檢測多種新生兒遺傳代謝病致病基因的引物及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)檢測領(lǐng)域，特別涉及一種可用于二代測序平臺的新 生兒遺傳代謝病基因檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 遺傳性代謝病（inherited metabolic diseases, IMD)又稱為先天性代謝缺陷病 (inborn errors of metabolism，IEM)是因為維持機體正常代謝所必需的某種酶、運載蛋 白、膜或受體等的編碼基因發(fā)生突變，使其編碼的產(chǎn)物功能發(fā)生改變，而出現(xiàn)相應(yīng)的實驗室 檢查異常和臨床癥狀的一類疾病。它涉及氨基酸、有機酸、脂肪酸、尿素循環(huán)、碳水化合物、 溶酶體、類固醇等多種物質(zhì)代謝的異常。該類疾病大多為單基因遺傳病，少數(shù)為線粒體基因 遺傳病。這類疾病發(fā)病后常呈進行性加重，如未能早期識別診斷、干預(yù)、治療，常導(dǎo)致早期夭 折或終身殘疾，且以神經(jīng)、智力殘疾為最多，會嚴重影響人口素質(zhì)，造成家庭和社會的沉重 負擔(dān)。因此開展IEM的早期篩查，實現(xiàn)早期診斷成為IMD防治的關(guān)鍵，避免和減少殘疾兒童 的發(fā)生，對提高人口素質(zhì)，推動國民經(jīng)濟發(fā)展有著重要的意義。
[0003] 目前，頂D的診斷方法主要有尿顯色分析、枯草桿菌抑制試驗、酶活性測定、氣相色 譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS)、串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（MS/MS)、單基因分析等。這些診斷方法用 于頂D篩查具有局限性：（1)普遍通量低，一般一次只能檢測一種至幾十種，不能滿足頂D 可檢出病種的逐年增多，并且需要對遺傳性代謝病有準確的預(yù)判；（2)不同頂D的檢測方法 各異，樣本多樣，如一些疾病檢測蛋白水平、而另一些疾病則檢測基因水平，有些疾病需要 尿液樣本、而另一些則需要血液樣本。因此不大適合以此開展大規(guī)模的遺傳性代謝病的篩 查，亟需要一種能高通量檢測MD多種疾病的技術(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種常見新生兒遺傳代謝病相關(guān)基因的高效檢 測方法，本發(fā)明的檢測方法旨在降低檢測成本。
[0005] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種用于新生兒遺傳代謝疾病基因體外定性 檢測的引物的設(shè)計方式，包括如下步驟：
[0006] 1)、獲得遺傳病相關(guān)的致病基因信息：
[0007] 通過OM頂數(shù)據(jù)庫獲得多種（例如為22種）遺傳性疾病相關(guān)的致病基因信息，包 括基因位置信息、突變位點信息，然后根據(jù)得到的基因信息從NCBI數(shù)據(jù)庫得到相關(guān)基因的 外顯子及內(nèi)含子信息；
[0008] 2)、針對相關(guān)基因設(shè)計引物：
[0009] 對于每個基因的外顯子及外顯子內(nèi)含子結(jié)合區(qū)域設(shè)計對應(yīng)的特異性引物Fl和 R1，設(shè)計原則為：每個外顯子外延5bp，以保證將外顯子內(nèi)含子結(jié)合區(qū)域包含在內(nèi)；引物序 列區(qū)保守，即不存在突變或SNP，Tm值均一，Tm值的差異在5°C之內(nèi)；擴增產(chǎn)物至少有IObp 的重疊區(qū)；在每對引物前加上一段自行設(shè)計的序列Al和A2以及一段6個堿基的識別序列， 用以二代測序結(jié)果的識別；引物Fl和Rl的序列組成圖見原理圖，圖I ;
[0010] 備注說明：Al對應(yīng)的是Fl，A2對應(yīng)的是R1。
[0011] 由于很多基因會由可變剪切形成的不同外顯子組合構(gòu)成的不同轉(zhuǎn)錄本，剪接成每 個轉(zhuǎn)錄本的外顯子在數(shù)量或大小上也有所不同，本發(fā)明中涉及到的基因的外顯子是將目前 NCBI中已發(fā)現(xiàn)的不同轉(zhuǎn)錄本的外顯子集合為設(shè)計引物的模板，原理見圖2。
[0012] 每個擴增片段長度約300bp。
[0013] Al和A2的序列如下：
[0014] Al(5' -3' ） ：TCTTTCCCTACCGACGCTCTTCCGATCT
[0015] A2(5' -3' ） ：GTGACTGGAGTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
[0016] 識別序列有 12 個（擇一使用），分別為 ATCACG，TTAGGC，ACAGTG，TGACCA，GCCAAT， CAGATC，ACTTGA，ATCACG，TAGCTT，GGCTAC，CTTGTA，GATCAG，每段識別序列可隨機加到 Fl 和 Rl中，F(xiàn)l和Rl中識別序列的組合方式可以作為測序結(jié)果中樣品和基因的識別信號。
[0017] 本發(fā)明還同時提供了用于新生兒遺傳代謝疾病基因體外定性檢測的引物：綜合征 型耳聾的第一輪PCR引物序列表如下表1 ;G6H)基因的第一輪PCR引物序列表如下表2 ; SLC12A3基因第一輪PCR引物序列表如下表3 ;
[0018] 表 1
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[0030] 本發(fā)明還同時提供了一種試劑盒，該試劑盒含有上述表1~表3所述的引物，該試 劑盒能同時檢測多種新生兒遺傳病。
[0031] 具體而目，該試劑盒可以用于檢測苯丙酬尿癥、精氣酸血癥、精氣基瑰?自酸尿癥、 瓜氨酸血癥I型、瓜氨酸血癥II型、楓糖尿癥、酪氨酸血癥I型、酪氨酸血癥II型、酪氨酸 血癥III型、鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶缺乏癥、半乳糖血癥、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥、異 戊酸血癥、丙酸血癥、戊二酸血癥I型、肉堿轉(zhuǎn)運障礙、肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶I缺乏癥、肉堿棕 櫚酰轉(zhuǎn)移酶II缺乏癥、遺傳性非綜合征耳聾、Gitelman綜合征這22種常見新生兒遺傳病 相關(guān)的基因。
[0032] 本發(fā)明還同時提供了一種新生兒遺傳代謝疾病基因體外定性檢測的方法。
[0033] 本發(fā)明的方案具體如下：
[0034] 1、獲得遺傳病相關(guān)的致病基因信息（同上）；
[0035] 2、針對相關(guān)基因設(shè)計引物（同上），
[0036] 3、PCR擴增目的片段：
[0037] 以人的基因組DNA為模板，起始量為20ng，進行PCR擴增，得到兩端分別帶有Al和 A2機識別序列的目的片段，并進行純化，得到第一次PCR產(chǎn)物Pl。
[0038] 4、以Pl為模板，進行第二輪PCR擴增。
[0039] 針對第一次的PCR產(chǎn)物Pl設(shè)計第二輪PCR的引物F2和R2,F2和R2的序列如下：
[0040] F2(5'-3'）：
[0041] ATGATACGGCGACCACCGGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTC
[0042] R2(5'-3'）：
[0043] CAGCAGAAGACGGCATACGAGTCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTG
[0044] 以Pl為模板，起始量為50ng，進行第二輪PCR擴增，得到產(chǎn)物P2,對P2進行純化， 即得到了可以直接用Illumina二代測序平臺進行測序的文庫L。
[0045] 利用本發(fā)明的方法只進行兩輪PCR擴增便可以快速地獲得致病基因相關(guān)的外顯 子、外顯子內(nèi)含子結(jié)合區(qū)序列的測序文庫，直接可以利用Illumina測序平臺進行高通量測 序，對于一個樣本多個基因的多個外顯子，可以將第一輪PCR產(chǎn)物純化后進行等量混合之 后，作為一個模板進行第二輪PCR擴增，大大節(jié)省了操作時間和費用。
[0046] 該方法的原理圖如圖1和圖2所示。
[0047] 本發(fā)明所述的方法可以用于檢測苯丙酮尿癥、精氨酸血癥、精氨基琥珀酸尿癥、瓜 氨酸血癥I型、瓜氨酸血癥II型、楓糖尿癥、酪氨酸血癥I型、酪氨酸血癥II型、酪氨酸血 癥III型、鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶缺乏癥、半乳糖血癥、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥、異戊 酸血癥、丙酸血癥、戊二酸血癥I型、肉堿轉(zhuǎn)運障礙、肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶I缺乏癥、肉堿棕櫚 酰轉(zhuǎn)移酶II缺乏癥、遺傳性非綜合征耳聾、Gitelman綜合征等22種常見新生兒遺傳病相 關(guān)的基因（如表4所示），該試劑盒可以對22種常見新生兒遺傳代謝病相關(guān)的40個致病基 因的外顯子及外顯子內(nèi)含子結(jié)合區(qū)域的序列進行二代測序和分析、應(yīng)用該試劑盒能夠準確 尚效的檢測相關(guān)基因的突變?目息，實現(xiàn)對多種新生兒遺傳病的尚效檢測，并能大大降低檢 測成本。
[0048] 該試劑盒包括的常見新生兒遺傳代謝病及相關(guān)基因見表4 :
[0049] 表4 22種常見新生兒遺傳病的基因信息表
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[0052] 綜上所述，本發(fā)明針對常見且危害性較高的新生兒遺傳代謝性疾病，如苯丙酮尿 癥、精氨酸血癥、楓糖尿癥、鳥氨酸氨甲酰基轉(zhuǎn)移酶缺乏癥、半乳糖血癥、葡萄糖-6-磷酸脫 氫酶缺乏癥、異戊酸血癥、遺傳性非綜合征耳聾、Gitelman綜合征等22種常見遺傳性疾病， 針對常見致病基因設(shè)計相應(yīng)引物，通過多重PCR擴增外顯子、外顯子內(nèi)含子結(jié)合區(qū)域，采用 擴增子測序方法，能夠高通量檢測遺傳性疾病，用以快速、簡便、高效地篩查遺傳性疾病，實 現(xiàn)疾病的早期診斷和早期治療，減少遺傳病的致死率和致殘率，減輕家庭和社會的負擔(dān)。
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