經(jīng)處理的濾器的制造方法
【專(zhuān)利說(shuō)明】經(jīng)處理的濾器
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)
[0002] 該國(guó)際申請(qǐng)要求2013年10月7日提交的歐洲申請(qǐng)?zhí)?3187628的優(yōu)先權(quán)，其全文通 過(guò)引用納入本文。 發(fā)明領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明設(shè)及一種過(guò)濾包含蛋白質(zhì)的流體的方法。本發(fā)明還設(shè)及用于該方法的經(jīng)處 理的濾器和由該方法得到的濾液。
【背景技術(shù)】
[0004] 在蛋白質(zhì)物質(zhì)的加工期間，通常需要使用過(guò)濾步驟。運(yùn)一過(guò)濾步驟能夠去除將對(duì) 最終產(chǎn)物不利的組分。例如，通過(guò)選擇合適孔徑的濾器，可能從病毒顆粒的大聚集體中分離 游離的、完整病毒顆粒。
[0005] EP0188104 Bl描述了通過(guò)裝置如含有濾器的屯、切開(kāi)術(shù)儲(chǔ)器過(guò)濾血液產(chǎn)品。已經(jīng)用 聚山梨醋80處理濾器，其改善了通過(guò)裝置的血液的重力流。然而，該技術(shù)限于血液過(guò)濾并且 沒(méi)有公開(kāi)純化治療性蛋白質(zhì)，如用于疫苗的病毒蛋白質(zhì)或病毒粒子。EP0188104并沒(méi)有使用 過(guò)濾來(lái)從感興趣的蛋白質(zhì)中去除大蛋白質(zhì)聚集體。此外，EP0188104需要在使用之前干燥濾 器，運(yùn)在本發(fā)明中不需要。
[0006] W0/2011/051235描述了加入叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRIT0NX-100⑥）W增加 流感疫苗制造中的過(guò)濾性能。然而，在W0/2011/051235中，曲通加入病毒制備物中而不是用 于預(yù)處理濾器。此外，在W0/2011/051235中，是在裂解之后和滅活之前加入。在本發(fā)明的情 況中，優(yōu)選在裂解之前使用經(jīng)去污劑處理的濾器。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 在病毒產(chǎn)品的制備中，蛋白質(zhì)物質(zhì)的過(guò)濾、產(chǎn)物無(wú)菌性和安全性是關(guān)鍵的。采用滅 活步驟來(lái)殺死感染性物質(zhì)。通常，滅活劑，如甲醒通過(guò)誘導(dǎo)蛋白質(zhì)物質(zhì)的交聯(lián)來(lái)殺死感染性 復(fù)制機(jī)構(gòu)，也可能產(chǎn)生聚集的蛋白質(zhì)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)過(guò)濾包含蛋白質(zhì)物質(zhì)的流體是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。 例如，盡管進(jìn)行過(guò)濾和純化步驟，仍觀(guān)察到所需產(chǎn)品的量的明顯減少，即使在預(yù)期蛋白質(zhì)物 質(zhì)的粒度容易通過(guò)濾器時(shí)亦是如此。
[000引發(fā)明人已經(jīng)確定可通過(guò)在包含蛋白質(zhì)物質(zhì)的流體過(guò)濾之前或期間處理濾器來(lái)避 免感興趣的生物產(chǎn)品（例如，蛋白質(zhì)物質(zhì)）的運(yùn)種意料之外的損失。具體地，已經(jīng)意外地發(fā) 現(xiàn)，與對(duì)照即其他等同條件下未處理的膜濾器相比，用表面活性劑預(yù)處理的膜濾器可導(dǎo)致 感興趣的生物產(chǎn)品回收率得到令人驚訝的改善。
[0009] 因此，本發(fā)明提供了一種從包括大聚集體雜質(zhì)的混合物中純化生物產(chǎn)品，如蛋白 質(zhì)的方法。按照本發(fā)明，生物產(chǎn)品經(jīng)過(guò)濾通過(guò)具有截留大蛋白質(zhì)聚集體雜質(zhì)的尺寸的合適 過(guò)濾膜。用降低感興趣的生物產(chǎn)品與濾膜的結(jié)合的表面活性劑預(yù)處理疏水性濾器。
[0010] 可通過(guò)本發(fā)明過(guò)濾的生物產(chǎn)品包括抗體、血液產(chǎn)品、病毒蛋白質(zhì)和多糖。
【附圖說(shuō)明】
[0011] 圖1顯示了在過(guò)濾通過(guò)未處理的濾器之后流感病毒的各毒株的蛋白質(zhì)損失百分 比。
[0012] 圖2顯示了正通過(guò)未處理的濾器的流感病毒的各毒株的流速與時(shí)間的變化。
[0013] 圖3顯示了在用未處理的濾器過(guò)濾之前和之后流感病毒毒株的粒度分布。
[0014] 圖4顯示了相對(duì)于用未處理的濾器過(guò)濾，按照本發(fā)明的處理濾器產(chǎn)生的回收病毒 產(chǎn)率的增加。
[0015] 圖5顯示了用各種憐酸鹽緩沖鹽水沖洗體積去除的聚山梨醋80(吐溫)的量。
[0016] 圖6顯示了相對(duì)于經(jīng)聚山梨醋80(吐溫)處理的濾器，用經(jīng)憐酸鹽緩沖鹽水溶液處 理的濾器過(guò)濾時(shí)病毒損失百分比。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 在一個(gè)方面中，本發(fā)明設(shè)及從大蛋白質(zhì)聚集形成的雜質(zhì)中純化感興趣的生物產(chǎn)品 的方法。因此，在一些實(shí)施方式中，提供了含有至少一種感興趣的生物產(chǎn)品的樣品（例如，流 體)中去除聚集體的方法。
[0018] 按照本發(fā)明，該方法包括使用合適的膜濾器，該膜濾器已經(jīng)用表面活性劑，例如表 面活性劑溶液預(yù)處理W提供經(jīng)預(yù)處理的膜濾器。如本文中更詳細(xì)的描述，經(jīng)預(yù)處理的膜濾 器一般不在該步驟之后干燥?？扇芜x地用合適的緩沖液或水洗涂經(jīng)預(yù)處理的膜濾器W在過(guò) 濾步驟之前從膜濾器中去除過(guò)量(例如，未結(jié)合)的表面活性劑。一旦獲得并任選地洗涂經(jīng) 預(yù)處理的膜濾器，然后使用經(jīng)預(yù)處理的膜濾器過(guò)濾含感興趣的生物產(chǎn)品的樣品（例如，流體 樣品）。感興趣的生物產(chǎn)品通過(guò)經(jīng)預(yù)處理的膜濾器過(guò)濾并收集為濾液。該步驟從樣品中去除 不需要的大聚集體。
[0019] 在一些實(shí)施方式中，提供了防止生物產(chǎn)品過(guò)濾期間損失的方法。減少制造期間產(chǎn) 品的不希望損失尤其對(duì)于生物產(chǎn)品而言是重要因素?？赏ㄟ^(guò)比較在過(guò)濾步驟之前樣品中存 在的生物樣品的起始量和在過(guò)濾步驟之后濾液中存在的生物產(chǎn)品的最終量來(lái)確定相對(duì)于 過(guò)濾的相對(duì)回收產(chǎn)率。希望該產(chǎn)率盡可能接近100%，例如，約100%、至少95%、至少90%、 至少85%、至少80%、至少75%、至少70%、至少65%、至少60%等。
[0020] 因此，本發(fā)明提供了方法，其中將包含第一量的生物產(chǎn)品的流體過(guò)濾通過(guò)經(jīng)預(yù)處 理的膜濾器W回收濾液中的生物產(chǎn)品，其中濾液包含第二量的生物產(chǎn)品。在一些實(shí)施方式 中，第二量的生物產(chǎn)品是第一量的生物產(chǎn)品的至少7 5 %，例如，至少8 0 %、至少8 5 %、至少 90%、至少 95 %。
[0021] -般而言，在本發(fā)明的任意實(shí)施方式中，合適的膜濾器包括疏水性膜濾器。另外， 基于孔徑選擇合適的膜濾器W過(guò)濾感興趣的生物產(chǎn)品同時(shí)截留流體樣品中可能存在的聚 集體。如本文所示的數(shù)據(jù)所示，與未預(yù)處理的對(duì)照相比，可使用本文所述的方法實(shí)現(xiàn)濾液中 生物產(chǎn)品的明顯更高的回收產(chǎn)率。
[0022] 本發(fā)明可用于加工包含一種或多種生物產(chǎn)品的組合物，具體用于需要高純度的組 合物。因此，本發(fā)明可用于生產(chǎn)藥品、營(yíng)養(yǎng)品和/或化妝品。在一些實(shí)施方式中，生物產(chǎn)品是 或包括蛋白質(zhì)、病毒樣顆粒、病毒顆粒、病毒粒子、或其任意組合。
[0023] 在一些實(shí)施方式中，生物產(chǎn)品過(guò)濾通過(guò)一定孔徑的疏水性濾膜，該孔徑截留非感 興趣產(chǎn)品的大蛋白質(zhì)聚集體雜質(zhì)，其中濾膜已經(jīng)用去污劑預(yù)處理，并且預(yù)處理降低了感興 趣的生物產(chǎn)品與濾膜的結(jié)合。該方法可包括其他步驟，尤其是將感興趣的生物產(chǎn)品配制成 適用于給予人或動(dòng)物患者的形式。
[0024] 在優(yōu)選的實(shí)施方式中，感興趣的生物產(chǎn)品是蛋白質(zhì)。相對(duì)于感興趣的生物產(chǎn)品的 尺寸/重量確定大蛋白質(zhì)聚集體。大蛋白質(zhì)聚集體理解為在尺寸和/或重量上明顯大于感興 趣的生物產(chǎn)品。明顯大表示尺寸和/或重量比感興趣的產(chǎn)物高至少8倍，優(yōu)選10、15、20、30、 50倍?？赏ㄟ^(guò)，例如凝膠電泳確定蛋白質(zhì)聚集體的尺寸和重量。如果病毒是感興趣的產(chǎn)品， 則大聚集體的尺寸至少是化m，優(yōu)選> 1.5; > 2、> 3、> 4、> 5、或> 10皿。如果是病毒蛋白 質(zhì)，例如HA或NA抗原是感興趣的產(chǎn)品，則大聚集體的尺寸是至少0.2皿，優(yōu)選> 0.5、> 0.8、 > 1、含2、含3、含4、含5、或含lOiim。如果過(guò)濾的產(chǎn)物在尺寸/重量上不同于最終(治療)產(chǎn)品， 例如，因?yàn)榻?jīng)過(guò)濾的產(chǎn)品經(jīng)裂解、切割、標(biāo)記等加工，則"感興趣的產(chǎn)品"表示過(guò)濾步驟的產(chǎn) 品而非最終(經(jīng)處理）的產(chǎn)品。
[0025] 在一個(gè)實(shí)施方式中，大蛋白質(zhì)聚集體通過(guò)共價(jià)鍵連接，例如，通過(guò)甲醒交聯(lián)。在另 一個(gè)實(shí)施方式中，大聚集體通過(guò)非共價(jià)鍵連接(例如，離子或疏水鍵）。蛋白質(zhì)聚集體可能含 有非蛋白質(zhì)組分，如核酸或糖。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，如果濾器材料還未如本發(fā)明所述經(jīng)預(yù) 處理，則感興趣的生物產(chǎn)品強(qiáng)烈結(jié)合濾器材料。運(yùn)種結(jié)合在截留感興趣的產(chǎn)物的完整性和/ 或生物功能的條件下甚至可能是不可逆的。
[0026] 因此，本發(fā)明的一個(gè)方面提供了一種將流體過(guò)濾通過(guò)濾器的方法，其中該流體包 含病毒蛋白質(zhì)，尤其是流感抗原，并且該方法包括W下步驟：（i)將濾器與包含表面活性劑 的溶液接觸W產(chǎn)生經(jīng)處理的濾器，和（ii)使流體通過(guò)經(jīng)處理的濾器W給出濾液。
[0027] 在優(yōu)選的實(shí)施方式中，在步驟(ii)之前進(jìn)行步驟(i)。或者，如下文所述，可同時(shí)進(jìn) 行步驟(i)和(ii)。
[0028] 在另一個(gè)方面中，提供了一種過(guò)濾流體通過(guò)濾器的方法，其中該流體包含病毒或 病毒蛋白并且濾器已經(jīng)與不同于包含表面活性劑的病毒制備物的溶液接觸W產(chǎn)生經(jīng)處理 的濾器并且該方法包括將流體通過(guò)經(jīng)處理的濾器W得到濾液的步驟。產(chǎn)生的濾液可經(jīng)進(jìn)一 步加工如色譜純化、深度過(guò)濾和/或滅菌W產(chǎn)生疫苗制劑。
[0029] 其他方法將是制備從雞蛋或細(xì)胞培養(yǎng)物中培養(yǎng)的病毒蛋白質(zhì)。可使用的制備技術(shù) 包括在培養(yǎng)的雞蛋或細(xì)胞培養(yǎng)物中生長(zhǎng)病毒，凈化含有病毒的混合物W去除碎片，化學(xué)或 物理滅活混合物，過(guò)濾滅活的病毒通過(guò)已經(jīng)用表面活性劑處理的濾器，然后進(jìn)一步將病毒 加工成疫