一種多孔磷酸鈣材料及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)材料領(lǐng)域，具體涉及一種多孔磷酸鈣材料及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著材料科學(xué)的發(fā)展，生物陶瓷材料由于具有對機(jī)體組織進(jìn)行修復(fù)、替代與再生的特殊功能，已成為當(dāng)今生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)中的重要組成部分。早在1894年，H.Dreeman就報道了使用熟石膏作為骨替換材料，直到二十世紀(jì)六十年代，生物陶瓷才得到了足夠的重視和發(fā)展。生物陶瓷主要是用于人體硬組織修復(fù)和重建的陶瓷材料，在臨床上已用于髖、膝關(guān)節(jié)，人造牙根，牙嵴增高和加固，頌面重建，心臟瓣膜，中耳聽骨等。磷酸鈣(CaP)作為重要的生物陶瓷材料，具有優(yōu)良的生物相容性、生物活性以及生物降解性，是一種非常理想、臨床應(yīng)用前景十分誘人的人體硬組織缺損修復(fù)和替代材料，最近正成為世界各國學(xué)者研究的熱點。
[0003]組織工程支架材料的主要功能是為種子細(xì)胞提供生存和依附的三維結(jié)構(gòu)環(huán)境，使細(xì)胞向預(yù)設(shè)的方向、形狀生長；同時為細(xì)胞的增殖、分化、營養(yǎng)的供給、新陳代謝等生理活動提供空間環(huán)境。理想的骨組織工程支架材料應(yīng)具備三維立體多孔結(jié)構(gòu)，不僅有利于細(xì)胞的粘附生長、細(xì)胞外基質(zhì)的沉積、營養(yǎng)物質(zhì)和O2的進(jìn)入、代謝廢物的排出以及血管、神經(jīng)的長入為新生組織提供支架，還起到模板作用，為細(xì)胞提供賴以寄宿、生長、分化和增殖的場所，從而引導(dǎo)受損組織的再生。因此如何制備多孔磷酸鈣是本領(lǐng)域的一個重要課題。
[0004]現(xiàn)有很多制備多孔磷酸鈣的方法，包括在HA粉中加入有機(jī)顆粒、泡沫凝膠鑄造法、淀粉固結(jié)成型法、微波處理法、注漿法、電泳沉積技術(shù)、有機(jī)泡沫浸漬法、顆粒造孔法等。方法上的差異可直接影響孔隙特征。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種有序多孔、三維貫通的多孔磷酸鈣材料及其制備方法，該多孔磷酸鈣材料具有均勻的微米/亞微米微孔結(jié)構(gòu)，具有高生物活性、無其他分子摻雜并且外形可定制，該制備方法具備工藝簡單、成本低等特點。
[0006]本發(fā)明通過在有機(jī)多孔模板上培養(yǎng)枯草芽孢桿菌形成生物膜，利用枯草芽孢桿菌的胞外產(chǎn)物γ -聚谷氨酸對鈣離子的超強(qiáng)吸附作用，在溫和條件下與磷酸鹽發(fā)生反應(yīng)，從而在有機(jī)多孔模板上沉積組裝形成磷酸鈣復(fù)合晶體并形成有序多孔微觀結(jié)構(gòu)，最后高溫煅燒除去有機(jī)多孔模板制得多孔磷酸鈣材料。
[0007]本發(fā)明所采用的枯草芽孢桿菌菌株是經(jīng)選育的枯草芽孢桿菌(BaciI Iussubstilis)PGA-7CCTCC M206102，該菌株保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，編號為CCTCC M206102。該菌株以下簡稱:枯草芽孢桿菌PGA-7。
[0008]本發(fā)明的第一個目的是提供一種多孔磷酸鈣材料的制備方法。
[0009]本發(fā)明的多孔磷酸鈣材料的制備方法，其特征在于，在多孔模板上培養(yǎng)枯草芽孢桿菌形成枯草芽孢桿菌生物膜，然后置于含鈣鹽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，將鈣鹽吸附至多孔模板表面，將此含有鈣的多孔模板與磷酸鹽反應(yīng)，從而在多孔模板表面形成磷酸鈣復(fù)合晶體，再經(jīng)煅燒去除多孔模板，得到多孔磷酸鈣材料。
[0010]進(jìn)一步優(yōu)選，所述的多孔磷酸鈣材料的制備方法，具體包括以下步驟:
[0011 ] a.多孔模板預(yù)處理:接種枯草芽孢桿菌于液體培養(yǎng)基中制備發(fā)酵液，將無菌多孔模板吸滿液體培養(yǎng)基后置于上述發(fā)酵液中培養(yǎng)，至多孔模板內(nèi)形成細(xì)菌膜；
[0012]b.高鈣培養(yǎng):將形成有細(xì)菌膜的多孔模板移至每升含有0.01?Imol鈣鹽的高鈣反應(yīng)培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)以吸附鈣離子；
[0013]c.磷酸鈣形成:取出步驟b的多孔模板，用無菌蒸餾水清洗去除游離鈣離子后，再置于液體培養(yǎng)基中，加入磷酸鹽進(jìn)行反應(yīng)，至多孔模板表面有白色晶體；
[0014]d.去模板:取出步驟c的多孔模板并去除液體，高溫?zé)瞥ザ嗫啄０搴蟮玫蕉嗫琢姿徕}材料。
[0015]優(yōu)選，所述的多孔模板為聚氨酯軟泡模板，可為方塊、球體或不規(guī)則形狀;在應(yīng)用中，可以根據(jù)需要而定制相應(yīng)形狀的聚氨酯軟泡模板從而獲得對應(yīng)形狀的多孔磷酸鈣材料。其中方塊的大小為:相交于同一頂點的三條棱長度分別為:0.1?2cm、0.1?2cm、0.05?2cm;球體的直徑大小為:0.I?2cm。
[0016]優(yōu)選，所述的枯草芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌PGA-7。
[0017]優(yōu)選，所述的液體培養(yǎng)基，每升含有:蛋白胨8?12g，酵母膏3?8g，NaCl 9?llg，余量為水，pH 6.8?7.4。
[0018]優(yōu)選，所述含鈣鹽的培養(yǎng)基和高鈣反應(yīng)培養(yǎng)基都為，每升含有:0.01?Imol鈣鹽，蛋白胨4?6g，酵母膏I?4g，NaCl 3?6g，余量為水，pH 6.8?7.4。
[0019]優(yōu)選，所述的鈣鹽為氯化鈣、硝酸鈣、磷酸鈣、硫酸鈣、碳酸鈣或氫氧化鈣。
[0020]優(yōu)選，所述的磷酸鹽為磷酸二氫胺、磷酸氫二胺、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀或磷酸氫二鉀。
[0021]優(yōu)選，所述的步驟a的發(fā)酵液是通過以下步驟制備的:
[0022](I)斜面菌株活化培養(yǎng):將培養(yǎng)好的保存斜面菌種枯草芽孢桿菌PGA-7劃線于LB斜面上，37 °C培養(yǎng)24小時，再4°C冷藏I?5天;所述的LB斜面每升含有:蛋白胨1g，酵母膏5g，NaCl 1g，瓊脂20g，余量為水，pH 7.2；
[0023](2)搖瓶培養(yǎng):將上述斜面Icm2面積的菌株刮下，接種于液體培養(yǎng)基中，于30?37°C往復(fù)式搖床振蕩培養(yǎng)12?30h，搖床轉(zhuǎn)速為80?150r/min，沖程為60?10mm，由此得到發(fā)酵液;所述的液體培養(yǎng)基每升含有:蛋白胨8?12g，酵母膏3?8g，NaCl 9?I Ig，余量為水，pH 6.8?7.40
[0024]優(yōu)選，所述的步驟a的將無菌多孔模板吸滿液體培養(yǎng)基后置于上述發(fā)酵液中培養(yǎng)是在25?37°C、50?120r/min振蕩培養(yǎng)24?72h;所述的步驟b的培養(yǎng)是25?37°C、30?50r/min振蕩培養(yǎng)3?24h;所述的步驟c的加入磷酸鹽進(jìn)行反應(yīng)是逐漸加入1.0?1000mmol/l磷酸鹽，150?500r/min攪拌振蕩，控制反應(yīng)條件為25?60°C、pH 6.8?9.0、反應(yīng)溶液中磷酸根離子濃度小于0.01mol/L,反應(yīng)1?15天;所述的步驟d的高溫?zé)剖?000 °C?1250 °C燒制I?2小時。
[0025]本發(fā)明的第二個目的是提供一種由上述方法制備得到的多孔磷酸鈣材料。
[0026]本發(fā)明創(chuàng)造性的運用枯草芽孢桿菌PGA-7做合成菌株來制備多孔磷酸鈣材料。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下突出優(yōu)點:
[0027 ] (I)相對于化學(xué)合成等制備多孔磷酸鈣的方法，本發(fā)明方法操作簡單、成本低、更環(huán)保。
[0028](2)本發(fā)明的多孔磷酸鈣材料的一個顯著特點是能具有均勻的微米/亞微米微孔結(jié)構(gòu)，并且微觀孔徑大小可以根據(jù)模板孔隙大小、細(xì)胞生物膜特性進(jìn)行改變。
[0029](3)本發(fā)明的多孔磷酸鈣材料的外觀可由聚氨酯軟泡模板的外形而改變，從而可根據(jù)需要定制復(fù)雜的外形。
【具體實施方式】
[0030]以下實施例是對本發(fā)明的進(jìn)一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。
[0031]以下實施例中用到的斜面菌種采用如下方法培養(yǎng):將枯草芽孢桿菌PGA-7劃線于新配置的LB斜面上，37°C培養(yǎng)24小時，再冷藏于4°C冰箱備用。LB斜面組成如下:蛋白胨1g，酵母膏5g，NaCl 10g，瓊脂20g，自來水1L，調(diào)整pH值至7.2;121°C高壓滅菌20min(以下實施例中所用的LB斜面組成均與此相同)。
[0032]以下實施例中的枯草芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌(BaciIIussubtilis)PGA_7，其保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，其保藏編號為:CCTCC N0:M206102，該菌公開于專利號:ZL 200610122640.5，發(fā)明名稱為:γ -聚谷氨酸產(chǎn)生菌及利用該菌株制備γ -聚谷氨酸的方法的專利中。
[0033]實施例1
[0034]一種多孔磷酸鈣材料，是通過以下步驟制備的:
[0035](I)斜面菌株活化培養(yǎng):將培養(yǎng)好的保存斜面菌種枯草芽孢桿菌PGA-7劃線于新配置的LB斜面上，37 °C培養(yǎng)24小時，再4 °C冷藏I天。
[0036](2)搖瓶培養(yǎng):將上述斜面Icm2面積的菌株刮下，接種于液體培養(yǎng)基中，于30°C往復(fù)式搖床振蕩培養(yǎng)12h，搖床轉(zhuǎn)速為150r/min，沖程為60mm，得到發(fā)酵液。液體培養(yǎng)基組成如下:蛋白胨8g，酵母膏8g，NaCl 9g，用蒸饋水定容至IL，調(diào)整pH值至6.8，液體培養(yǎng)基裝于250ml三角瓶中，三角瓶裝液量為150ml，121°C高壓滅菌20min。
[0037](3)聚氨酯軟泡模板預(yù)處理:將無菌聚氨酯軟泡模板吸滿液體培養(yǎng)基(同步驟(2))，放置于上述(2)中的發(fā)酵液中(每個三角瓶中放置I個無菌正方體(邊長為2cm3)聚氨酯軟泡模板)，25 °C往復(fù)式搖床振蕩培養(yǎng)24h，搖床轉(zhuǎn)速為50r/min，至聚氨酯軟泡模板內(nèi)形成細(xì)菌膜。
[0038](4)高鈣培養(yǎng):將(3)中形成細(xì)菌膜的聚氨酯軟泡模板移至高鈣反應(yīng)培養(yǎng)基中，250C、50r/min繼續(xù)振蕩培養(yǎng)3h。高|丐反應(yīng)培養(yǎng)基組成如下:0.0lmol氯化|丐，蛋白胨6g，酵母膏Ig，NaCl 3g，用蒸饋水定容至IL，調(diào)整pH值至6.8，121°C高壓滅菌20min。
[0039](5)磷酸鈣形成:取出上述(4)中聚氨酯軟泡模板，在無菌蒸餾水振蕩清洗去除游離鈣離子，再放置于裝有液體培養(yǎng)基(同步驟(2))的三角瓶中，緩慢滴加入1.0mmol/1磷酸二氫胺，15(^/!1^11磁力攪拌振蕩，控制溫度為25°(:、？田直為6.8和反應(yīng)溶液中磷酸根離子濃度小于0.01mol/L，10天后，聚氨酯軟泡模板表面有白色晶體。
[0040](6)去模板:取出(5)中聚氨酯軟泡模板，去除液體，100tC高溫?zé)艻小時，即