消除引物二聚體的零背景解旋酶依賴體系及擴(kuò)增方法和應(yīng)用【
技術(shù)領(lǐng)域：
】[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)及分子診斷
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種消除引物二聚體的零背景解旋酶依賴體系及擴(kuò)增方法和應(yīng)用?！?br>背景技術(shù)：
】[0002]依賴解旋酶恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（helicase-dependentamplification,HDA)是一種有效的指數(shù)擴(kuò)增目標(biāo)核酸的技術(shù)。該技術(shù)模擬生物體內(nèi)核酸復(fù)制過(guò)程，利用DNA解旋酶在等溫條件下解開(kāi)雙鏈DNA，用單鏈結(jié)合蛋白（single-strandedDNA-bindingprotein)維持DNA單鏈狀態(tài)，繼而在DNA聚合酶的參與下實(shí)現(xiàn)核酸擴(kuò)增，無(wú)需類似于PCR所要求的復(fù)雜而精確的熱循環(huán)（變性一退火一延伸）過(guò)程。HDA已被認(rèn)為是一種強(qiáng)有力的PCR的替代方法，特別是在資源有限的地區(qū)和需要實(shí)地檢測(cè)等情況下，HDA展示了卓越的簡(jiǎn)便性和實(shí)用性，如今已被廣泛應(yīng)用于病原體檢測(cè)和SNP分型。[0003]早期HDA在較低的溫度（約37°C)下進(jìn)行，利用大腸桿菌UvrD解旋酶和另外兩種輔助蛋白MutL和單鏈結(jié)合蛋白來(lái)實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增反應(yīng)。為了進(jìn)一步提高HDA的反應(yīng)效率，許多研究人員作了不懈努力。Kong的課題小組從嗜熱厭氧桿菌中克隆和純化出一種熱穩(wěn)定UvrD解旋酶（thermostableUvrDhelicase)來(lái)在更高的溫度（60~65°C)下實(shí)現(xiàn)HDA反應(yīng)，在無(wú)輔助蛋白體系內(nèi)實(shí)現(xiàn)高效擴(kuò)增。另外一種HDA改進(jìn)方法通過(guò)使用一種由解旋酶和DNA聚合酶融合而成的雙功能蛋白，能成功實(shí)現(xiàn)更長(zhǎng)片段（2.3kb)的擴(kuò)增。還有課題小組提出在擴(kuò)增之前用內(nèi)切酶處理目標(biāo)基因組DNA可加快HDA的速度和提高其靈敏度。另外，也有人研究得出：引物的5'端富含A或者C比含T或者G有利于得到更有效的擴(kuò)增反應(yīng)。盡管如此，引物二聚體依然存在。這個(gè)常見(jiàn)的問(wèn)題干擾了目標(biāo)核酸鏈的特異性積累，產(chǎn)生了錯(cuò)誤的檢測(cè)結(jié)果。[0004]最近，Zhang的課題小組報(bào)道一個(gè)新型的目標(biāo)轉(zhuǎn)換的HDA檢測(cè)方法消除了引物二聚體的干擾，實(shí)現(xiàn)對(duì)轉(zhuǎn)錄因子的超靈敏檢測(cè)。在整個(gè)HDA擴(kuò)增反應(yīng)中，他們僅使用單個(gè)引物，此引物與精心設(shè)計(jì)的發(fā)卡結(jié)構(gòu)模板的莖互補(bǔ)，消除了傳統(tǒng)HDA中引物對(duì)構(gòu)成的引物二聚體造成的非特異性擴(kuò)增。然而，此方法額外使用外切酶完全消化未與目標(biāo)物結(jié)合的發(fā)卡模板并需要對(duì)外切酶進(jìn)行加熱滅活以防止背景信號(hào)產(chǎn)生。再者，由于此方法基于給定的發(fā)卡模板，不能用于其他核酸鏈的擴(kuò)增以及各種非核酸目標(biāo)物的檢測(cè)。[0005]目前為止，還沒(méi)有簡(jiǎn)單通用的方法能夠完全消除引物二聚體造成的背景。隨著HDA應(yīng)用范圍的擴(kuò)大，亟需發(fā)展一種通用而簡(jiǎn)單的方法來(lái)進(jìn)一步改善HDA的應(yīng)用?！?br/>發(fā)明內(nèi)容】[0006]為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一種消除引物二聚體的零背景解旋酶依賴體系及擴(kuò)增方法和應(yīng)用，該方法簡(jiǎn)單實(shí)用、通用性強(qiáng)、效果好；該體系能夠?qū)崿F(xiàn)零背景的HDA。[0007]本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)：[0008]本發(fā)明公開(kāi)了一種消除引物二聚體的零背景解旋酶依賴體系，該體系包括：2.5yL的IOX退火緩沖液II，1yL的IOOmMMgS04、2yL的500mMNaCl、lyL的5μΜ反向引物、IyL的5μΜ正向引物、IyL的52.5mMATP溶液、IyL的3.5mMdNTPs、0.75yL的IsoAmpli酶混合物及1μL的5XSYBRGreenI。[0009]優(yōu)選地，選取40bp的鏈作為模板鏈，則以模板鏈5'端的18個(gè)堿基相同的ISbp的鏈作為正向引物，以與模板鏈3'端24個(gè)堿基互補(bǔ)的24bp的鏈作為反相引物。[0010]本發(fā)明還公開(kāi)了一種消除引物二聚體的零背景解旋酶依賴擴(kuò)增方法，包括以下步驟：[0011]1)根據(jù)待擴(kuò)增的目的片段模板設(shè)計(jì)引物，包括正向引物和反向引物；[0012]2)構(gòu)建HDA反應(yīng)體系，包括：正向引物、反向引物、模板、緩沖液、反應(yīng)所需的酶以及ATP和dNTPs;[0013]3)將體系中各個(gè)反應(yīng)物混合均勻，進(jìn)行HDA等溫?cái)U(kuò)增，根據(jù)熒光信號(hào)檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果，判斷實(shí)現(xiàn)零背景旋酶依賴擴(kuò)增反應(yīng)。[0014]步驟2)所述的HDA反應(yīng)體系參照標(biāo)準(zhǔn)的HDA反應(yīng)體系，對(duì)ATP和dNTPs濃度做調(diào)低處理。[0015]步驟3)所述的熒光信號(hào)檢測(cè)擴(kuò)增是采用Light-Cyeteri)96System進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)，每60s測(cè)定一次，設(shè)定溫度為60°C。[0016]所述的模板為合成的單鏈或經(jīng)過(guò)細(xì)胞端粒酶擴(kuò)增之后的單鏈。[0017]優(yōu)選地，消除引物二聚體的零背景解旋酶依賴擴(kuò)增方法，包括以下步驟：[0018]1)根據(jù)模板序列，設(shè)計(jì)正向引物和反向引物：[0019]模板序列為：5'-MTCCGTCGAGCAGAGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG-3'；[0020]設(shè)計(jì)正向引物為：5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3'；[0021]設(shè)計(jì)反向引物為：5'-CCCTAACCCTAACCCTAACCCTAA-3'；[0022]2)構(gòu)建HDA反應(yīng)體系，包括：2.5yL的IOX退火緩沖液II，IyL的IOOmMMgS04、2yL的500mMNaClUyL的5μΜ反向引物、IyL的5μΜ正向引物、IyL的52.5mMATP溶液、1μL的3.5mMdNTPs、0.75μL的IsoAmp?酶混合物及1μL的5XSYBRGreenI;[0023]3)將體系中各個(gè)反應(yīng)物混合均勻，進(jìn)行HDA等溫?cái)U(kuò)增，根據(jù)熒光信號(hào)檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果，判斷實(shí)現(xiàn)零背景旋酶依賴擴(kuò)增反應(yīng)。[0024]本發(fā)明還公開(kāi)了上述消除引物二聚體的零背景解旋酶依賴體系在檢測(cè)細(xì)胞端粒酶活性中的應(yīng)用。[0025]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果：[0026]本發(fā)明針對(duì)HDA體系中引物二聚體造成的假陽(yáng)性信號(hào)，通過(guò)使用適當(dāng)?shù)蜐舛鹊腁TP和dNTPs來(lái)消除體系中的引物二聚體，得到簡(jiǎn)單而通用的零背景HDA檢測(cè)方法。此方法無(wú)需增加額外的加熱滅活步驟或者額外的酶，也無(wú)需精心設(shè)計(jì)的結(jié)構(gòu)特殊的引物，只需要適當(dāng)降低原體系中ATP和dNTPs的濃度即可完全消除引物二聚體引起的假陽(yáng)性背景，具有簡(jiǎn)單方便，通用性強(qiáng)，效果好等優(yōu)點(diǎn)。具體優(yōu)勢(shì)如下：[0027]1、本發(fā)明解決了傳統(tǒng)HDA技術(shù)中常見(jiàn)的由引物二聚體引發(fā)的非特異性擴(kuò)增造成的假陽(yáng)性問(wèn)題，消除了引物二聚體的擴(kuò)增背景；[0028]2、本發(fā)明相比于一些只是減少引物二聚體擴(kuò)增背景的技術(shù)，徹底消除了引物二聚體的擴(kuò)增背景，徹底解決引物二聚體引發(fā)的問(wèn)題；[0029]3、本發(fā)明相比于需要添加特殊酶、需要特殊結(jié)構(gòu)的引物或需要增加額外的酶滅活步驟的其他HDA改良技術(shù)來(lái)說(shuō)，僅需在原HDA體系中適當(dāng)降低ATP和dNTPs的濃度，即可實(shí)現(xiàn)零背景的HDA，無(wú)需額外步驟，額外成本，且具有通用性，效果更好?！靖綀D說(shuō)明】[0030]圖1為本發(fā)明的方法流程示意圖；[0031]圖2為不同ATP濃度下HDA的實(shí)時(shí)熒光曲線圖；[0032]圖3為不同dNTPs濃度下的HDA的實(shí)時(shí)熒光曲線圖；[0033]圖4為零背景HDA對(duì)端粒酶活性的檢測(cè)原理圖；[0034]圖5為在零背景HDA中添加或者不添加HeLa提取物的熒光實(shí)時(shí)曲線圖；[0035]圖6為在零背景HDA中加入不同數(shù)量細(xì)胞端粒酶擴(kuò)增產(chǎn)物的實(shí)時(shí)熒光曲線圖；[0036]圖7為細(xì)胞數(shù)量的對(duì)數(shù)和熒光強(qiáng)度的線性關(guān)系；[0037]圖8為零背景HDA對(duì)不同細(xì)胞系的端粒酶活性的檢測(cè)結(jié)果。【具體實(shí)施方式】[0038]下面結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，所述是對(duì)本發(fā)明的解釋而不是限定。[0039]參見(jiàn)圖1，本發(fā)明的消除引物二聚體的零背景解旋酶依賴擴(kuò)增方法，包括以下步驟：[0040]1)根據(jù)待擴(kuò)增的目的片段模板設(shè)計(jì)引物，包括正向引物和反向引物；[0041]2)構(gòu)建HDA反應(yīng)體系，包括：正向引物、反向引物、模板、緩沖液、反應(yīng)所需的酶以及ATP和dNTPs;[0042]3)將體系中各個(gè)反應(yīng)物混合均勻，進(jìn)行HDA等溫?cái)U(kuò)增，根據(jù)熒光信號(hào)檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果，判斷實(shí)現(xiàn)零背景旋酶依賴擴(kuò)增反應(yīng)。[0043]實(shí)施例1[0044]分別以三條合成的鏈作為模板，正向引物和反向引物[0045]1)模板，正向引物和反向引物的設(shè)計(jì)[0046]模板序列為：5'-MTCCGTCGAGCAGAGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG-3'；[0047]正向引物為：5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3'；[0048]反向引物為：5'-CCCTAACCCTAACCCTAACCCTAA-3'；[0049]以合成的40bp鏈為模版，以與模板鏈5'端前18個(gè)堿基相同的18bp的鏈為正向引物，以與模板鏈3'端24個(gè)堿基互補(bǔ)的24bp的鏈作為反向引物，這時(shí)這一對(duì)引物會(huì)有兩個(gè)堿基互補(bǔ)，極可能發(fā)生引物二聚體非特異性擴(kuò)增，通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明引物二聚體引發(fā)的非特異性擴(kuò)增的確產(chǎn)生了。[0050]2)零背景HDA的實(shí)施當(dāng)前第1頁(yè)1 2