一種富含甾醇的熱帶假絲酵母的培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種富含留醇的熱帶假絲酵母的培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]留醇是留族化合物中的一種，分子的基本骨架(稱為環(huán)戊烷多氫菲核)有三個六元環(huán)和一個五元環(huán)組成。C-3位上連有一個輕基，C-17位連有由8?10個碳原子構(gòu)成的側(cè)鏈，多數(shù)留醇C-5位為雙鍵。由于C-17位上的側(cè)鏈不同和C-3位上羥基結(jié)合的物質(zhì)不同，甾醇的種類也不同。
[0003]留醇是生物體內(nèi)天然有機(jī)化合物，廣泛存在于動物、植物、微生物的組織中。在動物組織中以膽留醇(又稱膽固醇)為主；在植物組織(主要是種子)中，主要是谷甾醇、豆甾醇和菜油留醇；在微生物中主要是麥角留醇。因此，膽留醇被稱為動物留醇；β-谷甾醇、豆留醇和菜油留醇被稱為植物留醇；麥角留醇被稱為微生物留醇。植物留醇主要來源于植物油，其含量僅為0.04%?0.1%。由于留醇是真核生物細(xì)胞膜的組成成分，因此，所有的真核生物均含有留醇，但留醇的種類及其含量有很大的差別，其中酵母菌屬中釀酒酵母的甾醇較為豐富。釀酒酵母可以合成約20種留醇，留醇總含量最大為4.6% (細(xì)胞干重)，其中麥角甾醇占總甾醇的90%。
[0004]留醇被譽(yù)為“生命的鑰匙”，具有十分重要的生理功能。谷留醇、豆留醇和菜油甾醇具有降血清膽固醇、降血脂、抗腫瘤、降低心臟病發(fā)生率、防止前列腺疾病，以及抗癌、調(diào)節(jié)動物的生長、抗炎、抗病毒、延緩衰老等作用。β-谷留醇、豆留醇、菜油留醇和麥角甾醇也是多種激素、維生素D及留族化合物合成的前體。因此，留醇廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品等工業(yè)領(lǐng)域。
[0005]申請?zhí)枮?5114213.5的中國專利公開了一種富含麥角甾醇酵母的制造方法，培養(yǎng)基中以糖蜜為碳源，培養(yǎng)基組分還包含適量的尿素、硫酸銨、磷酸等來發(fā)酵培養(yǎng)酵母菌，所得的酵母細(xì)胞中麥角留醇含量可達(dá)到1.4%?1.6%。申請?zhí)枮?01080055130.5的中國專利公開了一種通過酵母生產(chǎn)非酵母的留醇的制造方法，所使用的酵母可以是釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、畢赤酉孝母(Pichia spp)、克魯維酉孝母(Klyuveromycesspp)，漢遜酵母(Hansenula spp)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces spec.)和解脂酵母(Yarrowia Iipolytica),所生產(chǎn)的留醇為7_脫氫膽固醇、25-輕基-7-脫氫膽固醇和25-羥基麥角留醇。以脂肪酸為碳源發(fā)酵培養(yǎng)富含留醇的熱帶假絲酵母的方法在國內(nèi)外文獻(xiàn)中均未見報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種富含留醇的熱帶假絲酵母培養(yǎng)方法，所收獲的熱帶假絲酵母細(xì)胞富含留醇，其留醇含量可達(dá)到6.23%?7.12%，而且所產(chǎn)生的留醇以谷甾醇和菜油留醇為主。
[0007]本發(fā)明的原理:熱帶假絲酵母具有能以游離脂肪酸和油脂作為碳源進(jìn)行生長繁殖的特性。制備以游離脂肪酸或脂肪為唯一碳源的培養(yǎng)基；培養(yǎng)基經(jīng)過高溫滅菌、冷卻后，接種熱帶假絲酵母進(jìn)行通氣好氧發(fā)酵；發(fā)酵結(jié)束后，離心收集菌體，即獲得富含留醇的熱帶假絲酵母細(xì)胞。
[0008]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案予以實(shí)施:
[0009]—種富含甾醇的熱帶假絲酵母的培養(yǎng)方法，包括以下步驟:
[0010]a、種子培養(yǎng)基的配制及滅菌:按配比在IL水中，加入20?30g葡萄糖、10?20g蛋白胨、5?1g酵母粉，按照所述配比，將各種成分稱重后加入三角瓶中，室溫下攪拌均勻，制得種子培養(yǎng)基；用8層紗布密封后放入高壓滅菌鍋中，于115°C?121°C滅菌15?20min，滅菌后把三角瓶冷卻至室溫；
[0011]b、種子液的制備:挑取熱帶假絲酵母的斜面保藏菌種2?3環(huán)，接種到步驟a中所述的種子培養(yǎng)基中，于30°C、180?200rpm搖床振蕩培養(yǎng)48h，備用；
[0012]C、發(fā)酵培養(yǎng)基的配制及滅菌:于IL水中，加入40?50g游離脂肪酸或油脂(所述油脂為大豆油、花生油、菜籽油、棉籽油等)、1.0?2.0g酵母粉、0.1?0.2g硫酸鎂、0.1?
0.2g磷酸氫二鉀、0.1?0.2g磷酸二氫鉀；按照所述配比，將各種成分稱重后加入機(jī)械攪拌式發(fā)酵罐中，室溫下攪拌均勻，并用0.5M氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值6.8?7.0，制得發(fā)酵培養(yǎng)基；然后向發(fā)酵罐通入蒸汽開始滅菌，待罐溫上升到115°C?121°C，保溫30min，滅菌結(jié)束后，引入冷卻水將發(fā)酵培養(yǎng)基溫度降至25°C?30°C ;
[0013]d、發(fā)酵:將步驟b所述熱帶假絲酵母菌種子液以8%?10%接種量接種到步驟c所述發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基之中，控制發(fā)酵溫度28°C?30 °C，機(jī)械攪拌轉(zhuǎn)速220rpm?240rpm，通氣量1.0?1.2vvm, pH值6.8?7.0,發(fā)酵96?108h。
[0014]e、離心、洗滌:將步驟d所述的發(fā)酵液放置于離心機(jī)中，5000?5500rpm離心15?20min，棄上層殘存的游離脂肪酸或油脂及清液，收集沉淀在離心機(jī)底部的菌泥(濕菌體)，按照1:50?1:80的比例加入50°C?60°C去離子水制成菌懸液，攪拌5?8min，然后再次進(jìn)行離心，如此洗滌3次，得到熱帶假絲酵母濕菌體；
[0015]f、干燥:將步驟e所述的熱帶假絲酵母濕菌體進(jìn)行40°C?50°C冷風(fēng)干燥，即獲得富含留醇的熱帶假絲酵母干菌體。
[0016]所述步驟f中，其總甾醇含量為6.23%?7.12%。其中谷甾醇占總甾醇的53.4%;菜油甾醇占總甾醇的37.9%。
[0017]優(yōu)選的，所述步驟a中種子培養(yǎng)基的物質(zhì)組成為:20g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨和10g/L酵母粉。
[0018]優(yōu)選的，所述步驟c中發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為:于IL水中，加入50g大豆油、2.0g酵母粉、0.1g硫酸鎂、0.1g磷酸氫二鉀、0.1g磷酸二氫鉀。
[0019]優(yōu)選的，所述步驟c中油脂為大豆油、花生油、菜籽油、棉籽油中的一種。
[0020]優(yōu)選的，一種富含甾醇的熱帶假絲酵母的培養(yǎng)方法，包括以下具體步驟:
[0021]a、種子培養(yǎng)基的配制及滅菌:于IL水中，加入30g葡萄糖、1g蛋白胨、5g酵母粉，按照所述配比，將各種成分稱重后加入三角瓶中，室溫下攪拌均勻，制得種子培養(yǎng)基；用8層紗布密封后放入高壓滅菌鍋中，121°C滅菌20min，滅菌后把三角瓶冷卻至室溫；
[0022]b、種子液的制備:挑取熱帶假絲酵母的斜面保藏菌種2?3環(huán)，接種到步驟a中所述的種子培養(yǎng)基中，30°C、200rpm搖床振蕩培養(yǎng)48h ；
[0023]c、發(fā)酵培養(yǎng)基的配制及滅菌:于IL水中，加入50g大豆油、2.0g酵母粉、0.1g硫酸鎂、0.1g磷酸氫二鉀、0.1g磷酸二氫鉀，按照所述配比，將各種成分稱重后加入機(jī)械攪拌式發(fā)酵罐中，室溫下攪拌均勻，并用0.5M氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值7.0，制得發(fā)酵培養(yǎng)基；然后向發(fā)酵罐通入蒸汽開始滅菌，待罐溫上升到121°C，保溫30min，滅菌結(jié)束后，引入冷卻水將發(fā)酵培養(yǎng)基溫度降至25°C?30°C ;
[0024]d、發(fā)酵:將步驟b所述熱帶假絲酵母菌種子液以10%接種量接種到步驟c所述發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基之中，控制發(fā)酵溫度30°C，機(jī)械攪拌轉(zhuǎn)速240rpm，通氣量1.2vvm, pH值7.0,發(fā)酵108h ；
[0025]e、離心、洗滌:將步驟d所述的發(fā)酵液放置于離心機(jī)中，5500rpm離心20min，棄上層殘存的大豆油及清液。收集沉淀在離心機(jī)底部的菌泥(濕菌體)，按照1:80的比例加入60°C去離子水制成菌懸液，攪拌5?8min，然后再次進(jìn)行離心，如此洗滌3次，得到熱帶假絲酵母濕菌體；
[0026]f、干燥:將步驟e所述的熱帶假絲酵母濕菌體進(jìn)行40°C?50°C冷風(fēng)干燥，即獲得富含留醇的熱帶假絲酵母干菌體。
[0027]所述步驟f中，其總甾醇含量為6.95%，在所產(chǎn)生的總甾醇中，谷甾醇占53.4%，菜油甾醇占37.9%。
[0028]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有的有益效果為:
[0029]①所獲得的熱帶假絲酵母細(xì)胞留醇含量達(dá)到6.23%?7.12%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于普
[0030]通方法所培養(yǎng)的酵母細(xì)胞中的留醇含量(1.4%?4.6% )。
[0031]②所獲得的熱帶假絲酵母細(xì)胞所產(chǎn)生的留醇以谷留醇和菜油留醇為主，而普通方法所培養(yǎng)的酵母細(xì)胞中的甾醇以麥角甾醇為主。同麥角甾醇相比，谷甾醇和菜油甾醇用途更加廣泛。
[0032]③采用微生物發(fā)酵大量產(chǎn)生植物留醇:谷留醇和菜油甾醇。
【具體實(shí)施方式】
[0033]下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
[0034]實(shí)施例一
[0035]富含留醇的熱帶假絲酵母培養(yǎng)方法:以油酸為唯一碳源。
[0036]a、種子培養(yǎng)基的配制及滅菌:于IL水中，加入30g葡萄糖、1g蛋白胨、1g酵母粉。按照所述配比，將各種成分稱重后加入三角瓶中，室溫下攪拌均勻，制得種子培養(yǎng)基；用8層紗布密封后放入高壓滅菌鍋中，115°C滅菌15min。滅菌后把三角瓶冷卻至室溫。
[0037]b、種子液的制備:挑取熱帶假絲酵母的斜面保藏菌種2?3環(huán)，接種到步驟a中所述的種子培養(yǎng)基中，30°C、200rpm搖床振蕩培養(yǎng)48h。
[0038]C、發(fā)酵培養(yǎng)基的配制及滅菌:于IL水中，加入40g油酸、2.0g酵母粉、0.1g硫酸鎂、0.1g磷酸氫二鉀、0.1g磷酸二氫鉀。按照所述配比，將各種成分稱重后加入機(jī)械攪拌式發(fā)酵罐中，室溫下攪拌均勻，并用0.5M氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值7.0，制得發(fā)酵培養(yǎng)基；然后向發(fā)酵罐通入蒸汽開始滅菌，待罐溫上升到121°C，保溫30min，滅菌結(jié)束后，引入冷卻水將發(fā)酵培養(yǎng)基溫度降至25°C?30°C。
[0039]d、發(fā)酵:將步驟b所述熱帶假絲酵母菌種子液以10%接種量接種到步驟c所述發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基之中，控制發(fā)酵溫度30°C，機(jī)械攪拌轉(zhuǎn)速220rpm，通氣量1.2vvm, pH值7.0,發(fā)酵108h。
[0040]e、離心、洗滌:將步驟d所述的發(fā)酵液放置于離心機(jī)中，5000rpm離心20