以愈傷組織誘導(dǎo)白及四倍體的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物生物技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種以愈傷組織誘導(dǎo)白及四倍體的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]白及(Bletilla striata(Thunb.) Reichb.f.)又名白發(fā)、別名紫蘭，是蘭科白及屬多年生草本植物。其塊莖為我國(guó)傳統(tǒng)中藥，其性微寒，味苦、甘，具收斂、化瘀止血、補(bǔ)肺生肌、消腫，用于治療肺病、咳血、慢性胃潰瘍、創(chuàng)傷出血和肝癌等癥;為“快胃片”、“胃康寧”等中成藥的重要組分。此外，白及在美容護(hù)膚、精細(xì)化工及觀賞園藝等方面也有重要的應(yīng)用價(jià)值。
[0003]目前白及原料主要依賴野生自然資源，過度的采集和生境的破壞使資源數(shù)量急劇減少，瀕臨滅絕邊緣。隨著白及研究不斷深入，應(yīng)用日益廣泛，市場(chǎng)需求量逐年增加，使得供需矛盾日益尖銳，價(jià)格持續(xù)上揚(yáng)，已達(dá)400?500元/kg。因此，白及人工栽培勢(shì)在必行。
[0004]在自然條件下，由于白及的種子細(xì)小且無胚乳，萌發(fā)率極低。人們主要通過采集本地的野生白及以分株繁殖方式繁育種苗，存在品種混雜、繁殖系數(shù)低、種質(zhì)退化嚴(yán)重等諸多問題。而培育優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)白及品種是人工栽培獲得成功的關(guān)鍵所在。
[0005]植物多倍體具有植株“巨型性”、有效成分含量高、抗逆性強(qiáng)等特性，成為了提高藥用植物品質(zhì)、產(chǎn)量和抗逆性的重要育種途徑。如四倍體粉葛比野生二倍體生物產(chǎn)量提高十幾倍;杭白芷多倍體藥用成分歐前胡素含量比原植物高2倍。由此可見，多倍體是增產(chǎn)效應(yīng)和藥用成分含量得以大幅提高兩個(gè)方面的完美結(jié)合的統(tǒng)一體，非常適合藥用部位為塊根、塊莖以及全株的藥用植物。我國(guó)先后培育出了牛膝、丹參、菘藍(lán)、黨參等30多個(gè)中藥多倍體新品種。
[0006]目前，利用化學(xué)誘導(dǎo)劑對(duì)白及種子進(jìn)行多倍體誘導(dǎo)研究已有報(bào)道，因白及種子細(xì)小，在誘導(dǎo)后進(jìn)行清洗時(shí)，種子懸浮于水中，雖然可以通過離心方式解決，但由于白及種子必須在培養(yǎng)基上才能萌發(fā)，而反復(fù)在超凈工作臺(tái)和離心機(jī)之間進(jìn)行清洗工作，使種子污染率大幅增加，嚴(yán)重時(shí)會(huì)因整個(gè)處理全部污染而導(dǎo)致試驗(yàn)失敗。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明針對(duì)白及種子進(jìn)行多倍體誘導(dǎo)過程中存在的問題，利用白及愈傷組織進(jìn)行白及四倍體誘導(dǎo)。
[0008]本發(fā)明以愈傷組織誘導(dǎo)白及四倍體的方法，包括以下步驟:
(I)在超凈工作臺(tái)上，將白及愈傷組織切分成0.3cm X 0.3cm的小塊，接入增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)10 d;在無菌條件下，往培養(yǎng)瓶中加入滅菌過的化學(xué)誘導(dǎo)劑，化學(xué)誘導(dǎo)劑浸泡愈傷組織8?24 h；
所述的化學(xué)誘導(dǎo)劑為:0.05?0.2%秋水仙素+3%DMS0 ；
所述增殖培養(yǎng)基為:N6+2，4-D 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+TDZ 0.5 mg/L，pH6.0;經(jīng)過誘導(dǎo)的白及愈傷組織細(xì)胞通透性增加，N6中的鉀元素可調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)適宜滲透壓和酸堿平衡，參與細(xì)胞內(nèi)糖和蛋白質(zhì)代謝，N6與植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑共同作用，促進(jìn)誘導(dǎo)過的白及愈傷組織細(xì)胞的修復(fù)和生長(zhǎng)。
[0009](2)在超凈工作臺(tái)上，將步驟(I)中的愈傷組織取出，放入無菌水中清洗，用無菌濾紙吸干水，接入分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)，22?30 d產(chǎn)生芽點(diǎn)，36?43 d形成芽，55?65 d芽長(zhǎng)出2?3片葉，芽粗壯，葉色綠色；
所述分化培養(yǎng)基為:MS+6-BA 1.0 mg/L+ZT 0.5 mg/L+NAA0.5 mg/L，pH6.0;Z^T^6-BA具有促進(jìn)白及愈傷組織細(xì)胞的分裂與分化作用，與NAA同時(shí)使用，有利于提高分化頻率。
[0010](3)在超凈工作臺(tái)上，將步驟(2)中得到的芽接入生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)，7 d時(shí)芽的下端出現(xiàn)突起，12?16 d開始長(zhǎng)根，45?50 d根長(zhǎng)約為1.0 cm；
所述生根培養(yǎng)基為:1/2MS+NAA 0.5 mg/L+IBA 1.0 mg/L+KT 0.4 mg/L，pH6.0;該培養(yǎng)基中的NAA具有誘導(dǎo)不定根的作用，IBA具有促進(jìn)不定根的生長(zhǎng)，兩生長(zhǎng)素使用具協(xié)同作用，提高根的數(shù)量和質(zhì)量，KT具有促進(jìn)細(xì)胞橫向增粗，使苗粗壯，與生長(zhǎng)素同時(shí)使用提高苗的質(zhì)量。
[0011](4)上午9?11點(diǎn)，在超凈工作臺(tái)上，將步驟(3)中的白及小苗小心取出，放在滅菌過的盤子里，切下0.5?1.0 cm長(zhǎng)的根尖，將根尖立即放入預(yù)處理液中，處理3 h，將小苗上剩余的根系切除，再接入生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并將根尖與小苗編號(hào)；
所述的預(yù)處理液為:0.1%秋水仙素溶液。
[0012](5)將步驟(4)中的預(yù)處理液中的根尖取出，用蒸餾水清洗后以卡諾氏固定液固定3 h，將固定好的根尖用蒸餾水清洗，放入盛有IN鹽酸(濃鹽酸:水=1:11)的小燒杯中，在60°C左右的水浴鍋中處理15?20 min，水浴完畢后蒸餾水清洗，切除根冠，留下根尖分生區(qū)，以改良品紅染色20 min，將染色后的根尖分生區(qū)置于干凈載玻片上，加入一滴蒸餾水，將根尖弄碎，蓋上玻片后再加蓋一張吸水紙用大拇指輕壓，最后敲擊直到根尖分散成霧狀；
(6)將步驟(5)中做好的載玻片的根尖在顯微鏡下鏡檢，將染色體數(shù)量為64條的小苗的編號(hào)和數(shù)量記錄下來;統(tǒng)計(jì)白及四倍體誘導(dǎo)率為2.6%?23.4%。
[0013]通過查閱資料得知，白及二倍體的染色體數(shù)為32條，所以染色體為64條的小苗為四倍體植株。
所述愈傷組織增殖培養(yǎng)、分化培養(yǎng)及生根培養(yǎng)階段的培養(yǎng)條件是:培養(yǎng)溫度為25±3°C，光照時(shí)間為12 h/d，光照強(qiáng)度為1500 Lx0
[0014]所述培養(yǎng)基中，MS和N6均為基本培養(yǎng)基，2，4-D為2，4_二氯苯氧乙酸，6-BA為芐氨基嘌呤，TDZ為噻重氮苯基脲，IBA為吲哚-3-丁酸，NAA為a-萘乙酸，ZT為玉米素，KT為激動(dòng)素，試劑均為分析純，水為蒸饋水。
[0015]所述化學(xué)誘導(dǎo)劑中，DMSO為二甲基亞砜，水為蒸餾水。
[0016]本發(fā)明利用白及愈傷組織進(jìn)行白及四倍體誘導(dǎo)。愈傷組織是外植體的增生細(xì)胞產(chǎn)生的一團(tuán)不規(guī)則、疏松的薄壁細(xì)胞，細(xì)胞增殖速度快，在培養(yǎng)基的作用下具有很強(qiáng)的分生能力和再分化能力，因此，在培養(yǎng)期間，大量細(xì)胞處于分裂期。化學(xué)誘導(dǎo)劑由秋水仙素和DMSO組成，DMSO具有極強(qiáng)的滲透性，有助于藥物向細(xì)胞中滲透，同時(shí)也是滲透性的保護(hù)劑，改變生物膜對(duì)毒性物質(zhì)的通透性，利于有毒物質(zhì)的排泄。利用化學(xué)誘導(dǎo)劑對(duì)愈傷組織進(jìn)行短時(shí)間誘導(dǎo)處理，既可以提高四倍體的誘導(dǎo)率，又能減少化學(xué)誘導(dǎo)劑對(duì)細(xì)胞毒害作用。根據(jù)細(xì)胞全能性原理，再分化過程中，一個(gè)細(xì)胞分化為一個(gè)植株，可有效減少雜合體的發(fā)生。因此，該方法具有操作簡(jiǎn)單、易控制、重復(fù)性好、誘導(dǎo)率高、多倍體的純化率好等優(yōu)點(diǎn)。
【附圖說明】
[0017]圖1為本發(fā)明實(shí)施例1?3中白及四倍體染色體數(shù)目顯微放大示意圖2n=4x=64。
【具體實(shí)施方式】
[0018]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本
【發(fā)明內(nèi)容】
作進(jìn)一步的說明，但不是對(duì)本發(fā)明的限定。
[0019]實(shí)施例1
一種以愈傷組織誘導(dǎo)白及四倍體的方法，包括以下步驟:
(1)在超凈工作臺(tái)上，將愈傷組織切分成0.3cm X 0.3cm的小塊，接入增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)10 d;在無菌條件下，往培養(yǎng)瓶中加入滅菌過的化學(xué)誘導(dǎo)劑，化學(xué)誘導(dǎo)劑浸泡愈傷組織24h；
所述的化學(xué)誘導(dǎo)劑為:0.05%秋水仙素+3%DMS0 ；
所述增殖培養(yǎng)基為:N6+2，4-D 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+TDZ 0.5 mg/L，pH6.0;
(2)在超凈工作臺(tái)上，將步驟(I)中的愈傷組織取出，放入無菌水中清洗5次，在無菌濾紙上吸干水，接入分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)，22 d產(chǎn)生芽點(diǎn)，36 d形成芽，55 d芽長(zhǎng)出2?3片葉，芽細(xì)弱，葉色黃綠色；
所述分化培養(yǎng)基為:MS+6-BA 1.0 mg/L+ZT 0.5 mg/L+NAA0.5 mg/L，pH6.0;
(3)在超凈工作臺(tái)上，將步驟(2)中的芽接入生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)，7d時(shí)芽的下端出現(xiàn)突起，12 d開始長(zhǎng)根，45 d根長(zhǎng)為1.0 cm；
所述生根培養(yǎng)基為:1/2MS+NAA 0.5 mg/L+IBA 1.0 mg/L+KT 0.4 mg/L，pH6.0;
(4)上午9?11點(diǎn)，在超凈工作臺(tái)上，將步驟(3)中的白及小苗小心取出，放在滅菌過的盤子里，切下約0.5 cm長(zhǎng)的根尖，將根尖立即放入預(yù)處理液中，處理3 h，將小苗上剩余的根系切除，再接入生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并將根尖與小苗編號(hào)；
所述的