一種檢測(cè)金黃色葡萄球菌新型腸毒素i的雙抗夾心法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種檢測(cè)金黃色葡萄球菌新型腸毒素 I (SEI)的方法，具體涉及的是 一種檢測(cè)金黃色葡萄球菌新型腸毒素 I的雙抗夾心法。
【背景技術(shù)】
[0002] 金黃色葡萄球菌腸毒素 （staphylococcal enterotoxins，簡(jiǎn)稱(chēng)SEs)，是一種由金 黃色葡萄球菌分泌的細(xì)胞外毒素，其會(huì)導(dǎo)致中毒休克、食物中毒及一系列過(guò)敏性、免疫學(xué)疾 病。目前已發(fā)現(xiàn)的腸毒素有23種血清型，其中SEA-SEE稱(chēng)為傳統(tǒng)腸毒素，SEG-SEX為新型 腸毒素。其中SEI也屬于新型腸毒素，它是由729個(gè)核苷酸構(gòu)成，表達(dá)一個(gè)具有242個(gè)氨基 酸殘基的成熟蛋白質(zhì)，理論分子量為24. 928 KD。
[0003] 人類(lèi)對(duì)于各型SEs最低耐受劑量不一，目前能引起中毒的腸毒素基因主要包括 SEA、SEB、SEC、SED、SEE、SH^、SEG和SEI，其中A型腸毒素毒力最強(qiáng)，攝入lμg即能引起 食物中毒。但研宄表明，金黃色葡萄球菌腸毒素基因的各分型分布中，基因分布較廣。 在臨床研宄中發(fā)現(xiàn)，攜帶基因的金黃色葡萄球菌致病菌株的檢出率高達(dá)89. 5%。基于 基因流行的廣泛性，新型腸毒素 SEI潛在威脅人類(lèi)健康。因此，食品及其原料中SEI的 檢出，對(duì)控制SEI引起的食源性疾病具有重大意義。
[0004] 目前檢測(cè)腸毒素的方法主要有免疫學(xué)法、分子生物學(xué)法和生物傳感器法。
[0005] 基因往往以基因簇（e#)的形式存在，且腸毒素基因簇往往受同一操縱子調(diào) 控，從而導(dǎo)致一株葡萄球菌能同時(shí)表達(dá)兩種以上的腸毒素。因此，國(guó)內(nèi)外研宄重點(diǎn)是利用多 重PCR法對(duì)葡萄球菌腸毒素進(jìn)行快速分型。PCR技術(shù)可從基因水平進(jìn)行診斷，并能同時(shí)檢 測(cè)大量樣品，其高靈敏度和特異性可以直接應(yīng)用于檢測(cè)各類(lèi)金黃色葡萄球菌產(chǎn)腸毒素的基 因。但PCR法只能判斷葡萄球菌攜帶腸毒素的基因型，天然葡萄球菌腸毒素的表達(dá)往往受 到時(shí)間、水分活度（AW 0. 85~0. 99)、酸堿度（pH 4. 0~7. 0)和溫度（8°C ~30°C)等因素的影 響，用PCR法很難對(duì)準(zhǔn)確測(cè)定食品或臨床樣本中腸毒素蛋白的含量。
[0006] 免疫學(xué)檢測(cè)法依靠抗原抗體的結(jié)合，其只發(fā)生在抗原決定簇與抗體結(jié)合位點(diǎn)之 間。由于兩者在化學(xué)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型上呈互補(bǔ)關(guān)系，因此，免疫學(xué)檢測(cè)法具有高度的特異 性。生物傳感器技術(shù)因其具有自動(dòng)化、檢樣量少、分析速度快、生物功能膜可多次使用等優(yōu) 點(diǎn)受到國(guó)內(nèi)學(xué)者的親睞。最新研發(fā)的電化學(xué)免疫傳感器對(duì)腸毒素最低檢出限可達(dá)〇.〇17ng/ mL。但由于該方法檢測(cè)成本高，檢測(cè)穩(wěn)定性較差，理論不成熟，使該方法的發(fā)展受到限制。另 一種酶聯(lián)免疫吸附（ELISA)法因其具有操作簡(jiǎn)單、低成本、靈敏度高，特異性強(qiáng)、重復(fù)性強(qiáng)、 穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)，成為國(guó)內(nèi)外研宄熱點(diǎn)。
[0007] 目前，利用雙抗體夾心法檢測(cè)傳統(tǒng)腸毒素的技術(shù)較為成熟，其靈敏度高達(dá) 0.0282ng/mL。但目前利用雙抗體夾心法檢測(cè)新型腸毒素的報(bào)道較少，特別是關(guān)于SEI的檢 測(cè)采用該方法還未見(jiàn)報(bào)道，因此，雙抗體夾心法在金黃色葡萄球菌新型腸毒素檢測(cè)上將具 有相當(dāng)廣泛的應(yīng)用價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的主要目的在于提供一種即可定性分析、也可定量檢測(cè)，且靈敏度高、準(zhǔn)確 度高的檢測(cè)金黃色葡萄球菌新型腸毒素 I的雙抗夾心法。
[0009] 為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下： 一種檢測(cè)金黃色葡萄球菌新型腸毒素 I的雙抗夾心法，包括以下步驟： (1) 用包被抗體包被酶標(biāo)板，洗板，用于洗去未與酶標(biāo)板結(jié)合的包被抗體，該包被抗體 為SEI單克隆抗體； (2) 加入封閉液對(duì)酶標(biāo)板上多余結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行封閉，洗板，用于洗去酶標(biāo)板上多余封閉 液； (3) 在酶標(biāo)板上加入樣品，孵育后洗板； (4) 以SEI兔抗血清為一抗加入酶標(biāo)板，反應(yīng)后洗板，再以辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗 兔IgG為酶標(biāo)二抗，反應(yīng)后洗板； (5) 加入顯色液使酶標(biāo)板顯色，然后加入硫酸終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD45tl, (6) 將檢測(cè)得到的OD45tl值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)即可求得樣品中SEI的含量； 當(dāng)樣品中SEI濃度多0. 5 ng/mL，樣品中SEI被配對(duì)抗體捕獲與酶標(biāo)二抗結(jié)合，并催 化底物在450 nm產(chǎn)生吸收值時(shí)，被判定為陽(yáng)性； 當(dāng)樣品中SEI濃度< 0. 5 ng/mL，樣品中SEI不被配對(duì)抗體捕獲或者捕獲數(shù)量太小不足 以引起足夠的信號(hào)時(shí)，被判定為陰性。
[0010] 本發(fā)明記載的方法對(duì)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)SEI進(jìn)行0045(|值檢測(cè)后，得到的線(xiàn)性范圍良 好，可以直接做成標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，通過(guò)對(duì)樣品的(》45(|值檢測(cè)后，用該值在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上找出對(duì)應(yīng)的 濃度，即可實(shí)現(xiàn)樣品的定量檢測(cè)。
[0011] 兔抗血清中存在非特異性蛋白，因而其很難達(dá)到較高的特異性，若選作包被抗體， 易造成假陽(yáng)性，不利于抗原蛋白檢測(cè)，導(dǎo)致檢測(cè)的準(zhǔn)確率較低。本發(fā)明將僅針對(duì)一種抗原決 定簇的SEI單克隆抗體作為包被抗體，將SEI兔抗血清作為一抗加入反應(yīng)體系中，不僅克服 了直接使用兔抗血清所帶來(lái)特異性問(wèn)題，還提高了方法的靈敏度和準(zhǔn)確性。
[0012] 目前常采用的Dot-ELISA檢測(cè)法以硝酸纖維（NC)膜為固相載體，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，硝 酸纖維膜對(duì)蛋白的固定易受到非特異性蛋白、氫鍵作用干擾物、疏水作用干擾物的影響，從 而使膜上蛋白物理吸附能力變?nèi)?，易造成假陰性。而本發(fā)明采用聚苯乙烯酶標(biāo)板作為固相 載體，其物理吸附能力較強(qiáng)，性質(zhì)穩(wěn)定，因而能克服因蛋白吸附問(wèn)題而造成的假陰性。
[0013] 進(jìn)一步，本發(fā)明優(yōu)化了抗體包被濃度、一抗稀釋度、酶標(biāo)二抗稀釋度、包被液、封閉 時(shí)間、標(biāo)準(zhǔn)品孵育時(shí)間、酶標(biāo)抗體孵育時(shí)間、TMB顯色時(shí)間等。通過(guò)該條件的設(shè)置可使檢測(cè) 靈敏度達(dá)到0. 133 ng/mL，最低檢測(cè)限0. 5 ng/mL，R2達(dá)到0. 9933。
[0014] 本發(fā)明中各步驟的具體工作條件和過(guò)程如下： 所述步驟（1)的具體過(guò)程如下：用2. 2~3. 5 μ g/mL的SEI單克隆抗體包被酶標(biāo)板并在 4°C過(guò)夜，該SEI單克隆抗體的加入量?jī)?yōu)選為100 μ L/孔。
[0015] 所述步驟（2)的具體過(guò)程如下：以5120%脫脂奶粉為封閉液，在37°C下封閉I h~2 h，該封閉液的加入量?jī)?yōu)選為200 μ L/孔。
[0016] 所述步驟（3)中孵育的溫度為37°C，孵育的時(shí)間為60~90 min。
[0017] 所述步驟（4)中一抗加入后在37°C下反應(yīng)I h ;所述酶標(biāo)二抗加入后在37°C下反 應(yīng)30~45 min。該一抗和酶標(biāo)二抗的加入量均優(yōu)選為100 μ L/孔。
[0018] 所述步驟（5)中顯色液加入后在37°C避光顯色10~15 min ;所述硫酸濃度為2 mol/L。該顯色液和硫酸的加入量均優(yōu)選為100 μ L/孔。
[0019] 其中，所述步驟（1)中的包被抗體、步驟（2 )中的封閉液、以及步驟（4 )中的一抗和 酶標(biāo)二抗均采用ρΗ=7. 4的I X PBS進(jìn)行稀釋?zhuān)豢沟南♂尡壤秊?:2000 ~ 1:4000,酶標(biāo) 二抗的稀釋比例為1:6000 ~ 1:8000。
[0020] 所述步驟（1)~步驟（4)中洗板的操作過(guò)程如下：倒去酶標(biāo)板孔內(nèi)液體，在吸水紙 上拍干，用含〇. 05% Tween-20的PBST加滿(mǎn)孔，靜置3 min，反復(fù)洗滌3~5次。
[0021] 所述顯色液由10 mL顯色液A、125 μ L顯色液B、15 μ L 3% H2O2配置而成；其中 顯色液A由3. 5 g的Na2HPO4.12H20、1. I g的檸檬酸混合后加水至200 ml，并調(diào)節(jié)pH值至 5.0后制得；顯色液B由6 mg的3. 3'，5, 5'-四甲基聯(lián)苯胺（TMB)加入I mL二甲基亞砜 (DMSO)混合制得。
[0022] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)及有益效果： 1、 本發(fā)明不僅能有效對(duì)新型腸毒素 I進(jìn)行定性分析，還能有效對(duì)新型腸毒素 I進(jìn)行定 量檢測(cè)，且檢測(cè)準(zhǔn)確度高； 2、 本發(fā)明中的試劑穩(wěn)定、易保存，且操作簡(jiǎn)單、低成本、靈敏度高，特異性強(qiáng)、重復(fù)性強(qiáng)、 穩(wěn)定性高；且本發(fā)明能同時(shí)檢測(cè)大量樣品，適用于SEI檢測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查，具有良好的應(yīng) 用前景。
【附圖說(shuō)明】
[0023] 圖1為本發(fā)明方法檢測(cè)得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。
【具體實(shí)施方式】
[0024] 下面結(jié)合實(shí)施例及其附圖，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步地詳細(xì)說(shuō)明，但本發(fā)明的實(shí)施方式 不局限于此。 實(shí)施例
[0025] 一、準(zhǔn)備階段 本階段用于配置好相應(yīng)濃度的各試劑物品等，本發(fā)明中所用試劑物品包括：包被抗體、 封閉液、樣品、一抗、酶標(biāo)二抗、顯色液、硫酸。
[0026] 其中，酶標(biāo)板為96孔聚苯乙烯可拆酶標(biāo)板；該包被抗體為SEI單克隆抗體，SEI單 克隆抗體濃度為2. 2 ~ 3. 5 μ g/mL，封閉液濃度為5% ~ 20%的脫脂奶粉溶液，該SEI單克 隆抗體和封閉液均采用pH=7.4的I X PBS配置而成。樣品包括檢測(cè)樣品和濃度分別為 0. 5 ng/mL、l ng/mL、2. 5 ng/mL、10 ng/mL、15 ng/mL、20 ng/mL、25 ng/mL、30 ng/mL的 SEI 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液。一抗為SEI兔抗血清，酶標(biāo)二抗為辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG，辣根 過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG為市售產(chǎn)品，購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。硫酸濃度為 2 mol/L〇
[0027] 所述SEI單克隆抗體的制備方法如下：以重組表達(dá)的SEI為免疫原，免疫6~8周齡 的BALB/c小鼠，免疫程序如下：第一周進(jìn)行初免，皮下多點(diǎn)注射；此后，每隔兩周免疫一次， 共免疫三次，尾部采血測(cè)效價(jià)，選擇效價(jià)最高的老鼠。再細(xì)胞融合前3天沖擊免疫一次。眼 眶采血后進(jìn)行融合，篩選采用間接ELISA進(jìn)行，共篩選到2個(gè)細(xì)胞株；其中1株性質(zhì)穩(wěn)定， SEI單克隆抗體產(chǎn)量高。
[0028] 所述SEI兔抗血清的制備方法如下：將0. 3 mg SEI與等量弗氏完全佐劑混合，皮 下多點(diǎn)注射雌性新西蘭大白兔1.0 mL ;3周后，以0.15 mg SEI與等量弗式不完全佐劑混 合，皮下多點(diǎn)注射新西蘭兔I. 〇 mL ;3周以后每隔2周分別以0. 15 mg/只耳靜脈注射新西 蘭兔，最后1次免疫后7~10天內(nèi)，頸動(dòng)脈采全血，37°