抗病毒雙鏈rna及其溫度敏感型凝膠制劑在治療和預(yù)防hsv-1所致疾病中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物技術(shù)領(lǐng)域中抗病毒雙鏈RNA及其溫度敏感型凝膠制劑在治療和預(yù) 防HSV-I所致疾病中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] I型單純瘤疹病毒化SV-1)感染常常會(huì)導(dǎo)致口腔及生殖器黏膜產(chǎn)生瘤疹和潰瘍。人 是HSV-I的唯一宿主，約80~90 %的人群感染過(guò)HSV-I dHSV-1主要造成口腔炎和嘴唇的瘤 疹，但越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，HSV-I也能導(dǎo)致生殖器疾病，而且是導(dǎo)致生殖器疾病更為常見(jiàn) 的原因。一直W來(lái)，人們普遍認(rèn)為70% W上的生殖器瘤疹是由2型單純瘤疹病毒化SV-2)引 起的。根據(jù)近10年來(lái)流行病學(xué)的調(diào)查，由HSV-I感染而導(dǎo)致的生殖器瘤疹，正在逐年增加。來(lái) 自美洲、歐洲和亞洲的最新數(shù)據(jù)表明，HSV-I的感染已經(jīng)成為導(dǎo)致生殖器瘤疹的重要原因。 當(dāng)病毒DNA穿過(guò)核膜進(jìn)入細(xì)胞核后，HSV-Iinfected cell Polypeptide O(ICPO)最早被轉(zhuǎn) 錄和翻譯。成熟的ICPO進(jìn)入細(xì)胞核后能結(jié)合多種及早期基因的啟動(dòng)子，W促進(jìn)其基因表達(dá)。 另外，ICPO還能通過(guò)抑制干擾素調(diào)節(jié)因子IRF3和IR巧的活性來(lái)抑制抗病毒細(xì)胞因子干擾素 (IFN)的表達(dá)。為了促進(jìn)HSV-I能順利的復(fù)制，ICPO通過(guò)抑制RNAase L的表達(dá)來(lái)抑制被病毒 感染的細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞調(diào)亡過(guò)程。除此之外，在病毒感染后期，ICPO會(huì)出核進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)和新合 成的其他蛋白和病毒DNA-起組成新的病毒顆粒。ICP27是另一種極早期蛋白，它主要是參 與調(diào)控病毒蛋白的轉(zhuǎn)錄，mRNA的出核過(guò)程。HSV-I的另一個(gè)重要蛋白是肌酢激酶(TK)，它在 病毒DNA的合成過(guò)程中其重要作用。此外，在病毒從潛伏期復(fù)發(fā)的過(guò)程中，TK是第一個(gè)被表 達(dá)的基因，它可W促進(jìn)其他極早期基因和早期基因的表達(dá)。目前用于臨床治療HSV-I感染性 疾病的藥物主要是口服核巧類藥物，如阿昔洛韋。當(dāng)阿昔洛韋進(jìn)入細(xì)胞后首先必須被服V-I 的TKS憐酸化成有活性的形式才能發(fā)揮抑制病毒的復(fù)制的作用。根據(jù)研究表明，近年來(lái)臨 床上出現(xiàn)的HSV-I對(duì)阿昔洛韋有抗性的病例中正是由于TK基因的突變導(dǎo)致的。此外服用運(yùn) 些核巧類藥物會(huì)產(chǎn)生多種副作用，如損害神經(jīng)系統(tǒng)和消化系統(tǒng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是如何治療和/或預(yù)防HSV-I所致疾病。
[0004] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明首先提供了雙鏈RNA、所述雙鏈RNA的修飾物或與所 述雙鏈RNA相關(guān)的生物材料在下述al)或a2)中的應(yīng)用：
[0005] al)制備治療和/或預(yù)防服V-I所致疾病產(chǎn)品；
[0006] a2)治療和/或預(yù)防服V-I所致疾??；
[0007] 所述雙鏈RNA，名稱為SiRNA,其一條鏈的序列為序列表中序列1，另一條鏈的序列 為序列2;
[000引所述生物材料為下述Bl )-B10)中的任一種：
[0009] Bl)編碼所述雙鏈RNA的DNA分子或CDNA分子；
[0010] B2)含有BI)所述DNA分子的表達(dá)盒；
[0011] B3)含有Bl)所述DNA分子的重組載體；
[0012] B4)含有B2)所述表達(dá)盒的重組載體；
[001引 B5)含有Bl)所述DNA分子的重組微生物；
[0014] B6)含有B2)所述表達(dá)盒的重組微生物；
[0015] B7)含有B3)所述重組載體的重組微生物；
[0016] B8)含有B4)所述重組載體的重組微生物；
[0017] B9)含有BI)所述DNA分子的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物細(xì)胞系；
[0018] B10)含有B2)所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物細(xì)胞系。
[0019] 上述應(yīng)用中，所述雙鏈RNA的修飾物可為將所述雙鏈RNA經(jīng)過(guò)y氣代、2/甲氧基、硫 代或y脫氧化學(xué)修飾或膽固醇修飾得到的物質(zhì)。
[0020] 上述應(yīng)用中，所述雙鏈RNA的修飾物可為對(duì)所述雙鏈RNA的U和C進(jìn)行y甲氧基修飾 得到的物質(zhì)，其中A和G均未被修飾。
[0021] 上述應(yīng)用中，B2)所述的含有編碼所述雙鏈RNA的DNA分子的表達(dá)盒是指能夠在宿 主細(xì)胞中表達(dá)dsRNA21的DNA，該DNA不但可包括啟動(dòng)所述雙鏈RNA轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，還可包括 終止所述雙鏈RNA轉(zhuǎn)錄的終止子。進(jìn)一步，所述表達(dá)盒還可包括增強(qiáng)子序列。
[0022] 可用現(xiàn)有的表達(dá)載體構(gòu)建含有所述雙鏈RNA表達(dá)盒的重組載體。
[0023] 上述應(yīng)用中，所述載體可為質(zhì)粒、黏粒、隧菌體或病毒載體。
[0024] 上述應(yīng)用中，所述微生物可為酵母、細(xì)菌、藻或真菌。
[0025] 上述應(yīng)用中，所述轉(zhuǎn)基因動(dòng)物細(xì)胞系不包括繁殖材料。
[0026] 上述應(yīng)用中，所述HSV-I所致疾病可為口腔和/或生殖器瘤疹和/或潰瘍。
[0027] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明還提供了所述雙鏈RNA、所述雙鏈RNA的修飾物或所 述生物材料在下述bl)、b2)、b3)或b4)中的應(yīng)用：
[002引 bl)制備抑制HSV-I復(fù)制產(chǎn)品；
[0029] b2)抑制服V-I復(fù)制；
[0030] b3)制備抑制HSV-I的基因表達(dá)產(chǎn)品；
[0031] b4)抑制服V-I的基因表達(dá)。
[0032] 上述應(yīng)用中，所述服V-I的基因可為服V-I的ICPO基因、ICP27基因和/或TK基因。
[0033] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明還提供了利用所述雙鏈RNA、所述雙鏈RNA的修飾物 或所述生物材料制備的溫度敏感型凝膠制劑在前文所述al)、所述a2)、所述bl)、所述b2)、 所述b3)或所述b4)中的應(yīng)用。
[0034] 上述應(yīng)用中，所述溫度敏感型凝膠制劑對(duì)溫度敏感，可在環(huán)境溫度發(fā)生變化時(shí)凝 固和/或烙化。所述溫度敏感型凝膠制劑可包括所述雙鏈RNA、所述雙鏈RNA的修飾物或所述 生物材料與溫度敏感型凝膠；
[0035] 所述溫度敏感型凝膠可由泊洛沙姆407、泊洛沙姆188、聚乙二醇-PLGA嵌段共聚 物、纖維素衍生物和膠原蛋白中的一種或兩種W上任意組合制備得到。所述溫度敏感型凝 膠在制備的過(guò)程中，可添加制備溫度敏感型凝膠所需的輔料。所述泊洛沙姆188的濃度為 50-350mg/ml，所述泊洛沙姆407的濃度為100-500mg/ml，所述聚乙二醇-PLGA嵌段共聚物的 濃度為l〇〇-350mg/ml，所述纖維素衍生物的濃度為l-300mg/ml。所述的纖維素衍生物選自 甲基纖維素、簇甲基纖維素鋼和徑丙基甲基纖維素中的一種或兩種W上任意組合。所述膠 原蛋白的濃度為50-100mg/ml，所述膠原蛋白選用魚(yú)皮和/或豬皮提取的膠原蛋白。所述溫 度敏感型凝膠W水為溶劑。
[0036] 上述應(yīng)用中，所述溫度敏感型凝膠制劑還可包括體內(nèi)轉(zhuǎn)染試劑，所述體內(nèi)轉(zhuǎn)染試 劑可為mPEG-P化-P陽(yáng)EA、聚乙締亞胺、線性聚乙締亞胺、脂質(zhì)體、轉(zhuǎn)鐵蛋白或葉酸。
[0037] 上述應(yīng)用中，所述溫度敏感型凝膠中還可添加有增溶劑，所述增溶劑選自乙醇、丙 二醇、聚乙二醇、環(huán)糊精類、十二烷基硫酸鋼和聚山梨醋類中的一種或兩種種W上任意組 合。其中乙醇的濃度可為50-350mg/ml，丙二醇的濃度可為50-350mg/ml，聚乙二醇的濃度可 為100-350mg/ml，環(huán)糊精類的濃度可為10-360mg/ml，十二烷基硫酸鋼的濃度可為5-50mg/ ml，聚山梨醋類的濃度可為5-50mg/ml;所述聚乙二醇為選自PEG300、PEG400和陽(yáng)G600中的 一種或兩種W上任意組合;所述環(huán)糊精類為選自a-環(huán)糊精、0-環(huán)糊精、徑丙基-0-環(huán)糊精、徑 乙基-0-環(huán)糊精、二甲基-0-環(huán)糊精中的一種或兩種W上任意組合;所述聚山梨醋類為選自 吐溫-80，吐溫-60，吐溫-85，吐溫-40，吐溫-20的一種或兩種W上任意組合。
[0038] 為了改善所述溫度敏感型凝膠的口味，所述溫度敏感型凝膠中可包括濃度為0.1-550mg/ml的矯味劑;所述矯味劑為選自薦糖，山梨醇、甘露醇、木糖醇、丙二醇、甘油、薄荷 油、薄荷腦、枯子香精和香蕉香精中一種或一種W上任意組合。
[0039] 所述溫度敏感型凝膠制劑的抑值為5.0-9.0;抑調(diào)節(jié)用試劑可為S乙醇胺和/或氨 氧化鋼和/或氨氧化鐘。
[0040] 上述試劑均可從Sigma等試劑公司購(gòu)買。
[0041] 所述溫度敏感型凝膠制劑還可W包含其它藥學(xué)上可接受的載體。本文所用的"藥 學(xué)上可接受的載體"應(yīng)當(dāng)與本發(fā)明藥物組合物中的凝膠和雙鏈核酸分子相容，即能與其共 混而不會(huì)在通常情況下大幅度降低藥物組合物在抑制基因表達(dá)方面的效果?？勺鳛樗帉W(xué)上 可接受的載體或其組分的一些物質(zhì)的其他例子是糖類，如乳糖、葡萄糖和薦糖;淀粉，如玉 米淀粉和±豆淀粉;西黃著膠粉末;麥芽；明膠;滑石;固體潤(rùn)滑劑，如硬脂酸和硬脂酸儀;硫 酸巧;植物油，如花生油、棉巧油、芝麻油、橄攬油、玉米油和可可油;多元醇，如甘油、甘露糖 醇;海藻酸;乳化劑，如Tween;潤(rùn)濕劑，