專利名稱:含水母發(fā)光蛋白的組合物及使用它的方法
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明一般地涉及適用于維持鈣體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的組合物。特別地，本發(fā)明涉及適用于預(yù)防和/或減輕與鈣失調(diào)相關(guān)的疾病或癥狀的含水母發(fā)光蛋白的藥物組合物和營養(yǎng)制品組合物。
發(fā)明背景鈣是人體內(nèi)第五最富含的元素，并且主要存在于骨中。體內(nèi)超過99％的鈣是儲藏于骨骼中，其不斷地改變其供應(yīng)，剩余的1％溶解于體液和軟組織如血液中。這種交換的控制在很大程度上受內(nèi)分泌系統(tǒng)支配，其感覺血漿中離子化鈣的濃度并指引鈣交換來維持這種關(guān)鍵的平衡。在組織液和軟組織中所述1％的鈣中只有一小部分是離子化的和可溶的，剩下的結(jié)合蛋白質(zhì)，特別是鈣結(jié)合蛋白(CaBPs)。已知這些CaBPs在維持鈣體內(nèi)穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮作用。由于為了完成必需的生理過程身體需要特定濃度的鈣離子，因此維持鈣體內(nèi)穩(wěn)態(tài)對于身體健康是極其重要的。醫(yī)學(xué)界了解血漿和體液中適當(dāng)?shù)碾x子鈣濃度在身體功能上是關(guān)鍵的，該身體功能包括但不限于神經(jīng)元興奮性、肌肉收縮性、膜滲透性、細胞分裂、激素分泌和骨礦化。鈣體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的破壞，即鈣失調(diào)與很多疾病、綜合征和病況相關(guān)，包括但不限于癌癥、心臟病和神經(jīng)變性疾病。
在過去，鈣通道拮抗劑(其阻滯鈣在細胞內(nèi)與組織液之間的流動)已經(jīng)作為適用于預(yù)防鈣相關(guān)的障礙包括高血壓、心絞痛、哮喘、偏頭痛和神經(jīng)衰退的藥劑被廣泛地處方。例如，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)尼莫地平通過減輕引起神經(jīng)衰退的鈣失調(diào)，改善癡呆中的臨床癥狀學(xué)和認知功能。然而，很多這些鈣通道拮抗劑具有不需要的副作用，包括但不限于不適、液體潴留、胃灼熱、游走的心率、頭暈、胃不適，在罕見的病例中有昏厥、發(fā)燒和過度出血。
因此，需要新的和可替代性的減輕或預(yù)防鈣失調(diào)的治療劑。特別地，與現(xiàn)有的活性劑相比副作用減少的藥物或營養(yǎng)制品組合物是期望的，如果發(fā)現(xiàn)，將滿足醫(yī)學(xué)界和營養(yǎng)健康界中長期感覺到的需要。
發(fā)明概述本發(fā)明提供藥物組合物和營養(yǎng)制品組合物，其有利于減輕和/或預(yù)防與鈣失調(diào)相關(guān)的癥狀或障礙。這樣的組合物包括與可接受的載體組合的水母發(fā)光蛋白，用于通過多種途徑向受試者給藥。因此，本發(fā)明涉及含有與可接受的載體組合的有效量的水母發(fā)光蛋白的藥物組合物。在其它實施方案中，本發(fā)明涉及營養(yǎng)制品組合物，它包含與可接受的載體組合的有效量的水母發(fā)光蛋白。在某些實施方案中，營養(yǎng)制品組合物除了包含水母發(fā)光蛋白之外，還包含至少一種被認為提供營養(yǎng)制品益處的其它成分。
在另一個實施方案中，本發(fā)明進一步提供了治療與鈣失調(diào)有關(guān)的癥狀或障礙的方法，通過向需要這種治療的患者給藥治療有效量的水母發(fā)光蛋白。
而在另一個實施方案中，本發(fā)明包括水母發(fā)光蛋白在制備用于減輕或預(yù)防與鈣失調(diào)有關(guān)的癥狀或障礙的組合物中的應(yīng)用。
在閱讀了說明書和權(quán)利要求
書之后，本發(fā)明的其它目的、特征和優(yōu)點將變得顯而易見。
附圖簡要說明圖1描述了描繪海馬神經(jīng)元攝取水母發(fā)光蛋白的熒光顯微照片。
圖2顯示了視頻顯微照片，其說明缺血之前給予水母發(fā)光蛋白時，它具有神經(jīng)保護作用。
圖3說明了缺血后含有(死亡的)神經(jīng)元的錐蟲藍的平均數(shù)的棒圖。
發(fā)明詳述
I.一般原則在描述本方法之前，應(yīng)當(dāng)理解的是本發(fā)明不限于所述的特定方法學(xué)和材料，因為它們可以變化。還應(yīng)當(dāng)理解的是本文使用的術(shù)語的目的僅在于描述特定的實施方案，不是想要限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍僅受附加的權(quán)利要求
限制。
必需注意的是，如本文和在附加的權(quán)利要求
書中使用的，單數(shù)形式的“a”、“an”和“the”包括復(fù)數(shù)的提及，除非上下文另外清楚地指出。另外，術(shù)語“a”(或“an”)、“一個或多個”和“至少一個”可以在本文中交換使用。還應(yīng)當(dāng)注意的是術(shù)語“含有”、“包含”和“具有”可以交換使用。
除非另外定義，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常了解的相同的含義。盡管同本文描述的那些相似或等效的任何方法和材料可以用于本發(fā)明的實踐或試驗中，但是當(dāng)前描述的是優(yōu)選的方法和材料。本文提及的所有出版物在此并入作為參考，目的在于描述和公開出版物中報道的化學(xué)試劑和方法學(xué)，所述出版物可以用于結(jié)合本發(fā)明。不應(yīng)將本文中的任何內(nèi)容解釋為承認本發(fā)明沒有權(quán)利由于在先發(fā)明而將這類公開的日期提前。
II.本發(fā)明水母發(fā)光蛋白是最初從發(fā)光水母和其它海洋生物中分離出來的背光蛋白質(zhì)(aphotoprotein)。水母發(fā)光蛋白復(fù)合物含有22,000-道爾頓的原水母發(fā)光蛋白蛋白質(zhì)、分子氧和發(fā)光體腔腸素。當(dāng)三個Ca2+離子結(jié)合此復(fù)合物時，腔腸素被氧化成腔腸酰胺，并發(fā)釋放二氧化碳和藍光。水母發(fā)光蛋白不被細胞排出或分泌，在細胞內(nèi)也不被區(qū)室化或隔離。因此，水母發(fā)光蛋白測量法用于檢測相對長時間內(nèi)發(fā)生的Ca2+變化。在多個實驗系統(tǒng)中，細胞加載后數(shù)小時至數(shù)天，水母發(fā)光蛋白的發(fā)光是可探測的。進一步認識到水母發(fā)光蛋白還不干擾細胞功能或胚胎發(fā)育。
因為其Ca2+-依賴性發(fā)光，水母發(fā)光蛋白復(fù)合物已經(jīng)廣泛用作細胞內(nèi)Ca2+指示劑。水母(Aequorea victoria)水母發(fā)光蛋白已被具體用于(1)分析單個腎上腺嗜鉻細胞對煙堿膽堿能激動劑的分泌響應(yīng)；(2)闡明Ca2+釋放在心肌損傷中的作用；(3)證明了受精過程中的Ca2+的大量釋放；(4)研究了在發(fā)育雞成肌細胞中肌質(zhì)網(wǎng)Ca2+泵表達的調(diào)節(jié)；和(5)用少至3皮升的注射體積校準(zhǔn)微量移液管。
來自水母Aequorea victaria的水母發(fā)光蛋白的常規(guī)純化需要吃力的提取程序，而且有時得到的制品實質(zhì)上是異源的或者對研究的生物有毒性。兩噸的水母通常得到-125mg的純化的光蛋白質(zhì)。相反，重組水母發(fā)光蛋白優(yōu)選通過從基因工程大腸桿菌(Escherichia coli)中純化原水母發(fā)光蛋白，接著在體外用純的腔腸素(coelenterazine)重構(gòu)水母發(fā)光蛋白復(fù)合物來生產(chǎn)。這種制備方法得到純的、無毒的、完全帶電的水母發(fā)光蛋白復(fù)合物，適于在本發(fā)明中使用。適用于本發(fā)明的一種示例性的商購的水母發(fā)光蛋白制品可從Molecular Probes，Inc.，以商品名AQUALITE購得。因此，描述了適用于本發(fā)明的水母發(fā)光蛋白，并可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的純化方案和/或合成而商業(yè)獲得。
依據(jù)幾個特征區(qū)別水母發(fā)光蛋白的功能水母發(fā)光蛋白是無毒的并且不干擾內(nèi)部的細胞化學(xué)計量。(Miller等人，Methods Cell Biol.40305-338(1994))；當(dāng)引入外來細胞時該蛋白質(zhì)是無毒的(Blinks，J.Environ Health Persp 8375-81(1990))。已知水母發(fā)光蛋白的每個分子結(jié)合至多三個鈣離子(Inouye等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，823154-3158(1985))。
本發(fā)明涉及向受試者給予含水母發(fā)光蛋白的組合物，以便糾正或維持受試者體內(nèi)的鈣平衡。認為維持血漿和體液中的離子鈣濃度對于廣泛的多種身體功能，包括但不限于神經(jīng)元興奮性、肌肉收縮、膜通透性、細胞分裂、激素分泌和骨礦化是關(guān)鍵的。認為鈣體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的破壞，即鈣失調(diào)引起很多疾病、綜合征和病況和/或與它們相關(guān)。CaBPs的研究導(dǎo)致將它們認為是在維持適當(dāng)?shù)碾x子鈣水平中起作用的保護因子。
在某些實施方案中，本發(fā)明的方法包括給予作為唯一的活性成分的水母發(fā)光蛋白，用于治療鈣失調(diào)、延遲鈣失調(diào)的進展、預(yù)防鈣失調(diào)的開始以及預(yù)防和/或治療鈣失調(diào)的復(fù)發(fā)。在其它的實施方案中，本發(fā)明提供了包括給予與一種或多種具有已知治療價值的另外的活性劑組合的水母發(fā)光蛋白。
如本文所使用，術(shù)語“治療”包括預(yù)防和障礙緩解治療。如本文所使用，術(shù)語“減少”、“減輕”、“壓制”和“抑制”具有它們通常理解的減輕或減少的含義。如本文所使用，術(shù)語“進展”意思是范圍或嚴(yán)重性的增加、推進、發(fā)展或變得更糟。如本文所使用，術(shù)語“復(fù)發(fā)”意思是減輕后疾病的復(fù)原。
如本文所使用，術(shù)語“給予”是指使水母發(fā)光蛋白與患者、組織、器官或細胞相接觸。如本文所使用，給藥可以在體外即在試管中完成，或在體內(nèi)即在活的生物例如人的細胞或組織中完成。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明包括向患者或受試者給予本發(fā)明中有用的分子?！盎颊摺被颉笆茉囌摺保诖送仁褂?，是指哺乳動物，優(yōu)選是人，其(1)具有鈣失調(diào)相關(guān)的紊亂，其通過給予水母發(fā)光蛋白可矯正或可治療；或(2)對鈣失調(diào)有關(guān)的紊亂敏感，所述紊亂可以通過給予水母發(fā)光蛋白預(yù)防。
如在本文中所用的，“藥物組合物”意思是治療有效量的水母發(fā)光蛋白連同適合的稀釋劑、防腐劑、增溶劑、乳化劑和助劑，總稱為“藥物上可接受的載體”。如本文所使用的，術(shù)語“有效量”和“治療有效量”是指足以產(chǎn)生期望的治療反應(yīng)卻沒有過度的不利副作用如毒性、刺激性或過敏反應(yīng)的活性劑的量。顯然，特定的“有效量”將隨這些因素如要治療的特定的病況、患者的身體狀況、治療動物的類型、治療的持續(xù)時間、同時治療(如果有)的性質(zhì)、所用的特定制劑和化合物或其衍生物的結(jié)構(gòu)而變化。在這種情況下，如果某一量導(dǎo)致以下的一種或多種情況，將認為此量是治療有效的(a)預(yù)防鈣失調(diào)有關(guān)的紊亂；和(b)逆轉(zhuǎn)或穩(wěn)定鈣失調(diào)有關(guān)的紊亂。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員采用常規(guī)實驗很容易確定最佳有效量。
藥物組合物是液體或凍干或以其它方式干燥的制劑，包含不同緩沖劑內(nèi)容物(例如Tris-HCl、醋酸鹽、磷酸鹽)、pH和離子強度的稀釋劑、防止吸收于表面的添加劑如白蛋白或明膠、去污劑(例如吐溫20、吐溫80、Pluronic F68、膽汁酸鹽)、增溶劑(例如甘油、聚乙烯甘油)、抗氧化劑(例如，抗壞血酸、焦亞硫酸鈉)、防腐劑(例如硫柳汞、苯甲醇、對羥基苯甲酸酯類)、膨脹物質(zhì)或張力改性劑(例如，乳糖、甘露醇)、共價連接的聚合物如連接于蛋白的聚乙二醇、與金屬離子絡(luò)合，或?qū)⑽镔|(zhì)摻到聚合化合物如聚乳酸、聚乙醇酸、水凝膠等的顆粒制品中或其上，或者摻到脂質(zhì)體、微乳、膠束、單層(milamellar)或多層囊泡、紅細胞影或原生質(zhì)球。這樣的組合物將影響物理狀態(tài)、溶解度、穩(wěn)定性、體內(nèi)釋放的速率和體內(nèi)清除的速率。受控或持續(xù)釋放的組合物包括親脂性貯庫(例如，脂肪酸、蠟、油)形式的制劑。
本發(fā)明還包括給予用聚合物(例如泊洛沙姆或poloxamines)包衣的顆粒組合物。本發(fā)明的組合物的其它實施方案包括用于各種給藥途徑，包括腸胃外、經(jīng)肺、經(jīng)鼻和口服的顆粒形式、保護性包衣、蛋白酶抑制劑或滲透增強劑。在某些實施方案中，藥物組合物經(jīng)下列途徑給藥腸胃外、癌周圍(paracancerally)、透粘膜、透皮、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、心室內(nèi)、顱內(nèi)和腫瘤內(nèi)。
此外，如本文所使用，“藥物上可接受的載體”為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，包括但不限于，0.01-0.1M并優(yōu)選0.05M磷酸鹽緩沖液或0.9％鹽水。另外，此類藥物上可接受的載體可以是含水或非水溶液、懸浮液和乳液。非水溶劑的實例是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄欖油，以及可注射的有機酯如油酸乙酯。含水載體包括水、含醇/水溶液、乳液或懸浮液，包括鹽水和緩沖的介質(zhì)。
胃腸外載體包括氯化鈉溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化鈉、乳酸林格氏液和不揮發(fā)性油。靜脈內(nèi)載體包括流體和營養(yǎng)補充物、電介質(zhì)補充物如基于林格氏葡萄糖的那些，等等。也可以含有防腐劑及其它添加劑，例如抗微生物劑、抗氧化劑、對照(collating)劑、惰性氣體等。
根據(jù)本發(fā)明可給藥的控釋或持續(xù)釋放組合物包括親脂性貯庫(例如脂肪酸、蠟、油)形式的制劑。本發(fā)明還包括用聚合物(例如泊洛沙姆或poloxamines)包衣的顆粒組合物，以及與針對組織特異性受體、配體或抗原的抗體偶合的化合物，或者與組織特異性受體的配體偶合的化合物。
根據(jù)本發(fā)明給予的組合物的其它實施方案包括用于各種給藥途徑，包括腸胃外、經(jīng)肺、經(jīng)鼻、經(jīng)眼和口服的顆粒劑型、保護性包衣、蛋白酶抑制劑或滲透增強劑。
已知通過水溶性聚合物如聚乙二醇、聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮或聚脯氨酸的共價連接修飾的化合物在靜脈內(nèi)注射后，在血中顯示出比相應(yīng)的未修飾的化合物顯著更長的半衰期。這些修飾還可能增加化合物在水溶液中的溶解度、消除聚集、提高化合物的物理和化學(xué)穩(wěn)定性，并極大地降低化合物的免疫原性和反應(yīng)性。結(jié)果，通過以與未修飾的化合物相比更低的頻率或更低的劑量給予這種聚合物-化合物加合物，可以達到期望的體內(nèi)生物活性。
在本發(fā)明的另一種方法中，藥物組合物可以用控釋系統(tǒng)給藥。例如，可以使用靜脈內(nèi)輸注、可植入的滲透泵、透皮貼劑、脂質(zhì)體或其它給藥方式給予藥物。在一個實施方案中，可以使用泵。在另一個實施方案中，可以使用聚合材料。在另一個實施方案中，可以將控釋系統(tǒng)放置于治療靶，即前列腺的附近，從而僅需要全身劑量的一部分。
藥物制劑可以只包含水母發(fā)光蛋白，或者進一步包含藥物上可接受的載體，并且可以是固體或液體形式，如片劑、散劑、膠囊劑、小丸、溶液、混懸劑、酏劑、糖漿劑、飲料、乳劑、凝膠劑、乳膏、眼用制劑或栓劑，包括直腸和尿道栓劑。藥物上可接受的載體還包括樹膠、淀粉、糖、纖維素物質(zhì)及其混合物。含有水母發(fā)光蛋白的藥物制劑可以通過例如皮下植入小丸而給與患者。在進一步的實施方案中，小丸在一段時期內(nèi)提供水母發(fā)光蛋白的控制釋放。制劑也可以通過靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)或肌內(nèi)注射液體制劑、口服給予液體或固體制劑，或通過局部應(yīng)用而給予。也可以通過使用直腸栓劑或尿道栓劑而完成給藥。
可通過本發(fā)明給予的藥物制劑可以通過已知的溶解、混合、造?；蛐纬善姆椒ǘ苽?。為了口服給藥，把水母發(fā)光蛋白或其生理學(xué)可耐受的衍生物如鹽、酯、N-氧化物等與常規(guī)用于此目的的添加劑如載體、穩(wěn)定劑或惰性稀釋劑混合，并通過常規(guī)方法轉(zhuǎn)化為用于給藥的適宜形式，如片劑、包衣片劑、硬或軟明膠膠囊、水、醇或油溶液。適宜的惰性載體的實例是常規(guī)的片劑基質(zhì)如乳糖、蔗糖或玉米淀粉，其與粘合劑如阿拉伯樹膠、玉米淀粉、明膠組合，或者與崩解劑如玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、藻酸組合，或者與潤滑劑如硬脂酸或硬脂酸鎂組合。
適宜的油載體或溶劑的實例是植物油或動物油，如向日葵油或魚肝油。制劑可以作為干顆粒和作為濕顆粒而實現(xiàn)。為了胃腸外給藥(皮下、靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)或肌內(nèi)注射)，將抗雄激素化合物或其生理學(xué)上耐受的衍生物如鹽、酯、N-氧化物等轉(zhuǎn)化成溶液、懸浮液或乳液(expulsion)，如果期望，與慣用并適合于該目的物質(zhì)例如增溶劑或其它輔劑一起配制。實例是無菌液體如水和油，有或沒有加入表面活性劑和其它藥物上可接受的輔助劑。舉例說明的油是來源于石油、動物、植物或合成起源的那些油，例如花生油、大豆油或礦物油。通常，水、鹽水、葡萄糖水溶液及有關(guān)的糖溶液，以及二醇類如丙二醇或聚乙二醇是優(yōu)選的液體載體，特別是用于可注射溶液。
含有活性組分的藥物組合物的制備是本領(lǐng)域公知的。將這些組合物制備成給藥到鼻咽部的氣溶膠，或者制備成可注射的液體溶液或懸浮液，然而，也可以制備成適合在注射前溶解于或懸浮于液體中的固體形式。制劑也可以被乳化?；钚灾委煶煞殖３Ｅc藥物上可接受的且與活性成分相容的賦形劑混合。適宜的賦形劑是例如水、鹽水、葡萄糖、甘油、乙醇等及其任意組合。另外，組合物可以含有少量輔助物質(zhì)，如濕潤劑或乳化劑、pH緩沖劑，其提高活性成分的有效性。
可以將活性組分以中和的藥物上可接受的鹽形式配制在組合物中。藥物上可接受的鹽包括酸加成鹽，它們是與無機酸如鹽酸或磷酸形成的鹽，或者是與有機酸如醋酸、草酸、酒石酸、杏仁酸等形成的鹽。由游離羧基形成的鹽也可以來源于無機堿如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣或氫氧化鐵，來源于這類有機堿如異丙胺、三甲胺、2-乙胺基乙醇、組氨酸、普魯卡因等。
為了使用例如乳膏、凝膠劑、滴劑等向體表面局部給藥，制備水母發(fā)光蛋白或其生理學(xué)上耐受的衍生物，并以在生理學(xué)可接受的稀釋劑(含或不含藥物載體)中的溶液、懸浮液或乳液形式使用。
在本發(fā)明的另一個方法中，活性化合物可以以囊泡，尤其是脂質(zhì)體給藥(參見Langer，Science 2491527-1533(1990)；Treat等，在Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer，Lopez-Berestein and Fidler(編)，Liss，N.Y.，第353-365頁(1989)中)。
為了在醫(yī)學(xué)中應(yīng)用，水母發(fā)光蛋白的鹽可以是藥物上可接受的鹽。然而，其它鹽在制備本發(fā)明的化合物或它們的藥物上可接受的鹽中可能有用。本發(fā)明的化合物的適宜的藥物上可接受的鹽包括酸加成鹽，其可以，例如通過使水母發(fā)光蛋白的溶液與藥物上可接受的酸的溶液混合而制得，所述藥學(xué)可接受的酸如鹽酸、硫酸、甲磺酸、富馬酸、馬來酸、琥珀酸、醋酸、苯甲酸、草酸、檸檬酸、酒石酸、碳酸或磷酸。
此外，本文所述的含水母發(fā)光蛋白的組合物可以營養(yǎng)制品組合物的形式提供，其中水母發(fā)光蛋白防止各種有害的鈣失調(diào)有關(guān)的紊亂的開始或減少或穩(wěn)定各種有害的鈣失調(diào)有關(guān)的紊亂。為了本說明書的目的，術(shù)語“營養(yǎng)制品”或“營養(yǎng)制品組合物”指的是食品、或食品的一部分，其提供醫(yī)學(xué)健康益處，包括預(yù)防和/或治療疾病。本發(fā)明的營養(yǎng)制品組合物可以僅含有本發(fā)明作為活性劑的水母發(fā)光蛋白，或選擇性地可進一步含有，與飲食添加劑包括維生素、輔酶、礦物質(zhì)、草藥、氨基酸等的混合物，它們通過增加該物質(zhì)的總攝取來補充飲食。
因此，本發(fā)明提供了向患者提供營養(yǎng)制品益處的方法，該方法包括向該患者給予含水母發(fā)光蛋白的營養(yǎng)制品組合物的步驟。此類組合物通常包含“營養(yǎng)制品可接受的載體”，如本文所稱的，其是適于口服給藥的任何載體，包括上述適于口服途徑的藥物上接受的載體。在某些實施方案中，本發(fā)明的營養(yǎng)制品組合物含有基于功能基礎(chǔ)定義的膳食補充劑，其包括免疫加強劑、抗炎劑、抗氧劑、抗病毒劑或其混合物。
免疫加強劑和/或抗病毒劑對加速傷口愈合和改善免疫功能是有用的；其包括金光菊或葉紫錐花屬的草本的提取物、接骨木屬草本的提取物以及白毛茛的提取物。天然或加工形式的黃芪屬草本的也是有效的免疫加強劑。黃芪刺激骨髓和淋巴組織中的干細胞發(fā)育成活性免疫細胞。鋅及其生物活性鹽如葡萄糖酸鋅和醋酸鋅，也可以用作治療感冒的免疫加強劑。
抗氧化劑包括天然的、含硫的氨基酸蒜素，其用于提高血液中抗氧化酶的水平。全草或草藥的提取物如大蒜，其含有蒜素，也是有效的抗氧化劑。兒茶素，和草本植物如含兒茶素的綠茶的提取物也是有效的抗氧化劑。黃芪屬的提取物還顯示了抗氧化活性。生物類黃酮如槲皮素、橙皮苷、蘆丁及其混合物，作為抗氧化劑也是有效的。生物類黃酮的主要的有益作用可能在于防止維生素C在體內(nèi)的氧化。這就使更多的維生素C或抗壞血酸可被身體利用。
生物類黃酮如槲皮素還是有效的抗炎藥，而且本身可以用于本發(fā)明的組合物中。源自植物或草本的抗炎的草本補充劑和抗炎化合物還可以作為抗炎藥用于本發(fā)明的組合物中。這些包括bromolain，其是在菠蘿中發(fā)現(xiàn)的一種蛋白水解酶，茶以及蕁麻的提取物、姜黃、姜黃的提取物、或姜黃素，一種從姜黃中分離的黃色色素。
另一個可以用于本發(fā)明的補充劑是姜，源自姜屬的草本植物。其已發(fā)現(xiàn)具有強心的活性(由化合物如姜酚和相關(guān)的化合物姜烯酚引起)，以及在頭暈和前庭障礙的治療中提供益處。姜在惡心和其它胃病的治療中也是有效的。
有助于重建軟組織結(jié)構(gòu)，特別是重建軟骨的補充劑，在治療關(guān)節(jié)疼痛和其它關(guān)節(jié)病的組合物中是有用的。氨基葡萄糖、硫酸氨基葡萄糖、軟骨素和硫酸軟骨素特別適用于這個目的。軟骨素可以源自多種來源，如Elk Velvet Antler.海生的脂質(zhì)的復(fù)合物，Ω3脂肪酸復(fù)合物和魚油也已知在治療與關(guān)節(jié)炎有關(guān)的疼痛中是有用的。
在治療偏頭痛中有用的補充劑包括小白菊和銀杏。小白菊中的主要有效成分是倍半萜內(nèi)酯小白菊內(nèi)酯，其抑制前列腺素的分泌，前列腺素依次通過血管中的血管痙攣活性引起疼痛。小白菊還顯示了抗炎的性質(zhì)。魚油，由于其血小板穩(wěn)定和抗血管痙攣作用，還可以用于治療偏頭痛。草本銀杏通過穩(wěn)定動脈和改善血液循環(huán)也有助于治療偏頭痛。
盡管描述了以上列出的一些補充劑的藥理學(xué)作用，其它的補充劑也可以用于本發(fā)明中而且它們的作用在科學(xué)文獻中被證明了。
III.實施例實施例1.水母發(fā)光蛋白被海馬神經(jīng)元攝取。在一組初步的研究中，水母發(fā)光蛋白雙側(cè)直接注射到3只不同成年大鼠的海馬中。把大鼠送回它們的生活籠子至少24小時，此后將它們麻醉并摘除它們的腦，切片和使用單克隆抗水母發(fā)光蛋白抗體染色水母發(fā)光蛋白。再使用綴合Alexa Fluor 594的二抗使一抗顯影。圖1顯示了使用常規(guī)熒光顯微術(shù)的水母發(fā)光蛋白標(biāo)記的海馬神經(jīng)元的實例。左圖是海馬的顯微照片，顯示了在CA1區(qū)域的插管尖端的定位。白色的矩形顯示了右圖中所示的兩個水母發(fā)光蛋白標(biāo)記的CA3錐體神經(jīng)元的定位。數(shù)據(jù)說明了水母發(fā)光蛋白直接輸注入海馬(左圖)產(chǎn)生了標(biāo)記CA1和CA3中的錐體神經(jīng)元。將水母發(fā)光蛋白(6w/v)溶解于存在3％DMSO的不含鈣的aCSF中。使用注射器泵(體積每側(cè)～1μL)把該溶液緩慢地(速率～1μl/min)直接注射進海馬。注射完成后，輸送插管在移走之前，在原處停留約1分鐘。兩個含水母發(fā)光蛋白CA3錐體神經(jīng)元的實例顯示在右圖中(4OX物鏡)。該數(shù)據(jù)清楚地證明了水母發(fā)光蛋白直接傳送進腦部，還證明了水母發(fā)光蛋白擴散到整個海馬，并被CA1、CA3和齒狀回中的神經(jīng)元攝取。
實施例2.水母發(fā)光蛋白對缺血后細胞死亡的作用進行實驗來研究鈣結(jié)合蛋白水母發(fā)光蛋白對缺血的益處。將水母發(fā)光蛋白(4％)溶解于無鈣的含6％DMSO(二甲亞砜)腦脊髓液中。2-3小時之后，用異氟烷麻醉大鼠，并斷頭處死。使用控溫的振動切片機制得400微米厚度的腦切片。切片立即放入充氧的(95％O2/5％CO2)以下組成(以niM計)的人造腦脊髓液(aCSF)中124 NaCl、2.8 KCl、2 MgSO4、2 NaH2PO4、2 CaCl2、26 NaHCO3、0.4抗壞血酸鈉、10右旋葡萄糖、pH 7.4，～30℃)。在1小時恢復(fù)后，切片接受5分鐘的缺血事件。通過用果糖代替葡萄糖，用氮氣代替氧氣誘導(dǎo)缺血。5分鐘缺血攻擊后，切片回到正常的充氧的含0.04％的錐蟲藍的aCSF中，在錐蟲藍aCSF中孵育30分鐘。錐蟲藍排除法(健康的細胞排除錐蟲藍，而死亡的或死亡中的細胞將吸收錐蟲藍，因此顯現(xiàn)藍色)通常用于評估細胞培養(yǎng)物或腦切片中的細胞死亡。在錐蟲藍中孵育后，取出切片，并放置于固定劑中整夜，接著在30％的蔗糖中孵育3小時。然后將400μm厚度的切片使用恒冷切片機切至～40μm的厚度，固定在明膠包封的載玻片上并蓋上載玻片。關(guān)于圖2，顯而易見的是相對于注射水母發(fā)光蛋白的神經(jīng)元(下圖)，對照(上圖)中存在更多的錐蟲藍染色的(死亡的)神經(jīng)元。圖3顯示了缺血后含錐蟲藍的(死亡的)神經(jīng)元平均數(shù)的棒圖。這一實驗證明了水母發(fā)光蛋白直接注射到海馬中賦予了抵抗缺血損傷的神經(jīng)保護作用。
應(yīng)當(dāng)理解，本文描述的實施例和實施方案僅為舉例說明的目的，并且根據(jù)這些實施例和實施方案的不同的修改或變化將被提示給本領(lǐng)域技術(shù)人員并且將被包括于本申請及附加的權(quán)利要求
的范圍和精神之內(nèi)。本文引用的所有出版物、專利和專利申請在此以全文并入作為參考用于所有目的。
權(quán)利要求
1.用于預(yù)防或減輕與鈣失調(diào)有關(guān)的癥狀或障礙的組合物，它包含(a)有效量的水母發(fā)光蛋白；和(b)可接受的載體。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1的組合物，它還含有免疫加強劑、抗炎劑、抗氧化劑、抗病毒劑或其混合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求
1的組合物，其中所述組合物呈單位劑型形式，該單位劑型選自片劑、膠囊、溶液、混懸劑、糖漿、飲料、口服或眼用制劑和注射劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求
1的組合物，其中所述組合物是營養(yǎng)制品。
5.預(yù)防或減輕與鈣失調(diào)有關(guān)的癥狀或障礙的方法，該方法包括向需要這種治療的患者給予有效量的水母發(fā)光蛋白。
6.根據(jù)權(quán)利要求
5的方法，其中所述癥狀或障礙與神經(jīng)元興奮性、肌肉收縮、膜通透性、細胞分裂、激素分泌和骨礦化有關(guān)。
7.根據(jù)權(quán)利要求
5的方法，其中所述癥狀或障礙是缺血后的細胞死亡。
8.根據(jù)權(quán)利要求
5的方法，其中所述有效量的水母發(fā)光蛋白是營養(yǎng)制品。
專利摘要
本發(fā)明提供了含水母發(fā)光蛋白的組合物，以及它們用于預(yù)防和/或減輕與鈣失調(diào)相關(guān)的癥狀和障礙的方法。
文檔編號A61K38/00GK1997383SQ20058002458
公開日2007年7月11日 申請日期2005年6月21日
發(fā)明者M·Y·安德伍德 申請人:昆西生物科學(xué)有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan