酸源中的約1g組氨酸可導(dǎo)致約500mg存在于該瘤胃保護(hù)的組氨酸源中的組氨酸被過(guò)瘤胃遞送。在其它實(shí)施方案中，至少約60％、70％存在于該瘤胃保護(hù)的組氨酸源中的組氨酸能夠被過(guò)瘤胃遞送，在合適的實(shí)施方案中，80％存在于該瘤胃保護(hù)的組氨酸源中的組氨酸能夠被過(guò)瘤胃遞送。
在另一實(shí)施方案中，提供了一種飼料組合物。所述飼料組合物包含組氨酸源和至少一種附加的營(yíng)養(yǎng)物化合物。該組氨酸源包含L-組氨酸和來(lái)自產(chǎn)組氨酸微生物發(fā)酵的發(fā)酵成分。所述組氨酸源中的組氨酸以游離氨基酸計(jì)含量為至少約10克/千克干固體。
至少部分該組氨酸源可被保護(hù)而免于被瘤胃降解。在一些實(shí)施方案中，至少約50％、60％、70％存在于該瘤胃保護(hù)的組氨酸源中的組氨酸能夠被過(guò)瘤胃遞送，在合適的實(shí)施方案中，80％存在于該瘤胃保護(hù)的組氨酸源中的組氨酸能夠被過(guò)瘤胃遞送。
在另一實(shí)施方案中，提供了一種飼料組合物。該飼料組合物包含瘤胃保護(hù)的組氨酸源和至少一種附加營(yíng)養(yǎng)組分。該瘤胃保護(hù)的組氨酸源包含瘤胃保護(hù)的L-組氨酸和/或非動(dòng)物源的富含瘤胃保護(hù)的組氨酸的蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，至少約50％、60％、70％存在于該瘤胃保護(hù)的組氨酸源中的組氨酸能夠被過(guò)瘤胃遞送，在合適的實(shí)施方案中，80％存在于該瘤胃保護(hù)的組氨酸源中的組氨酸能夠被過(guò)瘤胃遞送。
在一些實(shí)施方案中，所述組氨酸源中的組氨酸以游離氨基酸計(jì)含量為至少約10克/千克干固體。存在于瘤胃保護(hù)的組氨酸源中的富含組氨酸的蛋白質(zhì)的組氨酸含量相對(duì)于該蛋白質(zhì)中的氨基酸總量可為至少約10％。
在一些實(shí)施方案中，所述瘤胃保護(hù)的L-組氨酸和/或非動(dòng)物源的富含瘤胃保護(hù)的組氨酸的蛋白質(zhì)與至少一種還原糖(例如乳糖和/或木糖)反應(yīng)。在一些實(shí)施方案中，將所述瘤胃保護(hù)的L-組氨酸和/或非動(dòng)物源的富含瘤胃保護(hù)的組氨酸的蛋白質(zhì)用包含至少一種脂肪酸的包衣混合物包衣。該包衣混合物可包含部分氫化的植物油(例如大豆油)和/或表面活性劑。
在其它的實(shí)施方案中，提供一種飼料組合物。所述飼料組合物包含具有至少約40重量％(基于干固體計(jì))L-組氨酸游離氨基酸的瘤胃保護(hù)的組氨酸源。所述飼料組合物可具有組氨酸含量為至少約2.8重量％的粗蛋白質(zhì)部分。在一實(shí)施方案中，所述飼料包含組氨酸含量為約2.8至7.0重量％的粗蛋白質(zhì)部分。
所述瘤胃保護(hù)的組氨酸源可包含來(lái)自產(chǎn)組氨酸微生物發(fā)酵的發(fā)酵成分。
在一些實(shí)施方案中，通過(guò)將所述組氨酸源與至少一種還原糖反應(yīng)將所述組氨酸源進(jìn)行瘤胃保護(hù)以提供瘤胃保護(hù)的組氨酸源。該還原糖可包括乳糖和/或木糖。
所述組氨酸源可用含有至少一種脂肪酸的包衣混合物包衣，以提供瘤胃保護(hù)的組氨酸源。例如，所述組氨酸源可用包含部分氫化的植物油例如大豆油的疏水性混合物進(jìn)行包衣。該疏水性混合物可包含蠟例如蜂蠟。該組氨酸源可用表面活性劑包衣。在一些實(shí)施方案中，將該組氨酸源用疏水性混合物包衣，然后用表面活性劑包衣。
在一些實(shí)施方案中，當(dāng)給反芻動(dòng)物喂食所述飼料組合物時(shí)，至少約50％的存在于瘤胃保護(hù)的組氨酸源中的組氨酸能夠被過(guò)瘤胃遞送。更通常地，當(dāng)給反芻動(dòng)物喂食所述飼料組合物時(shí)，至少約60％、70％的存在于瘤胃保護(hù)的組氨酸源中的組氨酸能夠被過(guò)瘤胃遞送，在合適的實(shí)施方案中，80％的存在于瘤胃保護(hù)的組氨酸源中的組氨酸能夠被過(guò)瘤胃遞送。
實(shí)施例美拉德反應(yīng)方案
1.將等量的糖(1.5g木糖、果糖、乳糖或葡萄糖)和氨基酸(1.5g組氨酸或賴氨酸)放入50ml離心管中。加入水(0.9ml)，并將該管加帽。在80℃的水浴中將這些管溫育達(dá)2小時(shí)。將樣品冷凍干燥，然后再溶解在40ml H2O中。通過(guò)測(cè)量在420nm處的吸光度來(lái)檢測(cè)美拉德反應(yīng)產(chǎn)物。如果必要，將樣品用水稀釋，以獲得小于2.0吸光單位的吸光度。
2.將組氨酸(0.g)和雙醛淀粉(0.5g)溶于在50ml離心管中的10ml0.05M磷酸鈉緩沖液(pH 8.0)中。將該管加帽，并在65℃或100℃下培養(yǎng)達(dá)4小時(shí)。將溶解的美拉德產(chǎn)物在4℃下儲(chǔ)存。通過(guò)測(cè)量在420nm處的吸光度來(lái)檢測(cè)美拉德反應(yīng)產(chǎn)物。如果必要，將樣品用水稀釋，以獲得小于2.0吸光單位的吸光度。
測(cè)定美拉德-保護(hù)的組氨酸的體內(nèi)降解用使用鈷(CoII)作為瘤胃流動(dòng)標(biāo)記來(lái)跟蹤美拉德-保護(hù)的組氨酸(其已與乳糖反應(yīng))流出瘤胃的技術(shù)來(lái)測(cè)定游離氨基酸的體內(nèi)降解。相對(duì)于瘺管牛(fistulated cow)中CoII流出量評(píng)價(jià)美拉德-保護(hù)的組氨酸的損失。將游離組氨酸或由美拉德反應(yīng)方案修飾的組氨酸和鈷II一起引入瘺管牛中。將所述組氨酸或修飾的組氨酸引入牛中后，定時(shí)地取出瘤胃液樣品，并使用Roth(1971)，Anal.Chem.43880描述的鄰苯二甲醛測(cè)定法來(lái)測(cè)定組氨酸的量。使用電感耦合等離子體發(fā)射光譜測(cè)定CoII的量。以與CoII結(jié)合(related)的組氨酸的量對(duì)時(shí)間作圖以計(jì)算游離和保護(hù)的組氨酸的降解系數(shù)(Kd)。測(cè)得游離組氨酸的降解系數(shù)為Kd＝0.75-0.95/小時(shí)。測(cè)得由美拉德反應(yīng)方案修飾的組氨酸的降解系數(shù)為Kd＝0.17/小時(shí)。
包衣組氨酸的制備通過(guò)以下制備包衣組氨酸用部分氫化的大豆油和蠟的混合物噴霧商品級(jí)L-組氨酸以制備預(yù)包衣的L-組氨酸基質(zhì)。然后將所述預(yù)包衣L-組氨酸基質(zhì)使用基本上美國(guó)專利5,190,775；6,013,286和6,106,871描述的方法用表面活性劑進(jìn)行包衣，這些文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容引入本文作為參考。
測(cè)定包衣組氨酸的體外降解體外組氨酸降解和體外賴氨酸降解。向帶橡皮塞的16×100mm管中加入不同量的游離賴氨酸和組氨酸(來(lái)自100mM儲(chǔ)備液)。最終的組氨酸和賴氨酸濃度為從0至5mM。向帶橡皮塞的25×150mm管中加入不同量的包衣組氨酸和包衣賴氨酸(稱重)。最終的組氨酸和賴氨酸濃度為從0至5mM。
收集2頭禁食的奶牛的瘤胃液，并(在CO2下)濾過(guò)4層干酪包布。在重復(fù)移液器(repeat pipetor)(在39℃下保持)中，將300ml濾過(guò)的瘤胃液加入700ml McDougall緩沖液中。將2ml瘤胃液溶液加入游離氨基酸管中，并包封容量為10ml的氨基酸管。將這些管用CO2沖洗，用橡皮塞加帽，然后在39℃的水浴中放置30分鐘。通過(guò)加入0.2ml或1ml 55％偏磷酸(MPA)使MPA終濃度為5％來(lái)停止反應(yīng)。
將游離氨基酸反應(yīng)物轉(zhuǎn)移到12×75mm離心管中，并在4℃下以9000rpm旋轉(zhuǎn)10分鐘。將上清液轉(zhuǎn)移至13×100mm管中，并在4℃下儲(chǔ)存直至測(cè)試。包衣氨基酸反應(yīng)將0.2ml轉(zhuǎn)移至微量管中，并旋轉(zhuǎn)5分鐘，RT，速度為#14。將上清液轉(zhuǎn)移至干凈的微量管中，并在4℃下儲(chǔ)存直至測(cè)試(管A)。將剩余的反應(yīng)物在80℃的水浴中溫育5分鐘，以熔化顆粒并釋放出保護(hù)的氨基酸。將一毫升所述反應(yīng)物轉(zhuǎn)移至12×75mm離心管中，并在4℃下以9000rpm旋轉(zhuǎn)10分鐘。將上清液轉(zhuǎn)移至13×100mm管中，并在4℃下儲(chǔ)存直至測(cè)試(管B)。[B中的[氨基酸]-A中的[氨基酸]＝被保護(hù)的量。
使用Pauly測(cè)試法(參見(jiàn)SOP)測(cè)定游離組氨酸的濃度。使用LysOxidase測(cè)定法(參見(jiàn)SOP)測(cè)定游離賴氨酸的濃度。以氨基酸降解速度(V，μmol/ml/hr)對(duì)起始氨基酸濃度(So，μmol/ml)作圖。該數(shù)據(jù)擬合Hill方程v＝Vmax[S]h/(K′+[S]h)。圖7顯示了游離組氨酸和包衣組氨酸的結(jié)果。
在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的前一晚制備McDougall溶液(不含CaCl2)。McDougall緩沖液(1升)S-8875碳酸氫鈉(NaHCO3)(9.8g)；S-0876磷酸氫二鈉(Na2HPO4*7H2O)(7.0g或3.71g無(wú)水的Na2HPO4)；P-4504氯化鉀(KCl)(0.57g)；S271-500氯化鈉(NaCl)(0.47g)；M-1880硫酸鎂(MgSO4*7H2O)(0.12g)；C-5080氯化鈣(CaCl2)(0.04g，在使用前加入)；用CO2起泡器(Bubble)鼓泡使pH為6.8-7.2。在實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，每升McDougall加入1.45g麥芽糖；每升McDougall加入1.45g纖維二糖。每升SRP大約加入0.525mL BME。該定量溶液包含70％McDougall、30％SRF。
測(cè)定包衣組氨酸的體內(nèi)降解用該試驗(yàn)測(cè)定四個(gè)不同來(lái)源的AA的腸內(nèi)消化率。分別用部分氫化的植物油包衣組氨酸和賴氨酸晶體，以測(cè)試它們分別與組氨酸(HCl)和賴氨酸(HCl)相比的消化率。組氨酸(HCl)包含74.3重量％組氨酸，而包衣產(chǎn)品包含40重量％組氨酸。賴氨酸(HCl)包含78.8重量％賴氨酸，而包衣產(chǎn)品包含45重量％賴氨酸。
為該試驗(yàn)，以低水平加入測(cè)試顆粒。用對(duì)照膳食作空白來(lái)測(cè)定內(nèi)源損失，并計(jì)算組氨酸和賴氨酸的消化率。該對(duì)照膳食分別使用組氨酸(HCl)或賴氨酸(HCl)(0.50％包含率)用組氨酸或賴氨酸示蹤。這分別提供0.372％和0.394％的組氨酸和賴氨酸。加入所述包衣的組氨酸和賴氨酸產(chǎn)品以提供與組氨酸(HCl)或賴氨酸(HCl)分別提供的相同水平的組氨酸或賴氨酸。測(cè)定酪蛋白中的組氨酸和賴氨酸的消化率，通過(guò)計(jì)算所述包衣的組氨酸和包衣的賴氨酸的消化率評(píng)定該效果。所有測(cè)試膳食與所述對(duì)照膳食含有相同量的酪蛋白(組氨酸和賴氨酸的唯一其它來(lái)源)。結(jié)果列于表15中。
表15家禽消化率試驗(yàn)
本申請(qǐng)中引用的所有參考文獻(xiàn)、專利和/或申請(qǐng)代表本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員的水平，它們以其包括任何表格和圖在內(nèi)的全部?jī)?nèi)容以相同的程度引入本文作為參考，引入程度如同每篇參考文獻(xiàn)以其單個(gè)全部?jī)?nèi)容引入本文作為參考一樣。
本領(lǐng)域技術(shù)人員十分清楚，在不偏離本發(fā)明的范圍和精神的前提下，可對(duì)本文公開(kāi)的發(fā)明進(jìn)行各種替代和修改。本文例示性描述的發(fā)明可在缺少本文沒(méi)有特別公開(kāi)的任何一種或多種成分、一種或多種限制的情況下適當(dāng)被實(shí)施。所使用的術(shù)語(yǔ)和表述用做描述性術(shù)語(yǔ)，而非限制性作用，且無(wú)意于在使用這些術(shù)語(yǔ)和表述時(shí)排除所表明和描述特征的任何等價(jià)物或其一部分，而是應(yīng)意識(shí)到各種修改可能在本發(fā)明的范圍內(nèi)。因此，應(yīng)理解，雖然已經(jīng)通過(guò)特定實(shí)施方案和任選特征例示了本發(fā)明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員可對(duì)本文公開(kāi)的思想進(jìn)行修改和/或變化，且認(rèn)為這些修改和變化在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
另外，關(guān)于就馬庫(kù)什要素或其它可選擇要素描述本發(fā)明的特征或方面的情況，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)意識(shí)到因此也就馬庫(kù)什要素或其它要素中的任一單個(gè)成員或亞組成員描述了本發(fā)明。
另外，除非給出相反的說(shuō)明，對(duì)于實(shí)施方案提供不同的數(shù)值的情況，通過(guò)取任意兩個(gè)不同值作為一范圍的端點(diǎn)還描述了另外的實(shí)施方案。這些范圍也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種飼料組合物，其包含(a)組氨酸源，所述組氨酸源包括L-組氨酸和來(lái)自產(chǎn)組氨酸微生物發(fā)酵的發(fā)酵成分；和(b)至少一種附加營(yíng)養(yǎng)組分；其中所述飼料組合物具有組氨酸含量為至少約2.8重量％的粗蛋白質(zhì)部分。
2.權(quán)利要求
1的飼料組合物，其包含至少約10重量％的所述粗蛋白質(zhì)部分。
3.權(quán)利要求
1的飼料組合物，其中至少部分所述組氨酸源被保護(hù)免于瘤胃降解。
4.權(quán)利要求
1的飼料組合物，其中所述發(fā)酵成分包含至少一種來(lái)自所述產(chǎn)組氨酸微生物發(fā)酵中形成的發(fā)酵液的可溶和不可溶成分。
5.權(quán)利要求
1的飼料組合物，其中所述發(fā)酵成分包含至少一種來(lái)自所述產(chǎn)組氨酸微生物發(fā)酵中形成的發(fā)酵液的溶解和未溶解成分。
6.權(quán)利要求
1的飼料組合物，其中所述發(fā)酵成分包含所述產(chǎn)組氨酸微生物發(fā)酵中形成的生物質(zhì)。
7.權(quán)利要求
1的飼料組合物，其中所述產(chǎn)組氨酸微生物為棒狀桿菌(Corynebacterium)。
8.權(quán)利要求
1的飼料組合物，其中所述產(chǎn)組氨酸微生物為短桿菌(Brevibacterium)。
9.權(quán)利要求
3的飼料組合物，其中至少約50％存在于所述瘤胃保護(hù)的組氨酸源中的組氨酸能夠被過(guò)瘤胃遞送。
10.一種飼料組合物，其包含(a)組氨酸源，所述組氨酸源包括L-組氨酸和來(lái)自產(chǎn)組氨酸微生物發(fā)酵的發(fā)酵成分；和(b)至少一種附加營(yíng)養(yǎng)組分；其中基于游離氨基酸計(jì)，所述組氨酸源的組氨酸含量為至少約400克/千克干固體。
11.權(quán)利要求
10的飼料組合物，其中至少部分所述組氨酸源被保護(hù)免于瘤胃降解。
12.權(quán)利要求
11的飼料組合物，其中至少約50％存在于所述瘤胃保護(hù)的組氨酸源中的組氨酸能夠被過(guò)瘤胃遞送。
13.一種飼料組合物，其包含含有至少約40重量％(dsb)L-組氨酸的瘤胃保護(hù)的組氨酸源。
14.權(quán)利要求
13的飼料組合物，其中所述飼料組合物含有組氨酸含量為至少約2.8重量％的粗蛋白質(zhì)部分。
15.權(quán)利要求
13的飼料組合物，其含有組氨酸含量為約3.0至7.0重量％的粗蛋白質(zhì)部分。
16.權(quán)利要求
13的飼料組合物，其中所述瘤胃保護(hù)的組氨酸源還包含來(lái)自產(chǎn)組氨酸微生物發(fā)酵的發(fā)酵成分。
17.權(quán)利要求
13的飼料組合物，其中至少約50％存在于所述瘤胃保護(hù)的組氨酸源中的組氨酸能夠被過(guò)瘤胃遞送。
18.權(quán)利要求
13的飼料組合物，其中所述瘤胃保護(hù)的組氨酸源包含已與至少一種還原糖反應(yīng)的組氨酸。
19.權(quán)利要求
18的飼料組合物，其中所述至少一種還原糖包括乳糖。
20.權(quán)利要求
13的飼料組合物，其中所述組氨酸源已用含有至少一種脂肪酸的包衣混合物包衣。
21.權(quán)利要求
20的飼料組合物，其中所述包衣混合物包含部分氫化的植物油。
22.權(quán)利要求
13的飼料組合物，其包含至少約1g/kg所述瘤胃保護(hù)的組氨酸源。
23.一種飼料組合物，其包含(a)瘤胃保護(hù)的組氨酸源，其包含至少以下一種(i)瘤胃保護(hù)的L-組氨酸，(ii)非動(dòng)物源的富含瘤胃保護(hù)的組氨酸的蛋白質(zhì)；和(iii)它們的混合物；和(b)至少一種附加營(yíng)養(yǎng)組分。
專利摘要
本發(fā)明公開(kāi)了用于補(bǔ)充反芻動(dòng)物飼料的組合物和方法。所述組合物包含至少一種具有增加的組氨酸含量的成分。該成分一般來(lái)源于非動(dòng)物源。所述方法包括給反芻動(dòng)物喂食包含所述成分的飼料組合物以提高產(chǎn)奶量。
文檔編號(hào)C12R1/15GK1997285SQ20058002453
公開(kāi)日2007年7月11日 申請(qǐng)日期2005年5月26日
發(fā)明者邁克爾·A.·梅斯曼, 默文·L.·德蘇扎, 戴維·B.·瓦尼奧尼, 蒂莫西·W.·亞伯拉罕, 霍利·J.·杰森, 奧爾佳·V.·賽利夫諾娃, 伊格納西奧·R.·伊法拉蓋爾 申請(qǐng)人:嘉吉公司, Can科技公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan