利用新鮮牛角膜以制備牛角膜基質(zhì)的方法及應(yīng)用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種牛角膜基質(zhì)的制備方法，尤其是一種利用新鮮牛角膜以制備牛角膜基質(zhì)的方法及應(yīng)用方法。
【背景技術(shù)】
[0002]角膜疾病是全球第四大致盲病患，據(jù)世界衛(wèi)生組織數(shù)據(jù)，全球范圍內(nèi)，角膜疾病是僅次于白內(nèi)障、青光眼、老年性黃斑部病變的第四大致盲病患，約占5.1 %。2006年《第二次全國(guó)殘疾人抽樣調(diào)查統(tǒng)計(jì)結(jié)果》表明，因角膜病致盲患者約400萬(wàn)人，且每年新增10多萬(wàn)患者，其中約200萬(wàn)可以通過(guò)角膜移植手術(shù)復(fù)明，但每年施行的角膜移植手術(shù)例數(shù)為4000-5000例，大量患者因沒有供體來(lái)源而失明，約300萬(wàn)患者在“等米下鍋”，而不準(zhǔn)用死刑犯人遺體的規(guī)定讓角膜的供給大幅下降，每年排隊(duì)等待角膜供體的患者數(shù)量還會(huì)大幅增加。由此可見，構(gòu)建人工角膜是中國(guó)目前的當(dāng)務(wù)之急。近年來(lái)，組織工程角膜技術(shù)的發(fā)展為角膜移植帶來(lái)了希望，但理想的牛角膜基質(zhì)支架仍然是角膜體外重建的研究熱點(diǎn)和技術(shù)難點(diǎn)。
[0003]在角膜載體支架方面，雖然國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)羊膜、異種脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)等天然生物材料和復(fù)合材料進(jìn)行了大量的試驗(yàn)研究，但真正能滿足臨床要求的載體支架還是空白，已報(bào)道的異種(如豬角膜基質(zhì))經(jīng)脫細(xì)胞處理后所形成的支架也存在著結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重、透明度低、彈力差等致命缺陷。而且制備脫細(xì)胞牛角膜基質(zhì)過(guò)程中使用胰酶、乙二胺四乙酸溶液及聚乙二醇辛基苯基醚、十二烷基硫酸鈉等去垢劑，對(duì)基質(zhì)中膠素蛋白等天然生物大分子制成的膜片有很大的破壞作用，而臨床報(bào)道中移植后的角膜呈明顯的不透明狀也印證了這種材料的缺陷，并不能臨床應(yīng)用。由此可見，制備出一種透明性好、結(jié)構(gòu)致密、與人角膜細(xì)胞相容性好的基質(zhì)材料是角膜臨床應(yīng)用的關(guān)鍵難題。
[0004]由此可見，制備出一種透明性好、結(jié)構(gòu)致密、與人角膜細(xì)胞相容性好的基質(zhì)材料是角膜臨床應(yīng)用的關(guān)鍵難題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對(duì)上述問題中存在的不足之處，本發(fā)明提供一種透明性好、結(jié)構(gòu)致密、與人角膜細(xì)胞相容性好的利用新鮮牛角膜以制備牛角膜基質(zhì)的方法及應(yīng)用方法。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種利用新鮮牛角膜以制備牛角膜基質(zhì)的方法，包括以下步驟:
[0007]從新鮮牛眼球上切取角膜片后，并將角膜片浸泡在低滲溶液中；
[0008]由角膜片上得到包含前彈力層和部分基質(zhì)層的牛角膜基質(zhì)，將其反復(fù)凍融，以使細(xì)胞破碎；
[0009]依次采用緩沖液對(duì)牛角膜基質(zhì)進(jìn)行漂洗、以及將其放入脫細(xì)胞試劑中進(jìn)行浸泡后，采用超純水對(duì)其進(jìn)行沖洗；
[0010]將牛角膜基質(zhì)放入另一種脫細(xì)胞試劑中進(jìn)行浸泡后，再次采用超純水對(duì)牛角膜基質(zhì)進(jìn)行沖洗；
[0011]將牛角膜基質(zhì)放入脫水劑中進(jìn)行浸泡后，采用鈷-60對(duì)牛角膜基質(zhì)進(jìn)行輻照后，將所制備的牛角膜基質(zhì)放干燥保存。
[0012]上述的利用新鮮牛角膜以制備牛角膜基質(zhì)的方法，其中，上述方法的具體步驟如下:
[0013]S1、取12小時(shí)內(nèi)的新鮮牛眼球，用生理鹽水沖洗干凈后，用顯微角膜環(huán)鉆切取200?500微米的角膜片，將其放于低滲溶液中浸泡30?60分鐘；
[0014]S2、用手術(shù)刀刮掉角膜片的上皮層，保留前彈力層，撕掉后彈力層和內(nèi)皮層，得到包含前彈力層和部分基質(zhì)層的牛角膜基質(zhì)，將其反復(fù)凍融使細(xì)胞破碎；
[0015]S3、依次采用緩沖液對(duì)牛角膜基質(zhì)漂洗2?3次、以將其放入脫細(xì)胞試劑浸泡15?90分鐘，再采用超純水對(duì)其進(jìn)行沖洗2?3次；
[0016]S4、將牛角膜基質(zhì)放入另一種脫細(xì)胞試劑浸泡15?30分鐘后，再采用超純水對(duì)其進(jìn)行沖洗2次；
[0017]S5、將牛角膜基質(zhì)放入脫水劑中進(jìn)行浸泡3?6小時(shí)后，采用劑量為5?151?7的鈷-60對(duì)牛角膜基質(zhì)輻照I?5小時(shí)后，將所制備的牛角膜基質(zhì)放置于無(wú)水氯化鈣中干燥保存。
[0018]上述的利用新鮮牛角膜以制備牛角膜基質(zhì)的方法，其中，在步驟SI中，低滲溶液為濃度為0.3 %?0.5 %的NaCl溶液。
[0019]上述的利用新鮮牛角膜以制備牛角膜基質(zhì)的方法，其中，在步驟S2中，將牛角膜基質(zhì)冷凍I或3小時(shí)，并解凍15?60分鐘，以使牛角膜基質(zhì)的細(xì)胞破碎。
[0020]上述的利用新鮮牛角膜以制備牛角膜基質(zhì)的方法，其中，在步驟S3中，緩沖液為10mmTris-HCl 緩沖液，其 pH 值為7.5;
[0021 ]脫細(xì)胞試劑采用濃度為3_5g/L的碳酸氫鈉溶液。
[0022]上述的利用新鮮牛角膜以制備牛角膜基質(zhì)的方法，其中，在步驟S4中，另一種脫細(xì)胞試劑采用濃度為0.6%。?1.8%。的次氯酸鈉溶液。
[0023]上述的利用新鮮牛角膜以制備牛角膜基質(zhì)的方法，其中，在步驟S5中，脫水劑采用體積比為70%或80%的甘油脫水劑。
[0024]上述的利用新鮮牛角膜以制備牛角膜基質(zhì)的方法，其中，在步驟S5中，將牛角膜基質(zhì)放于質(zhì)量指標(biāo)符合HG/T2765-2005標(biāo)準(zhǔn)的硅膠干燥劑中干燥保存。
[0025]本發(fā)明還提供一種利用新鮮牛角膜以制備的牛角膜基質(zhì)的應(yīng)用方法，在對(duì)牛角膜基質(zhì)應(yīng)用前采用PBS浸泡10分鐘復(fù)水后，即可在手術(shù)中使用。
[0026]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn):
[0027]本發(fā)明通過(guò)反復(fù)凍融與兩種脫細(xì)胞試劑交替使用的方法，逐步去除牛角膜基質(zhì)中免疫原細(xì)胞成分和可溶性蛋白，從而得到無(wú)排異的脫細(xì)胞牛角膜基質(zhì)，干燥后儲(chǔ)存，使用前用PBS浸泡10分鐘復(fù)水后即可手術(shù)。本發(fā)明采用物理方法與低毒性試劑，且時(shí)間極短，所得到的牛角膜基質(zhì)保存完整，安全性高、無(wú)抗原性，接近于人體角膜的自然特性。本發(fā)明具體成本低、工藝簡(jiǎn)單、操作時(shí)間短、便于保存等特點(diǎn)，有利于工業(yè)化生產(chǎn)和臨床應(yīng)用。
【附圖說(shuō)明】
[0028]圖1與圖2為本發(fā)明的脫細(xì)胞牛角膜基質(zhì)一實(shí)施例的脫細(xì)胞處理前后的HE染色對(duì)比照片，其中，圖1為脫細(xì)胞前，圖2為脫細(xì)胞后；
[0029]圖3為成品脫細(xì)胞牛角膜基質(zhì)片的照片；
[0030]圖4與圖5為本發(fā)明的脫細(xì)胞牛角膜基質(zhì)在進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)手術(shù)移植后的照片，圖4為手術(shù)移植一周后，圖5為手術(shù)移植一個(gè)月后；
[0031]圖6與圖7為本發(fā)明的脫細(xì)胞牛角膜基質(zhì)在進(jìn)行臨床試驗(yàn)手術(shù)移植前后的對(duì)比照片，其中，圖6為手術(shù)移植一周后，圖7為手術(shù)移植一個(gè)月后。
【具體實(shí)施方式】
[0032]實(shí)施例1
[0033]本發(fā)明提供一種利用新鮮牛角膜以制備牛角膜基質(zhì)的方法，包括以下步驟:
[0034]S1、取不超過(guò)8小時(shí)內(nèi)采取的新鮮牛眼球，用生理鹽水沖洗干凈后，用顯微角膜環(huán)鉆切取200微米的角膜片，放入濃度為0.6 %的NaCl低滲溶液中30分鐘。
[0035]S20、用手術(shù)刀刮掉角膜上皮層，保留前彈力層，操作時(shí)手法輕柔，刮到前彈力膜層為止。在手術(shù)剪刀幫助下，撕掉后彈力層和內(nèi)皮層，得到包含前彈力層和部分基質(zhì)層的牛角膜基質(zhì)。將牛角膜基質(zhì)片放置在裝有PBS的50ml凍存管中，在-80°C冰箱中凍I小時(shí)后，于37°C融化15分鐘，反復(fù)凍融3次進(jìn)行細(xì)胞破壁，以使牛角膜基質(zhì)片的細(xì)胞破碎。
[0036]S3、采用10mmTris-HCl緩沖液(pH值為7.5)漂洗3次，且每次漂洗10分鐘；
[0037]將牛角膜基質(zhì)放在3g/L的碳酸氫鈉溶液中浸泡15分鐘，然后用超純水沖洗2次。
[0038]S4、將牛角膜基質(zhì)放在0.6%。次氯酸鈉溶液中浸泡5分鐘，然后用超純水沖洗2次。
[0039]S5、將所得到的牛角膜基質(zhì)放在70 %的甘油脫水劑中浸泡3小時(shí)；
[0040]將牛角膜基質(zhì)用劑量為5KGy的鈷-60輻照I小時(shí)；
[0041 ]將所制備的牛角膜基質(zhì)放于質(zhì)量指標(biāo)符合HG/T2765-2005標(biāo)準(zhǔn)的硅膠干燥劑中干燥保存。
[0042]實(shí)施例2
[0043]本發(fā)明提供一種利用新鮮牛角膜以制備牛角膜基質(zhì)的方法，包括以下步驟:
[0044]S1、取不超過(guò)12小時(shí)內(nèi)采取的新鮮牛眼球，用生理鹽水沖洗干凈后，用顯微角膜環(huán)鉆切取300微米的角膜片，放入濃度為0.7%的NaCl低滲溶液中45分鐘。
[0045]S20、用手術(shù)刀刮掉角膜上皮層，保留前彈力層，操作時(shí)手法輕柔，刮到前彈力膜層為