一株高產(chǎn)中溫α-淀粉酶的枯草芽孢桿菌及其液體發(fā)酵方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一株高產(chǎn)中溫α -淀粉酶的枯草芽孢桿菌菌株及其液體發(fā)酵方法，屬 于微生物育種和發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] α -淀粉酶全稱為α -1，4-葡聚糖水解酶（EC 3. 2. I. 1)，作用于淀粉時(shí)，可從分子 內(nèi)部切開α -1，4-糖苷鍵而生成糊精和還原糖，由于產(chǎn)物的末端葡萄糖殘基Cl碳原子為 α -構(gòu)型，故得名為α-淀粉酶。淀粉酶是最早實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生廣并且是迄今為止用途最廣、 產(chǎn)量最大的酶制劑品種。
[0003] 其中，中溫α -淀粉酶是一類最適反應(yīng)溫度在50~70°C的α -淀粉酶。目前，中 溫α -淀粉酶已經(jīng)廣泛應(yīng)用于變性淀粉及淀粉糖、焙烤工業(yè)、啤酒釀造、酒精工業(yè)等行業(yè)， 也用于飼料、輕化工業(yè)、食品、造紙、醫(yī)藥、石油開采等各個(gè)領(lǐng)域。
[0004] 近年來中溫α-淀粉酶已經(jīng)引起研究人員的廣泛關(guān)注，具有廣闊的應(yīng)用前景。但 是現(xiàn)有的中溫α -淀粉酶在發(fā)酵時(shí)的最大酶活仍難以令人滿意，因此急需研發(fā)出產(chǎn)量更 高、發(fā)酵周期更短的中溫α -淀粉酶的菌株及其發(fā)酵方法，以滿足日益增長(zhǎng)的工業(yè)化生產(chǎn) 需求。
[0005][0006]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供一株適于液體發(fā)酵高產(chǎn)中溫α -淀粉酶的枯草芽孢桿菌突 變菌株及其液體發(fā)酵生產(chǎn)方法。
[0008] 本發(fā)明提供的高產(chǎn)中溫α -淀粉酶的菌株具體為枯草芽孢桿菌菌株（Bacillus subtilis)BS-122,該菌株已于2015年05月07日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員 會(huì)普通微生物中心，地址位于北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研 究所（郵編100101)，保藏編號(hào)為CGMCC No. 10786,分類命名：枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)〇
[0009] 所述枯草芽孢桿菌突變菌株是采用枯草芽孢桿菌BS2007 (申請(qǐng)人于2007年從土 壤中篩選得到）進(jìn)行常壓室溫等離子體（ARTP)誘變選育獲得?？莶菅挎邨U菌BS2007的液 體發(fā)酵酶活最高為4600u/mL，誘變株的液體發(fā)酵酶活可達(dá)到6000u/mL，經(jīng)發(fā)酵條件優(yōu)化， 平均發(fā)酵酶活力可達(dá)到7309u/mL，最高可達(dá)7400u/mL。中溫α -淀粉酶酶活力單位定義為： ImL液體酶，于65°C、pH = 6. 0條件下，Ih液化Ig可溶性淀粉，即為1個(gè)酶活力單位，以u(píng)/ mL表不。
[0010] 利用本發(fā)明枯草芽孢桿菌突變菌株（CGMCC No. 10786)液體發(fā)酵產(chǎn)中溫α -淀粉 酶的方法，包括如下步驟：
[0011] 種子培養(yǎng)：將中溫α-淀粉酶的生產(chǎn)菌株枯草芽孢桿菌CGMCC No. 10786進(jìn)行 搖瓶培養(yǎng)制備種子液；搖瓶培養(yǎng)基組成為：可溶性淀粉2-3%，酵母膏0. 2-0. 5%，蛋白胨 0.2-0. 4%，氯化鈣0. 1-0. 2%，其余為水，pH值6. 5~6.7 ;培養(yǎng)條件為：溫度37°C，轉(zhuǎn)速 200rpm，培養(yǎng)周期6h ;
[0012] 液體發(fā)酵：在50L發(fā)酵罐進(jìn)行液體發(fā)酵，發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：玉米粉5. 5-10%， 豆餅粉3-4. 5 %，可溶性淀粉2-4. 2 %，硫酸銨0. 2-0. 4 %，磷酸氫二鈉0. 8-1. 0 %，氯化鈣 0. 1-0. 2%，其余為水，pH值6. 5~6.7 ;培養(yǎng)條件為：接種量為6~10%，裝液量60%，溫 度37°C，轉(zhuǎn)速200~800rpm，罐壓0· 07MPa，風(fēng)量0· 2~I. 5vvm，培養(yǎng)周期70h ;
[0013] 補(bǔ)料方式：發(fā)酵IOh時(shí)，流速10g/h/L恒速流加補(bǔ)料培養(yǎng)基；補(bǔ)料培養(yǎng)基組成為： 葡萄糖40 %，可溶性淀粉3 %，硫酸銨0. 2-0. 4 %，磷酸氫二鈉0. 8-1. 0 %，氯化鈣0. 8 %，其 余為水；
[0014] 中溫α-淀粉酶的提取與精制：發(fā)酵結(jié)束后，按發(fā)酵液體積加入0.6%的氯化鈣， 2%磷酸氫二鈉進(jìn)行發(fā)酵液絮凝；加入3%珍珠巖助濾劑，使用板框壓濾機(jī)進(jìn)行壓濾，濾液 經(jīng)超濾機(jī)超濾濃縮后加入穩(wěn)定劑得到液體酶制劑。
[0015] 本發(fā)明菌株所產(chǎn)中溫α-淀粉酶的酶學(xué)性質(zhì)：最適作用溫度為60~70°C，該酶在 PH6. 0,溫度60~70°C條件下保存12h仍具有75%以上酶活；最適反應(yīng)pH為5. 2~6. 2， 在溫度25°C，pH5. 2~6. 2條件下保存12h后，溫度60°C條件下測(cè)定，仍有85 %以上酶活。
[0016] 本發(fā)明菌株具有抗菌性能：誘變株較原始菌株對(duì)大腸桿菌、米曲霉、畢赤酵母具有 更強(qiáng)的抑制作用；原始菌株對(duì)葡萄球菌沒有抑制作用，但是誘變菌株對(duì)葡萄球菌具有較強(qiáng) 的抑制作用。
[0017] 有益效果：
[0018] 本發(fā)明通過對(duì)原始菌株進(jìn)行ARTP誘變提高酶活后，對(duì)誘變株進(jìn)行培養(yǎng)基優(yōu)化和 發(fā)酵條件優(yōu)化，建立了適宜于工業(yè)化生產(chǎn)的液體發(fā)酵產(chǎn)中溫α -淀粉酶的方法，平均發(fā)酵 活力在7309u/mL。生產(chǎn)的中溫α -淀粉酶有效溫度范圍35~90°C，最適溫度范圍60~ 70°C ;有效pH范圍4. 5~8. 0,最適pH值范圍5. 2~6. 2。發(fā)酵酶活力高，酶作用最適溫 度、PH值范圍寬泛、抑菌性能更強(qiáng)，可廣泛應(yīng)用于啤酒、味精、淀粉糖、酒精、發(fā)酵工業(yè)的液化 以及印染退漿、飼料、果汁加工、焙烤等行業(yè)。
【附圖說明】
[0019] 圖I :本發(fā)明中溫α -淀粉酶在不同溫度下保存12h的相對(duì)酶活；
[0020] 圖2 :本發(fā)明中溫α -淀粉酶在不同pH下保存12h的相對(duì)酶活。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 下面通過具體的實(shí)施方案敘述本發(fā)明。除非特別說明，本發(fā)明中所用的技術(shù)手段 均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法。另外，實(shí)施方案應(yīng)理解為說明性的，而非限制本發(fā)明的 范圍，本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和范圍僅由權(quán)利要求書所限定。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，在不背離本 發(fā)明實(shí)質(zhì)和范圍的前提下，對(duì)這些實(shí)施方案中的物料成分和用量進(jìn)行的各種改變或改動(dòng)也 屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0022] 實(shí)施例1 :菌株的選育
[0023] (1)菌懸液制備：
[0024] 將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的枯草芽孢桿菌BS2007菌液8000rpm離心5min，棄上清，用10% 甘油重懸即為菌懸液，菌懸液的細(xì)胞濃度在IO7個(gè)/ml。
[0025] (2) ARTP 誘變：
[0026] 吸取10 μ L菌懸液于載片中央并涂抹均勻；用無菌鑷子將載片放于ARTP系統(tǒng)操 作室旋轉(zhuǎn)臺(tái)上的對(duì)應(yīng)孔位，調(diào)節(jié)載臺(tái)下方旋鈕，使載片處于氣流端口 2mm處，設(shè)置氣流量 10SLM，調(diào)節(jié)功率至100W，選擇誘變照射時(shí)間分別為20s、25s、3〇S ;樣品處理完畢，用無菌鑷 子將載片移至裝有ImL生理鹽水的EP管中，將EP管在振蕩器上震蕩lmin，把附著在載片 上的菌體洗脫到液體中，形成新的菌懸液；對(duì)新的菌懸液進(jìn)行適當(dāng)稀釋，取100 μ L涂布于 淀粉篩選平板上。淀粉篩選培養(yǎng)基配方：葡萄糖5 %，氯化鈉 0. 2 %，酵母粉0. 2 %，營(yíng)養(yǎng)肉 湯0. 3 %，蛋白胨0. 5 %，玉米淀粉1 %，瓊脂1. 3 %，調(diào)pH7. 0左右。37 °C培養(yǎng)過夜，長(zhǎng)出單 菌落后挑取淀粉水解圈直徑與菌落直徑比值較大的菌落共600個(gè)。
[0027] (3)誘變菌株的搖瓶初步篩選：
[0028] 將挑選的600個(gè)淀粉水解圈直徑與菌落直徑比值較大的菌落進(jìn)行單瓶搖瓶發(fā)酵， 搖瓶配方為：玉米粉5. 5 %，豆餅粉4. 5 %，淀粉4. 2 %，硫酸銨0. 4 %，磷酸氫二鈉1. 8 %，氯 化鈣0. 27%，調(diào)pH7. 0,加入碳酸鈣1 %。培養(yǎng)溫度37°C，培養(yǎng)時(shí)間70h，轉(zhuǎn)速200rpm。
[0029] 培養(yǎng)結(jié)束后按照中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB8275-2009測(cè)定中溫α -淀粉酶酶 活，從其中