一種生物轉(zhuǎn)化法合成α-酮戊二酸的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物化工技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，是關(guān)于一種生物轉(zhuǎn)化法合成α -酮戊 二酸的方法。 (二）
【背景技術(shù)】
[0002] α -酮戊二酸（a -ketoglutaric acid)，又名α -羰基戊二酸、2-氧代戊二酸或 α -膠酮酸，CAS號為328-50-7。α -酮戊二酸是三羧酸（TCA)循環(huán)中重要的中間產(chǎn)物之 一，在細(xì)胞物質(zhì)代謝和能量代謝中起著重要的作用。它作為重要的中間體，是合成多種氨基 酸、維生素的重要前體。α -酮戊二酸在醫(yī)藥、有機(jī)合成、營養(yǎng)強(qiáng)化劑等領(lǐng)域有著重要的應(yīng) 用前景，目前其主要應(yīng)用的領(lǐng)域有：作為運(yùn)動功能飲料的成分、有機(jī)合成中的中間體、肝功 能檢測的配套試劑和體格增強(qiáng)劑；降低術(shù)后患者和長期病人的機(jī)體損耗；還有研究表明， α-酮戊二酸具有抗氰作用，與亞硝酸鈉、硫代硫酸鈉配合使用可提高抗氰能力，具有抗驚 厥作用。
[0003]目前α -酮戊二酸的生產(chǎn)工藝主要是化學(xué)合成法。化學(xué)合成法以琥珀酸和草酸二 乙酯為原料經(jīng)化學(xué)反應(yīng)制備，由于成本過高、污染嚴(yán)重而面臨被淘汰。α -酮戊二酸的生產(chǎn) 也可以采用生物發(fā)酵法或生物轉(zhuǎn)化法，相對于化學(xué)合成法，生物法具有生產(chǎn)條件溫和、工藝 步驟簡單、對環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)。近些年來，生物法合成α-酮戊二酸的研究取得了很大進(jìn) 展，發(fā)酵單位或轉(zhuǎn)化率有大幅度提高，但生產(chǎn)成本仍高于化學(xué)合成法，工業(yè)化應(yīng)用尚有一定 困難。
[0004] 近幾年來國內(nèi)關(guān)于生物法合成α-酮戊二酸有較多研究報(bào)道，并申請了一些 專利。如江南大學(xué)的陳堅(jiān)等人利用重組解脂耶氏酵母菌（Yarrowia Iipolytica)發(fā) 酵生產(chǎn)α-酮戊二酸，發(fā)酵144h，α-酮戊二酸的產(chǎn)量達(dá)到47. 2g/L(中國發(fā)明專利 ZL201210066444. 6);天津科技大學(xué)的陳寧等人利用對谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum)發(fā)酵生產(chǎn)α -酮戊二酸，發(fā)酵32h，α -酮戊二酸產(chǎn)量最高可達(dá)47. 2g/L (中國 發(fā)明專利ZL201110392778. 8)。但是，發(fā)酵法也有其缺點(diǎn)，如生產(chǎn)周期長，產(chǎn)品與發(fā)酵液中 多種成分混合在一起，導(dǎo)致提取與精制工藝復(fù)雜，總成本偏高。而生物轉(zhuǎn)化法或許能克服發(fā) 酵法的缺陷，可以提高產(chǎn)品濃度、簡化提取工藝、降低成本。如陶榮盛等人采用L-谷氨酸氧 化酶對L-谷氨酸或其鹽進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，生成α -酮戊二酸的濃度可高達(dá)138. 5g/L，摩爾得 率達(dá)80%以上（中國發(fā)明專利申請?zhí)?01310134674. 6)。但該發(fā)明需要制備L-谷氨酸氧 化酶，而且在催化反應(yīng)時(shí)需要添加商品過氧化氫酶，所以生產(chǎn)中酶的成本較高。江南大學(xué) 的陳堅(jiān)等人還報(bào)道了一種采用全細(xì)胞轉(zhuǎn)化L-谷氨酸生產(chǎn)α -酮戊二酸的方法，通過易錯(cuò) PCR或定點(diǎn)飽和突變改造 L-氨基酸脫氨酶基因，在枯草芽孢桿菌表達(dá)后轉(zhuǎn)化L-谷氨酸生成 α -酮戊二酸，摩爾得率可達(dá)85%以上，但底物濃度僅為15g/L，產(chǎn)量有待提高。 (三）

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明目的是提供一種利用馬克斯克魯維酵母（Kluyveromyces marxianus) ATCC36534全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化L-谷氨酸合成α -酮戊二酸的方法，以酵母細(xì)胞為生物催化劑， L-谷氨酸為原料，全細(xì)胞法生物轉(zhuǎn)化合成α -酮戊二酸。在高糖低氮培養(yǎng)基中，添加脫氫酶 抑制劑，阻止α-酮戊二酸被進(jìn)一步代謝，從而促進(jìn)α-酮戊二酸的積累，如此就可以將廉 價(jià)的L-谷氨酸轉(zhuǎn)化為價(jià)格更高的α -酮戊二酸，解決了目前發(fā)酵法、酶法和全細(xì)胞轉(zhuǎn)化法 生產(chǎn)成本較高的問題，具有較高的工業(yè)化應(yīng)用價(jià)值。
[0006] 本發(fā)明全細(xì)胞法生物轉(zhuǎn)化合成α -酮戊二酸反應(yīng)式：
[0008] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0009] 本發(fā)明提供一種生物轉(zhuǎn)化法合成α -酮戊二酸的方法，所述方法以L-谷氨酸為底 物，于馬克斯克魯維酵母（Kluyveromyces marxianus)ATCC36534經(jīng)轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得 的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)液中，加入α -酮戊二酸脫氫酶抑制劑，在25~30°C、200~250r/min振蕩條 件下進(jìn)行合成培養(yǎng)，合成培養(yǎng)結(jié)束后，合成培養(yǎng)液經(jīng)分離純化得到所述的α -酮戊二酸；所 述α-酮戊二酸脫氫酶抑制劑為過氧化氫（H2O2)或甲氨蝶呤中的一種或兩種的混合；所述 轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基的組成為（試劑均為市售分析純或生物試劑）：蔗糖50~100g/L，酵母浸出粉 10 ~20g/L，KH2P04 3 ~5g/L，K2HP04 5 ~6. 5g/L，MgS04 0· 5 ~1.0 g/L，溶劑為水，pH 值自 然。
[0010] 進(jìn)一步，所述的底物在轉(zhuǎn)化培養(yǎng)液中的添加量為20~50g/L。所述的底物L(fēng)-谷氨 酸（CAS:56-86-0)為市售原料，純度彡98%。
[0011] 進(jìn)一步，所述的α-酮戊二酸脫氫酶抑制劑添加量以轉(zhuǎn)化培養(yǎng)液體積計(jì)為 0. 0005~50mmol/L。所述的α -酮戊二酸脫氫酶抑制劑為H2O2時(shí)，所述H 202以質(zhì)量濃度 30%的H2O2水溶液的形式加入，H2O2水溶液中H 2O2的加入量以轉(zhuǎn)化培養(yǎng)液體積計(jì)為10~ 50mmol/L。所述的α-酮戊二酸脫氫酶抑制劑為甲氨蝶呤時(shí)，所述甲氨蝶呤以lmmol/L的 甲氨蝶呤水溶液的形式加入，所述甲氨蝶呤水溶液中甲氨蝶呤加入量以轉(zhuǎn)化培養(yǎng)液體積計(jì) 為0. 5~I ymol/L。所述的α -酮戊二酸脫氫酶抑制劑為H2O2和甲氨蝶呤的混合時(shí)，所述 H2O2以質(zhì)量濃度30%的H2O2水溶液的形式加入，H 2O2水溶液中H2O2的加入量以轉(zhuǎn)化培養(yǎng)液 體積計(jì)為40mmol/L，所述甲氨蝶呤以lmmol/L的甲氨蝶呤水溶液的形式加入，所述甲氨蝶 呤水溶液中甲氨蝶呤加入量以轉(zhuǎn)化培養(yǎng)液體積計(jì)為〇. 8 μ mol/L。所述的α -酮戊二酸脫氫 酶抑制劑的作用是抑制α-酮戊二酸脫氫酶的活性，阻斷α-酮戊二酸進(jìn)一步的代謝，從而 α-酮戊二酸得以積累。
[0012] 本發(fā)明所述馬克斯克魯維酵母ATCC36534以干菌體濃度6~10g/L的轉(zhuǎn)化液形式 與底物進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，所述轉(zhuǎn)化液是將馬克斯克魯維酵母ATCC36534斜面菌體接種至轉(zhuǎn)化 培養(yǎng)基或?qū)⒏删w濃度5~7g/L的種子液以體積百分?jǐn)?shù)5-10 %的接種量接種至轉(zhuǎn)化培養(yǎng) 基經(jīng)轉(zhuǎn)化培養(yǎng)獲得的。
[0013] 具體的，本發(fā)明所述生物轉(zhuǎn)化法合成α -酮戊二酸的步驟如下：
[0014] (1)將冰箱保存的馬克斯克魯維酵母ATCC36534的菌體接種于新鮮斜面培養(yǎng)基， 于25~30°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24~36h，得到活化后的馬克斯克魯維酵母ATCC36534菌 種。所述的斜面培養(yǎng)基組成為：葡萄糖10~20g/L，蛋白胨5~10g/L，酵母浸出粉3~5g/ L，瓊脂15~20g/L，溶劑為水，pH自然（實(shí)測6. 3~6. 5)，高壓蒸汽121°C滅菌15~20min。
[0015] (2)用接種環(huán)挑取步驟（1)活化培養(yǎng)后馬克斯克魯維酵母ATCC36534斜面菌體 2~3環(huán)，接種至種子培養(yǎng)基。接種后的種子培養(yǎng)基于25~30°C、200~250r/min振蕩條 件下培養(yǎng)20~24h，得干菌體濃度為5~7g/L的種子液。所述的種子培養(yǎng)基組成除不加瓊 脂外，其他成分同步驟（1)中的斜面培養(yǎng)基，在三角瓶中的裝量為其容積的20%~40%，三 角瓶8層扎口，高壓蒸汽121°C滅菌15~20min。
[0016] (3)用接種環(huán)挑取步驟（1)活化培養(yǎng)后馬克斯克魯維酵母ATCC36534斜面菌體 3~5環(huán)，或步驟（2)制備的種子液，按體積百分?jǐn)?shù)5%~10%的量接入轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基，于25~ 30°C、200~250r/min振蕩條件下培養(yǎng)20~24h，獲得干菌體濃度為6~10g/L，加入終濃 度為10~50mmol/L的H2O2，或終濃度為0. 5~I. 0 ymol/L的甲氨蝶呤，或兩者同時(shí)添加； 再加入終濃度為20~50g/L的L-谷氨酸。三角瓶在