制，本領(lǐng)域技 術(shù)人員可以根據(jù)實(shí)際需要靈活選擇。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，所述BamH頂每切處理的反 應(yīng)體系可以為:BamH I，15UAU，ΙμL; 10 XK緩沖液，2μ1;所述擴(kuò)增產(chǎn)物，ΙμL;加無(wú)菌水至總 體積20μ1;所述BamH I酶切處理的反應(yīng)條件可以為:37攝氏度，反應(yīng)2小時(shí)。由此，能夠使得 線性片段具有粘性末端，有利于后續(xù)連接反應(yīng)進(jìn)行，特異性較好。
[0043]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述連接反應(yīng)的具體條件不受特別限制，只要能夠?qū)⑸鲜?步驟中形成的具有粘性末端的線性片段連接形成環(huán)狀質(zhì)粒即可，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù) 實(shí)際需要靈活選擇。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，所述連接反應(yīng)的體系可以為:T4DNA連接酶， 350U/ml，lml; 10 X T4DNA連接酶緩沖液2.5ml，BamH I酶切0.03pmol，最后用無(wú)菌水將總體 積補(bǔ)充至25mL;所述連接反應(yīng)的條件可以為：16攝氏度，過(guò)夜連接。由此，連接效果較好，重 組成功率較高。
[0044] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，對(duì)所述重組細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，得到所述重組M13噬菌體可以進(jìn) 一步包括:將所述重組細(xì)胞與45°C頂層瓊脂混合，并將所得到的混合物涂布于LB固體平板， 其中，所述LB固體平板上涂布有異丙基硫代-β-D-半乳糖苷和5溴_4_氯-3-Π 引噪-β-D半乳糖 苷。由此，能夠在最適合的條件下培養(yǎng)所述重組細(xì)胞，有利于重組Ml 3KE噬菌體載體在感受 態(tài)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)、及組裝，以高效、快速地生成重組Ml3噬菌體。
[0045] 在本發(fā)明的具體示例中，制備前面所述的重組M13噬菌體的方法可以包括以下步 驟:將l〇ng重組M13KE噬菌體載體轉(zhuǎn)入E.coli ER2738的感受態(tài)細(xì)胞，加入lml S0C培養(yǎng)基， 37°C培育30min，將得到的重組細(xì)胞轉(zhuǎn)入45°C頂層瓊脂(每升含10g細(xì)菌蛋白胨，5g酵母抽提 物，10g NaCl，lg MgCl2 · 6H20,7g瓊脂粉)混合，再將得到的混合物立刻轉(zhuǎn)移到加入異丙基 硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG)和5溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖苷(X-gal)(50mg IPTG，40mg X-gal，溶于lml二甲基甲酰胺）的LB固體平板。重組成功的噬菌體在平板上生長(zhǎng)后呈藍(lán)色噬菌 斑。
[0046] 在本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提供了前面所述的微電解體系在處理污水中的用 途。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在前面所述的微電解體系中，由于第一金屬和第二金屬之間存在電位差， 能夠有效形成微電解體系，進(jìn)而能夠大大提高還原污水中污染物的效果，不僅還原率高，所 需時(shí)間短，還可在常溫常壓下對(duì)污水進(jìn)行處理，且該微電解體系不需要使用貴金屬催化劑， 成本較低，同時(shí)凈化污水效果理想。
[0047] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，前面所述的微電解體系能夠通過(guò)微電解處理的污染物的具 體種類不受特別限制，只要能夠通過(guò)微電解作用進(jìn)行還原氧化反應(yīng)即可。在本發(fā)明的一些 實(shí)施例中，所述污水中含有對(duì)氯硝基苯和六價(jià)鉻離子中的至少一種。由此，還原污染物的效 果理想，能夠有效污水中的有害物質(zhì)，進(jìn)而有效保護(hù)環(huán)境和人體健康。
[0048] 在本發(fā)明的再一方面，本發(fā)明提供了一種處理污水的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例， 該方法包括:將前面所述的微電解體系加入污水中。該方法所有步驟均在常溫常壓下進(jìn)行， 反應(yīng)條件溫和，而且該方法中不需要使用貴金屬催化劑，成本較低，且微電解體系中作為陰 極的金屬不產(chǎn)生損失，另外，該方法還原率較高，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于單獨(dú)使用一種金屬的體系，且反 應(yīng)時(shí)間較短，效率較高。
[0049] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，根據(jù)實(shí)際需要，在將前面所述的微電解體系加入污水中之 前，還可以進(jìn)一步包括將所述污水進(jìn)行酸化處理的步驟。由此，可以使得污水具有適合進(jìn)行 微電解反應(yīng)的條件，有利于提高反應(yīng)速率和還原效率。
[0050] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，將所述污水酸化的具體方法不受特別限制，只要使得污水 呈酸性即可。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，可以向污水中添加酸性物質(zhì)，例如包括但不限于磷 酸、鹽酸、硫酸等。預(yù)先將污水酸化，有利于微電解體系與污水共同形成的微電解體系，發(fā)揮 還原污染物的作用，提高還原率。
[0051] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述污水中含有對(duì)氯硝基苯和六價(jià)鉻離子中的至少一種。 由此，還原污染物的效果理想，能夠有效污水中的有害物質(zhì)，進(jìn)而有效保護(hù)環(huán)境和人體健 康。
[0052]下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例。
[0053] 實(shí)施例1:M13噬菌體周身p8衣殼蛋白的基因工程改造
[0054] 野生型M13噬菌體(從NEB公司購(gòu)買(mǎi)）周身2700個(gè)拷貝的p8(pVIII)蛋白N-末端序列 均為N-Ala-Glu-Gly-Asp-Asp-Pro- · (N-AEGDDP-)。在該實(shí)施例中，設(shè)計(jì)強(qiáng)負(fù)電多肽序列 AEEEAAEEDP，將其基因序列GAAGAAGAAGCGGCGGAAGAG(SEQ ID N0:6)插入野生型M13噬菌體 的N-末端，以獲得同時(shí)對(duì)多種金屬離子具有較強(qiáng)吸附作用的基因工程改造噬菌體M13-6ED。 具體操作方法如下：
[0055]首先將M13KE·菌體載體(Mao et al.Virus-Based Toolkit for the Directed Synthesis of Magnetic and Semiconducting Nanowires.Science.2004,303:213-217) 進(jìn)行Pst Ι(15υ/μ1，購(gòu)自TaKaRa Biotechnology，Dalian)酶切，反應(yīng)體系為:Pst Ι，1μ1;10 X H緩沖液，2μ1 ;M13KE噬菌體載體，lyg;加無(wú)菌水至總體積20μ1，37 °C，反應(yīng)2小時(shí)。將Pst I 酶切后的M13KE噬菌體載體進(jìn)行鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增。PCR體系為:LA Taq聚合酶，5U/ 41，0.5以1;10\1^?01?緩沖液，541;(1町？8,841，？8七1酶切液，11^，引物1，序列為 ： AGGGTGAGGATCCCGCAAAA ( SEQ ID N 0 : 4 )，2 0 μ Μ，1 μ 1 ;弓丨物 2，序列為： CTACTACAAGGATCCTCTTCCGCCGCTTCTTCTTCTGCAGCGAAAGACAGCATCGGAACGAG(SEQ ID NO：5), 20μΜ，1μ1;補(bǔ)足無(wú)菌水至δΟμΚΡΟ?條件為：94°C，5min后，94°C，30S，55°C，30S，72°C，7min， 30個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物采用內(nèi)切酶BamH I降解（即BamH I酶切），反應(yīng)體系為:BamH I，15UAU，ΙμL; 10 X K緩沖液，2μ1;上步得到的擴(kuò)增產(chǎn)物，ΙμL;加無(wú)菌水至總體積20μ1; 37攝 氏度，反應(yīng)2小時(shí)。接著，再使用T4DNA連接酶，常規(guī)條件下16°C過(guò)夜連接，具體反應(yīng)體系為： T4DNA連接酶，350U/ml，lml; 10 X T4DNA連接酶緩沖液2.5ml，BamH I酶切0.03pmol，用無(wú)菌 水將總體積補(bǔ)充至25mL。然后，將10ng連接反應(yīng)得到的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入E.coli ER2738(購(gòu)自 NEB公司）的感受態(tài)細(xì)胞，加入lml S0C培養(yǎng)基，37°C培育30min，再將得到的重組細(xì)胞轉(zhuǎn)入45 。(:頂層瓊脂(每升含10g細(xì)菌蛋白胨，5g酵母抽提物，10g NaCl，lg MgCl2 · 6H20,7g瓊脂粉） 混合，再將得到的混合物立刻轉(zhuǎn)移到加入異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)和5溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖苷(X-gal) (50mg IPTG，40mg X-gal，溶于lml二甲基甲酰胺）的LB固體平板 擴(kuò)增培養(yǎng)，并通過(guò)藍(lán)白斑篩選法得到目的重組M13噬菌體，重組成功的噬菌體在平板上生長(zhǎng) 后呈藍(lán)色噬菌斑，重組未成功的噬菌體在平板上生長(zhǎng)后呈白色噬菌斑。
[0056]采用分子克隆標(biāo)準(zhǔn)方法提取上述獲得的重組成功的噬菌體DNA，并對(duì)其進(jìn)行測(cè)序， 測(cè)序結(jié)果表明上述SEQ ID N0:6所示的序列正確插入了噬菌體基因的相應(yīng)位置，pVIII蛋白 末端正確插入了目的片段，獲得了 PVIII蛋白N-末端氨基酸序列為N-AEEEAAEEDP-……的重 組M13噬菌體M13-6ED，其結(jié)構(gòu)示意圖見(jiàn)圖1。
[0057]將大腸桿菌ER2738搖床培養(yǎng)12h，收獲菌液，用無(wú)菌LB培養(yǎng)基(蛋白胨：10g/L，酵母 粉:5g/L，氯化鈉：10g/L，pH7.0)進(jìn)行1:100稀釋后，向兩組稀釋后得到的溶液中分別加入1μ 1 NEB試劑盒中的野生型Ml 3噬菌體(購(gòu)自NEB公司）和上述得到的重組Ml 3噬菌體Ml 3-6ED， 然后采用噬菌體擴(kuò)增的常規(guī)方法進(jìn)行擴(kuò)增。采用擴(kuò)增得到的滴度為l〇nPfu的野生型和重組 M13噬菌體，分別與200ml濃度為2mM的氯化亞鐵和氯化鎳溶液均勻混合5min，接著采用0.22 μπι無(wú)菌濾膜（Sartorius Stedim Biotech)分離菌體，采用等離子體發(fā)射光譜儀（ICP-0ES)測(cè)定溶液中的殘余亞鐵離子和鎳離子濃度，并計(jì)算金屬離子的吸附率(吸附率=(初始 濃度-殘余濃度)/初始濃度），吸附率測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖3,其中，基因工程M13和野生型M13分別 表示重組M13噬菌體和野生型M13噬菌體。從圖3的結(jié)果可以看到，野生型M13噬菌體對(duì)鎳離 子的