一種ngal時(shí)間分辨熒光納米免疫層析定量檢測(cè)試紙條及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于免疫層析檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種NGAL時(shí)間分辨巧光納米免疫層 析定量檢測(cè)試紙條及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 急性腎損傷(Acute kidney injury，AKI)是由多種原因引起的腎功能在短時(shí)間內(nèi) 下降而出現(xiàn)的臨床綜合征。迄今為止，AKI依然是十分常見而嚴(yán)重的臨床問題。如果在AKI的 早期階段進(jìn)行治療，可W很大程度上降低腎衰竭的發(fā)生。因此盡早診斷AKI已成為腎病治療 的一個(gè)關(guān)鍵因素。但缺乏特異性的早期臨床診斷指標(biāo)，是治療該病的主要障礙，導(dǎo)致AKI的 發(fā)生率、病死率居高不下。人類中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)載脂蛋白（NGAL，載脂蛋白-2)是由中 性粒細(xì)胞和某些上皮細(xì)胞如腎小管所表達(dá)的微量蛋白。缺血性或腎毒性腎損傷時(shí)，NGAL由 腎臟大量表達(dá)，并被釋放到尿液和血漿。NGAL含量在損傷發(fā)生后2小時(shí)內(nèi)升高，是一種早期 且敏感的腎損傷標(biāo)志，成為一種高效的新型AKI早期腎損傷臨床診斷標(biāo)志物。截止目前還未 有一種NGAL時(shí)間分辨巧光納米免疫層析定量檢測(cè)試紙條。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供了一種NGAL時(shí)間分辨巧光納米 免疫層析定量檢測(cè)試紙條及其制備方法。
[0004] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案之一是：
[0005] -種NGAL時(shí)間分辨巧光納米免疫層析定量檢測(cè)試紙條，包括背襯底板，該背襯底 板上設(shè)置有硝酸纖維素膜、樣品結(jié)合墊和吸水膜，該樣品結(jié)合墊和吸水膜分別疊壓在硝酸 纖維素膜的兩端上;該樣品結(jié)合墊上包被有時(shí)間分辨巧光物質(zhì)標(biāo)記的NGAL單克隆抗體;該 硝酸纖維素膜上設(shè)有檢測(cè)線和質(zhì)控線，該檢測(cè)線包被有另一個(gè)表位的NGAL單克隆抗體，該 質(zhì)控線包被有羊抗鼠 IgG。
[0006] 一實(shí)施例中：所述時(shí)間分辨巧光物質(zhì)為銅系元素、銅系元素與乳膠的結(jié)合物、銅系 元素的馨合物中的一種。
[0007] -實(shí)施例中:所述銅系元素為館，鋪，衫或鋪中的一種。
[000引一實(shí)施例中:所述樣品結(jié)合墊為玻璃纖維素膜或聚醋膜。
[0009] 一實(shí)施例中：所述樣品結(jié)合墊為玻璃纖維素膜或聚醋膜經(jīng)含有表面活性劑的緩沖 液預(yù)封閉后干燥而得。
[0010] -實(shí)施例中:所述試紙條外還包衷有一殼體。
[0011] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案之二是：
[0012] 上述的NGAL時(shí)間分辨巧光納米免疫層析定量檢測(cè)試紙條的制備方法，包括：
[0013] 1)將硝酸纖維素膜固定在背襯底板上；用憐酸鹽緩沖液將另一個(gè)表位的NGAL單克 隆抗體稀釋至0.9~1. Img/ml，用0.04~0.06M的MES緩沖液將羊抗鼠 IgG抗體稀釋至0.9~ 1. Img/ml，再分別將稀釋后的NGAL單克隆抗體和羊抗鼠 IgG抗體均勻劃至硝酸纖維素膜上， 制備檢測(cè)線和質(zhì)控線;36~38°C干燥過夜；
[0014] 2)取0.18~0.22皿的時(shí)間分辨巧光物質(zhì)乳膠微球，與0.04~0.06M的MES緩沖液均 勻混合，超聲分散使得乳膠微球均勻分散于MES緩沖液中；加入18~22mg/ml的抓C溶液，常 溫振蕩活化25~35min后，離屯、，去除上清；用0.04~0.06M的抑7.4~7.6的棚酸緩沖液復(fù) 溶洗涂若干次后，超聲分散，加入0.9~1. Img/ml的NGAL單克隆抗體溶液，常溫振蕩1.5~ 2. 化后，離屯、，去除上清，再加入封閉液，常溫、140~18化pm下振蕩封閉0.5~1.化;離屯、，去 除上清，再加入偶聯(lián)存儲(chǔ)液，超聲分散，即得標(biāo)記有時(shí)間分辨巧光物質(zhì)乳膠微球的NGAL單克 隆抗體;所述時(shí)間分辨巧光物質(zhì)乳膠微球、MES緩沖液、EDC溶液、每次加入的棚酸緩沖液、 NGAL單克隆抗體溶液、封閉液、偶聯(lián)儲(chǔ)存液的體積比為1.8~2.2:9~11:0.9~1.1:9~11: 0.9 ~1.1:9 ~11:9 ~11;
[001引3)取玻璃纖維素膜，用含有表面活性劑的緩沖液進(jìn)行預(yù)封閉后，45~55°C干燥過 夜;將步驟2)得到的標(biāo)記有時(shí)間分辨巧光物質(zhì)乳膠微球的NGAL單克隆抗體按照9~lliil/cm 的量超聲噴霧至干燥好的玻璃纖維素膜上，45~55°C干燥過夜，制備得到樣品結(jié)合墊；
[0016] 4)將步驟3)得到的樣品結(jié)合墊固定疊壓在步驟1)得到的硝酸纖維素膜的一端，并 將吸水膜固定疊壓在硝酸纖維素膜的另一端，裁剪，并裝入層析條殼體中，即得成品。
[0017] -實(shí)施例中：所述步驟3)中，含有表面活性劑的緩沖液為95~105mM的pH 7.3~ 7.5的口8緩沖液，且其中含有1.4~1.6%船(：1，4.8~5.2%654、0.4~0.6%吐溫-20和4.8~ 5.2%薦糖。
[001引一實(shí)施例中：所述步驟2)中，封閉液為38~42mM的pH 7.4~7.6的甘氨酸溶液，且 其中含有4.8~5.2%BSA、0.09~0.11 %疊氮鋼。
[0019] -實(shí)施例中：所述步驟2)中，偶聯(lián)儲(chǔ)存液為38~42mM的抑7.4~7.6的甘氨酸溶液 且其中含有4.8~5.2%BSA、0.09~0.11 %疊氮鋼，0.9~1.1 %化Cl，4~32%海藻糖，0.08 ~3.5 %聚合物;該聚合物為PEG20000，PVP，PVA中的一種。
[0020] 本技術(shù)方案與【背景技術(shù)】相比，它具有如下優(yōu)點(diǎn)：
[0021] 1.傳統(tǒng)的定量檢測(cè)試紙條分別設(shè)有樣品墊和結(jié)合墊，血清/血漿等樣品首先與樣 品墊接觸，樣品墊對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理，去除樣品中雜質(zhì)顆粒，調(diào)節(jié)樣品液抑值或粘度等，減 緩樣品滲透速度，有利于樣品的均勻分布;經(jīng)樣品墊預(yù)處理過后的均勻的樣品再流動(dòng)至結(jié) 合墊上與標(biāo)記抗體發(fā)生結(jié)合，才能夠保證定量反應(yīng)的準(zhǔn)確性，如果不經(jīng)預(yù)處理，樣品在結(jié)合 墊上的結(jié)合量無法把握，且結(jié)合穩(wěn)定性也差，更加難W實(shí)現(xiàn)定量效果;而本發(fā)明采用一個(gè)樣 品結(jié)合墊代替?zhèn)鹘y(tǒng)的樣品墊和結(jié)合墊，制備得到的樣品結(jié)合墊上準(zhǔn)確而均勻地分布有標(biāo)記 抗體，既能保證樣品得到預(yù)處理，又能保證樣品結(jié)合一定量的標(biāo)記抗體，保證了定量反應(yīng)的 準(zhǔn)確性，經(jīng)檢測(cè)，準(zhǔn)確度和精密度良好;同時(shí)，也簡(jiǎn)化了試紙條的結(jié)構(gòu)和制備過程。
[0022] 2.本發(fā)明的NGAL時(shí)間分辨巧光納米免疫層析定量檢測(cè)試紙條，利用時(shí)間分辨巧光 免疫分析(time-resolved fluo;r〇-immunoassay，TRFIA)運(yùn)種新型非放射性標(biāo)記免疫分析 技術(shù)。與傳統(tǒng)的巧光素標(biāo)記不同，采用具有獨(dú)特巧光特性的銅系元素及其馨合物作為時(shí)間 分辨巧光物質(zhì)，銅系元素激發(fā)光與發(fā)射光之間的Stokes位移較大，避免了激發(fā)及發(fā)射光譜 存在的重疊問題，排除激發(fā)光的干擾，通過波長(zhǎng)分辨方式使其明顯的區(qū)別于背景巧光;且銅 系元素激發(fā)光光譜較寬，可采用只允許發(fā)射巧光通過的濾光片，從而進(jìn)一步將搶特異性巧 光和背景巧光區(qū)分開，消除干擾;銅系離子馨合物的巧光衰變時(shí)間長(zhǎng)，為傳統(tǒng)巧光的103~ 106倍，通過測(cè)定時(shí)間差可W實(shí)現(xiàn)高信噪比；同時(shí)其可W反復(fù)接受激發(fā)，從而大大提高儀器 探測(cè)到的信號(hào)值，有效排除樣品自然巧光的干擾，具有靈敏度高，特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好和無 放射性污染等特點(diǎn)，可廣泛應(yīng)用于NGAL的臨床免疫檢驗(yàn)和科學(xué)研究中。
[0023] 3.本發(fā)明的NGAL時(shí)間分辨巧光納米免疫層析定量檢測(cè)試紙條制作方便，可批量生 產(chǎn);體積小，便于攜帶。
【附圖說明】
[0024] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
[0025] 圖1為本發(fā)明的NGAL時(shí)間分辨巧光納米免疫層析定量檢測(cè)試紙條結(jié)構(gòu)示意圖。
[0026] 附圖標(biāo)記:樣品結(jié)合墊1;時(shí)間分辨巧光物質(zhì)標(biāo)記的NGAL單克隆抗體2;硝酸纖維素 膜3;檢測(cè)線4;質(zhì)控線5;吸水膜6;背襯底板7。
【具體實(shí)施方式】
[0027] 下面通過實(shí)施例具體說明本發(fā)明的內(nèi)容：
[0028] 請(qǐng)查閱圖1，一種NGAL時(shí)間分辨巧光納米免疫層析定量檢測(cè)試紙條，包括背襯底板 7,該背襯底板7上設(shè)置有硝酸纖維素膜3、樣品結(jié)合墊1和吸水膜6,該樣品結(jié)合墊1和吸水膜 6分別疊壓在硝酸纖維素膜3的兩端上;該樣品結(jié)合墊1上包被有時(shí)間分辨巧光物質(zhì)標(biāo)記的 NGAL單克隆抗體2;該硝酸纖維素膜3上設(shè)有檢測(cè)線4(T線)和質(zhì)控線5(C線），檢測(cè)線4(T線） 包被有另一個(gè)表位的NGAL單克隆抗體，質(zhì)控線5(C線)包被有羊抗鼠 IgG。
[0029] 上述試紙條的具體制備方法為：
[0030] 1)硝酸纖維素膜(NC膜)處理
[0031 ]將NC膜貼至背襯底板的制定位置，取IOmM的pH 7.4憐酸鹽緩沖液將另一個(gè)表位的 NGAL單克隆抗體稀釋至Img/ml，用于制備T線；用0.05M的MES緩沖液將羊抗鼠 IgG抗體稀釋 至Img/ml，用于制備C線；按化Vcm劃液量，通過Modot劃膜儀將上述兩種稀釋后的抗體均 勻的劃至NC膜上制備T線和C線;將劃好的NC膜放置于37°C干燥箱中，干燥過夜。
[0032] 2)標(biāo)記時(shí)間分辨巧光物質(zhì)乳膠微球的NGAL單克隆抗體的制備
[0033] 取10化1的粒徑0.2皿的時(shí)間分辨巧光物質(zhì)乳膠微球，與50化1的0.05M的MES緩沖 液在離屯、管中均勻混合，冰浴下，使用JY92-IIDN型超聲波細(xì)胞破碎儀按超聲強(qiáng)度10%，超 聲3s暫停3s，總共超聲Imin的條件進(jìn)行超聲分散使得乳膠微球均勻分散于MES緩沖液中；加 入SOiil的20mg/ml的邸C溶液，常溫振蕩活化30min后，16000巧m離屯、30min，去除上清；用500 iil的0.05M的pH 7.5的棚酸緩沖液復(fù)溶，冰浴下超聲分散，離屯、洗涂一遍，再次離屯、，去除上 清后，再次加入50化1的0.05M的pH 7.5的棚酸緩沖液復(fù)溶，冰浴下超聲分散，加入50iil的 Img/ml的NGAL單克隆抗體溶液，常溫振蕩化后，離屯、，去除上清，再加入50化1封閉液，治愈 搖床常溫、ieOrpm下振蕩封閉化;封閉完成后，離屯、，去除上清，再加入50化1偶聯(lián)存儲(chǔ)液，超 聲分散，即得標(biāo)記有時(shí)間分辨巧光物質(zhì)乳膠微球的NGAL單克隆抗體;4°C保存?zhèn)溆茫?br>[0034] 3)樣品結(jié)合墊的處理
[0035] 取玻璃纖維素膜用含有表面活性劑的緩沖液浸泡IOmin進(jìn)行預(yù)封閉后，取出，漸干 水分，50°C干燥過夜;通過Biodot儀器的airjet噴頭，將步驟2)得到的標(biāo)記有時(shí)間分辨巧光 物質(zhì)乳膠微球的NGAL單克隆抗體稀釋10倍后，按照lOiil/cm的量超聲噴霧至干燥好的玻璃 纖維素膜上，50°C干燥過夜，制備得到樣品結(jié)合墊。
[0036] 本實(shí)施例之中，