一種利用自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療各種嚴(yán)重皮膚損傷的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于再生醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及體外分離、擴(kuò)增骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，以及制備生物制劑治療皮膚損傷等技術(shù)。
【背景技術(shù)】
[0002]皮膚是人體的第一道天然防御屏障，具有防止體液流失，阻擋外界的細(xì)菌病毒和異物等諸多功能，對人體起到保護(hù)作用。當(dāng)皮膚受到損傷時，要立即進(jìn)行治療使傷口閉合，否則會產(chǎn)生一系列并發(fā)癥狀如體內(nèi)電解質(zhì)紊亂、免疫平衡失調(diào)、膿毒癥、彌散性血管內(nèi)凝血等，嚴(yán)重時會危及生命。隨著現(xiàn)代醫(yī)療水平的提高，目前對于皮膚損傷已有突破性的治療方法，主要有金屬Ag及其衍生制劑、皮膚移植、人造皮膚等，但仍有一半以上的損傷對治療保持抗性，導(dǎo)致傷口長期不能愈合。一些嚴(yán)重性皮膚損傷，如:糖尿病足、急慢性皮膚潰爛、嚴(yán)重?zé)齻蛣?chuàng)傷及皮膚癌等，目前沒有有效的治療手段。在我國每年新增約70萬例嚴(yán)重性皮膚損傷的患者，而患者無法得到有效的治療，長期處于痛苦之中。
[0003]金屬Ag及其衍生制劑作為化學(xué)藥物治療法，在臨床上應(yīng)用較多。雖然此方法對于抗感染具有較好的療效，但近年來許多研究表明此方法對皮膚組織有毒性，不利于損傷部位皮膚再生。皮膚移植法雖然能在短時間內(nèi)使創(chuàng)傷部位閉合，但由于自體皮膚有限，對于較大面積的皮膚損傷仍無能為力，而異體皮膚移植存在免疫排斥，有一定風(fēng)險。人造皮膚通常是使用動物膠原組織制備人工皮膚，雖然人造皮膚可以批量化生產(chǎn)供應(yīng)，但其不具有自身皮膚的柔韌性，也不能促進(jìn)自身皮膚的生長。上述三種常用方法用于皮膚損傷治療后的復(fù)發(fā)率較高。目前還有一些利用皮膚細(xì)胞體外培養(yǎng)制備的人工皮膚，但存在移植后降解過快、疤痕較重等問題，也限制了其在臨床上的應(yīng)用。因此，尋找一種對于皮膚損傷治療安全性強、治愈率高，術(shù)后副作用小的方法已成為臨床上的熱門研究課題。
[0004]近年來干細(xì)胞治療作為一種新的治療人類疾病的途徑被廣泛關(guān)注，早在2002年Science就將其列為年度值得關(guān)注的六大熱門科技領(lǐng)域之首。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BoneMarrow Stem Cells, BMSCs)是一種來自人體骨髓組織中的單核細(xì)胞，且具有多種分化潛能。本發(fā)明采用自體BMSCs，除具有易于獲取、易于體外擴(kuò)增培養(yǎng)、臨床應(yīng)用安全性高等特點外，更避免了倫理學(xué)爭端。研究表明BMSCs可分化為血管細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、表皮細(xì)胞等皮膚再生的重要組成部分，為干細(xì)胞治療皮膚損傷提供了理論依據(jù)。本發(fā)明通過將自體擴(kuò)增的BMSCs涂抹到患者皮膚創(chuàng)傷部位表面或采用噴劑、敷療的方法作用于傷患處，利用干細(xì)胞的趨化性和損傷部位的人體微環(huán)境，定向分化為相應(yīng)皮膚組織，使損傷部位快速愈合。BMSCs與傳統(tǒng)方法治療皮膚損傷相比具有治愈時間短，治療后損傷部位復(fù)原效果好等優(yōu)勢，具有廣闊的臨床研究價值和市場前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明運用的核心技術(shù)為BMSCs的體外分離提取和培養(yǎng)擴(kuò)增、BMSCs細(xì)胞制劑的制備以及臨床治療技術(shù)的實施和操作。
[0006]骨髓采集:將皮膚消毒后，利用一次性骨髓穿刺針從患者兩側(cè)髂后上肌各采集骨髓30毫升，每側(cè)采集三個點，每個點采集10毫升骨髓。在潔凈低溫下，采集的骨髓樣本立即送往GMP實驗室進(jìn)行間充質(zhì)干細(xì)胞的分離和提取。
[0007]骨髓有核細(xì)胞(BoneMarrow NucleusCells，BNCs)的分離提取:骨髓在450rpm/min下離心6-8min，上半部透明部分轉(zhuǎn)移到新的錐形管。在1500rpm/min下離心6min，沉淀有核細(xì)胞。將上清取出與RBCs骨髓液混合后再次離心，得到更多有核細(xì)胞。用PBS懸浮有核細(xì)胞并進(jìn)行計數(shù)。
[0008]自體富含血小板血清(Platelet Rich Plasma，PRP)的制備:將患者自體外周血在450rpm/rpm下離心20min。離心后小心取出不含任何紅細(xì)胞(Red Blood Cells，RBCs)的上層血清，獲得自體PRP。
[0009]自體血小板裂解液(Platelet Lysate，PL)的制備:將制備的PRP立刻置于_20°C下進(jìn)行冷凍，冷凍后立即放入37°C水浴中解凍，獲得PL。
[0010]自體不含血小板血清(Platelet Poor Plasma，PPP)制備:將制備PRP后剩余的外周血在1500rpm/min條件下離心lOmin，小心將上清收集，得到PPP后，并立即冷凍保存。
[0011 ] BMSCs的分離提取與培養(yǎng)擴(kuò)增:將BNCs分離提取步驟中獲得的細(xì)胞接種到培養(yǎng)瓶中。加入DMEM+10%自體PL的培養(yǎng)液置于37°C、飽和濕度、5%的CO2濃度的培養(yǎng)箱內(nèi)開始原代培養(yǎng)，每2?3天更換一次培養(yǎng)液，去除未貼壁的細(xì)胞。培養(yǎng)7天左右時，用0.25%胰酶消化后離心收集細(xì)胞，重復(fù)上述步驟繼續(xù)傳代培養(yǎng)，傳代所用培養(yǎng)液為AMEM+10%自體PL。
[0012]BMSCs的凍存:自體PPP和99%二甲基亞砜(DMSO)按體積比9:1的比例緩慢混勻配成凍存液，放入冰水混合物中預(yù)冷15?20min。將細(xì)胞懸浮在凍存液中，并分裝到凍存管中，利用程序降溫儀將細(xì)胞降溫至_80°C后轉(zhuǎn)移到液氮罐中長期保存。
[0013]細(xì)胞制劑制備:根據(jù)患者的實際需求選取P2或P3代的BMSCs，收集細(xì)胞制備成一定比例的細(xì)胞制劑。將制備好的細(xì)胞制劑于24h內(nèi)移植于患者損傷部位。
[0014]如骨髓采集所述:將皮膚常規(guī)消毒后，對患者進(jìn)行局部麻醉，利用肝素化的骨髓穿刺針從髂骨的頂端采集骨髓，4°C保存，待工作人員取樣。
[0015]如BMSCs凍存過程所述:以l°C/min降至-4°C，然后以10°C/min降至-20°C，再以I°C/min降至-40°C，最后以10°C/min降至-80°C，取出凍存管迅速放入液氮罐中長期保存。
[0016]如細(xì)胞制劑制備所述:每Iml細(xì)胞制劑組成成分包括:I?3 X 16個BMSCs、Iml自體PRP、20?50mmol的0&(:12、10~50單位的凝血酶、10~301^表皮生長因子，環(huán)丙沙星10呢。每平方厘米損傷面積所用細(xì)胞制劑量為0.1ml。
[0017]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明優(yōu)點在于:公開了一種利用自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療嚴(yán)重皮膚損傷的方法，包括BMSCs的分離、培養(yǎng)和凍存以及BMSCs制劑的制備和臨床應(yīng)用方法。BMSCs取自患者自體，避免了疾病傳播的危險和免疫排斥反應(yīng)。本方法采用移植的方式為患者治療，其時間短，過程簡單，可操作性強。使用該方法治療各種嚴(yán)重性皮膚損傷，能夠更快更好的使傷口愈合，減少患者痛苦。
[0018]BMSCs移植到傷口表面后會促進(jìn)產(chǎn)生轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)、表皮生長因子(EGF)、成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、血小板源生長因子(PDGF)、P物質(zhì)等生物活性物質(zhì)，能夠促進(jìn)損傷部位組織再生，迅速使傷口愈合。且通過此方法治療后的再生組織和人工皮膚或藥物治療相比，更接近損傷前的組織形態(tài)，提高治療后患者的生活質(zhì)量。
【附圖說明】
圖1是BMSCs培養(yǎng)第3天圖；圖2是BMSCs培養(yǎng)第4天圖；圖3是BMSCs培養(yǎng)第5天圖；
圖4是BMSCs培養(yǎng)第6天圖；圖5是BMSCs培養(yǎng)第7天圖；圖6是臨床治療圖1圖；圖7是臨床治療圖2圖。
【具體實施方式】
[0019]【具體實施方式】一:BMSCs的分離提取和培養(yǎng)擴(kuò)增。
[0020](I)患者骨髓及外周血采集:通過表皮常規(guī)消毒和局部麻醉，利用一次性肝素化的骨髓穿刺針在髂后上肌多點采集骨髓