一種抗原多肽及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種抗原多肽及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 禽流感病毒(Avian Influenza Virus，AIV)屬于正粘病毒科，甲型流感病毒屬，一 般為球形，直徑為80_120nm，其基因組為分8個(gè)節(jié)段的負(fù)鏈單股RNA，編碼11個(gè)已知蛋白。其 中，病毒包膜上的糖蛋白血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)是血清學(xué)區(qū)分多種病毒亞型的依 據(jù)，目前可分為16個(gè)Η亞型(H1~H16)和9個(gè)N亞型(N1~N9)。
[0003] 禽流感病毒可感染幾乎所有野禽及家禽，根據(jù)致病力的不同，可將其分為高致病 性、低致病性和無致病性AIV。近年來，禽流感在世界范圍流行，給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損 失。由于是單鏈RNA病毒，所以禽流感病毒極易變異，除感染禽類外，還可感染人、豬、馬、水 貂和海洋哺乳動(dòng)物。1997年香港、2003年荷蘭、2004年以來東南亞都出現(xiàn)了人感染高致病性 禽流感而死亡的病例。高致病性禽流感(Hihgly Pathogenic Avian Influenza，HPAI)被世 界動(dòng)物衛(wèi)生組織(0ΙΕ)列為法定報(bào)告疫病，我國也將其列為一類動(dòng)物疫病。
[0004] 2013年3月，我國首次出現(xiàn)Η7Ν9禽流感病毒感染人類，隨后各地持續(xù)性出現(xiàn)感染病 例的報(bào)道，引起世界的廣泛關(guān)注。一些研究認(rèn)為這種新型禽流感病毒亞型Η7Ν9可能是一種 來自數(shù)種禽流感病毒的變異和重配病毒，從而賦予其跨越物種感染的能力。流感病毒血凝 素蛋白在病毒吸附、穿膜和決定病毒的致病性方面起著關(guān)鍵作用。血凝素變異性很強(qiáng)，近年 來已報(bào)道多起由禽流感病毒亞型Η7Ν1、Η7Ν2、Η7Ν3、Η7Ν4、Η7Ν7引起的禽流感爆發(fā)流行事件， 直接導(dǎo)致人類感染禽流感病毒數(shù)量的增加。
[0005] 研制快速診斷Η7亞型禽流感的檢測(cè)方法，對(duì)于制定治療和用藥方案;控制傳染病 流行具有重要的意義。通常情況下，高致病性禽流感的診斷可以根據(jù)臨床癥狀、大體剖檢等 作出初步診斷，具體可參考國家頒布的《高致病性禽流感防治技術(shù)規(guī)范》。確診和分型則需 要進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室診斷，包括:病原的分離與鑒定、血清學(xué)診斷。實(shí)驗(yàn)室診斷Η7亞型禽流感患者 以反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(RT-PCR)為主，但是高致病性禽流感病毒需要在生物安全3級(jí) 實(shí)驗(yàn)室才能操作，操作人員必須經(jīng)過專業(yè)的訓(xùn)練，而且分離鑒定需要較長(zhǎng)的時(shí)間，因此該方 法的應(yīng)用受到極大的限制。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明提供了一種能夠與人抗Η7亞型禽流感病毒血凝素抗體特異性結(jié)合的抗原 多肽，利用該抗原多肽制得的試劑盒可以快速、簡(jiǎn)便診斷人感染Η7亞型禽流感病毒。
[0007] -種抗原多肽，為如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)：
[0008] (a)氨基酸序列為QMTKSYKNTRKS的蛋白質(zhì)；
[0009] (b)在(a)中的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸能夠與人抗H7 亞型禽流感病毒血凝素抗體特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)。
[0010]所述抗原多肽是根據(jù)已報(bào)道的感染人的禽流感病毒A/Zhejiang/DTID-ZJUOl/ 2013(H7N9)株的血凝素蛋白（GenBank序列號(hào)AGJ51953.1)氨基酸序列，利用生物信息學(xué)和 免疫學(xué)技術(shù)預(yù)測(cè)并篩選出具有良好的特異性和較強(qiáng)的免疫原性的線性B細(xì)胞抗原表位。 [0011]本發(fā)明還提供了所述抗原多肽在制備診斷人感染H7亞型禽流感病毒的試劑盒中 的應(yīng)用。
[0012] 由于本發(fā)明抗原多肽可以與抗H7亞型禽流感病毒血凝素抗體特異性結(jié)合，因此可 以利用免疫反應(yīng)制得相應(yīng)的試劑盒，如本發(fā)明實(shí)施例公開的多肽酶聯(lián)免疫吸附試劑盒等， 當(dāng)然也可以是試紙條。
[0013] 本發(fā)明又提供了一種診斷人感染H7亞型禽流感病毒的多肽酶聯(lián)免疫吸附試劑盒， 包括預(yù)包酶標(biāo)板，所述預(yù)包酶標(biāo)板包被所述的抗原多肽。
[0014]優(yōu)選的，所述抗原多肽使用濃度為10yg/mL，96孔酶標(biāo)板每孔用量為lyg。抗原多肽 可以從公司購買人工合成的，也可以使用轉(zhuǎn)基因技術(shù)由微生物細(xì)胞進(jìn)行發(fā)酵獲得。優(yōu)選的， 抗原多肽為人工合成。
[0015] 除了上述預(yù)包酶標(biāo)板外，該多肽酶聯(lián)免疫吸附試劑盒還包括樣品稀釋液、陰性對(duì) 照血清、陽性對(duì)照血清、酶標(biāo)二抗、濃縮洗滌液、TMB顯色液和終止液。
[0016] 所述樣品稀釋液為牛血清白蛋白（BSA)濃度為5~50g/L的緩沖液;所述陰性對(duì)照 血清為未被H7N9感染的正常人血清；所述陽性對(duì)照血清為感染H7N9禽流感病毒的患者血 清;所述酶標(biāo)二抗為辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗人IgG抗體;所述濃縮洗滌液為25 X含Tween 20的緩沖液，使用時(shí)用純凈水稀釋25倍，現(xiàn)配現(xiàn)用。
[0017] 本發(fā)明還提供所述試劑盒的使用方法，包括以下步驟：
[0018] (1)樣品收集、準(zhǔn)備；（2)加樣孵育；（3)洗板；（4)加二抗孵育；（5)洗板；（6)顯色； (7)終止顯色；（8)讀板；（9)結(jié)果分析。
[0019]本發(fā)明結(jié)果分析的方法為：Cutoff = 2.1 X陰性對(duì)照孔平均值0D45Q，當(dāng)待測(cè)樣本 0D45Q 2 Cutoff值為陽性;樣品0D45Q < Cutoff值為陰性。：
[0020] 本發(fā)明試劑盒檢測(cè)靈敏度高、特異性強(qiáng)、成本低、方法簡(jiǎn)便、快速、重復(fù)性好，適用 于人感染H7亞型禽流感病毒的快速檢測(cè)和流行病學(xué)研究，特別是能夠適合于基層單位使 用。
【附圖說明】
[0021] 圖1為H7N9禽流感病毒血凝素蛋白線性抗原表位的預(yù)測(cè)結(jié)果圖，其中A、B、C和D為 預(yù)測(cè)所得的4個(gè)抗原表位位點(diǎn)；
[0022]圖2為預(yù)測(cè)的4段抗原多肽分別與流感病毒亞型H1~H16的HA蛋白氨基酸序列比對(duì) 圖；
[0023]圖3為預(yù)測(cè)的4個(gè)抗原表位位點(diǎn)在H7N9HA蛋白中的分布情況圖；
[0024]圖4為使用本發(fā)明試劑盒檢測(cè)H7N9患者血清中血凝素特異性抗體的結(jié)果分析圖。
【具體實(shí)施方式】 [0025] 實(shí)施例1
[0026] 通過DNAStar Lasergene's Protean系統(tǒng)分析人感染H7N9禽流感病毒血凝素蛋白 氨基酸序列(GenBank序列號(hào)AGJ51953.1)的抗原性、親水性、柔韌性和表面可及性。選擇抗 原性指數(shù)2 0、親水性指數(shù)2 0、蛋白質(zhì)表面可及性指數(shù)2 1和其內(nèi)部或附近具有柔韌性結(jié)構(gòu) 的氨基酸區(qū)段(圖1)，綜合分析以上結(jié)果，選取四種因素都符合的多肽區(qū)段判定為潛在的線 性B細(xì)胞抗原表位，共獲得4段多肽，各預(yù)測(cè)位點(diǎn)分別位于其N端的第172-183(A)、363-380 (B)、452-472(C)和491-506(D)四個(gè)區(qū)段(表1)。
[0027] 表1預(yù)測(cè)人感染H7N9禽流感病毒HA蛋白線性B細(xì)胞抗原表位
[0028]
[0029] *是多肽序列每個(gè)氨基酸對(duì)應(yīng)指數(shù)的加權(quán)平均值。