一種抗topk第74位酪氨酸殘基磷酸化的抗體及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物和疾病診斷領域，具體涉及一種抗Τ0ΡΚ第74位酪氨酸殘基磷酸化 的抗體，本發(fā)明還涉及該抗體的制備方法和應用。
【背景技術】
[0002] Τ0ΡΚ，又名，即PDZ連接激酶及淋巴因子激活的殺傷性Τ淋巴細胞源性蛋白激 酶，其作為一種新的絲-蘇氨酸蛋白激酶[1，2]，在乳腺癌、結直腸癌、黑色素瘤、肺癌、白血 病等[3]多種腫瘤細胞中呈高表達，并且表達量與乳腺癌和結直腸癌的惡性程度明顯相關
[4] J0PK參與了腫瘤細胞周期進程[5-8]、腫瘤細胞轉化[9,10]、增殖[11]和凋亡[12,13] 等功能的調控。
[0003] 近年越來越多的研究發(fā)現(xiàn)Τ0ΡΚ在腫瘤的臨床診斷以及預后預測中發(fā)揮了重要作 用。2010年Zlobec I等探討了在2000例結腸癌病例中Τ0ΡΚ的預后價值，提出Τ0ΡΚ高表達的 病例預后差，同時提出Τ0ΡΚ高表達的病例與酪氨酸激酶抑制劑的耐受有關，Τ0ΡΚ抑制劑的 發(fā)現(xiàn)將惠及30-40%結腸癌患者。另外，該研究組還指出Τ0ΡΚ激活相關機制的研究將對克服 酪氨酸激酶抑制劑的耐受有重要意義[14] jeschoolmeester D等認為Τ0ΡΚ是結腸癌的最 有價值的腫瘤標志物之一，與之相關的靶向治療應逐步展開[15]。也有文獻報道Τ0ΡΚ在肺 癌中的表達與Ki67(細胞增殖標記物)和p53密切相關，可能會成為非小細胞肺癌獨立的預 后指標[lehShih MC等也認為Τ0ΡΚ通過調控PI3K/AKT/PTEN信號通路影響肺癌細胞的轉 移，并可作為肺癌預后的指標和潛在的治療靶點[17]。另外，Chen F[18]等報道稱Τ0ΡΚ表達 水平在人肝癌組織和細胞系中顯著上調，在肝癌SMMC-7721細胞中基因沉默Τ0ΡΚ后導致細 胞周期停滯，抑制細胞生長和腫瘤形成，暗示著Τ0ΡΚ可能調節(jié)肝細胞的增殖，可能會成為肝 癌有意義的分子靶點和預后標志物。Jae-Hyun等[19]在對81例乳腺癌的全基因組表達譜進 行分析后發(fā)現(xiàn)Τ0ΡΚ上調，并且在其細胞的有絲分裂早期呈高表達，可能通過磷酸化Histone H3促進有絲分裂，從而增強腫瘤細胞的增殖。除此之外，Hu F[20]等人發(fā)現(xiàn)Myc-E2F1-T0PK 信號通路在惡性淋巴瘤中起著調控作用，Τ0ΡΚ可能會成為淋巴瘤免疫治療中的靶點。
[0004] 隨著研究的深入，Τ0ΡΚ正逐漸成為新的腫瘤發(fā)生的標志物和抗腫瘤治療的靶點。 然而，目前對于Τ0ΡΚ的研究，兩個重要的研究瓶頸逐漸顯現(xiàn)出來。一是Τ0ΡΚ晶體結構解析困 難，導致其抑制劑領域的研究進行緩慢，阻礙了其用于臨床疾病診斷和治療的發(fā)展前景。其 次是Τ0ΡΚ的上游調控機制尚不完全清楚，目前已有報道hDlg[2]，ERK2[9]，c-Myc-E2Fl [20]，P53[21]，E2F-CREB/ATF[22]和 Cdkl/CyclinB[l，23]能與 Τ0ΡΚ 相互作用并調節(jié)其功 能。但是，非磷酸化的Τ0ΡΚ表達并不能準確體現(xiàn)Τ0ΡΚ在細胞內的活性，目前僅有研究表明蛋 白激酶Cdkl/Cycl inB和ERK2能在Thr9位點磷酸化激活Τ0ΡΚ，且研究證實Thr9位點磷酸化與 Τ0ΡΚ促進腫瘤發(fā)生的關系無關。因此，進一步尋找與腫瘤關系密切的Τ0ΡΚ磷酸化修飾機制， 即Τ0ΡΚ的上游激酶及磷酸化作用位點，并開發(fā)相應位點的磷酸化抗體，將有利于擴展Τ0ΡΚ 在臨床診斷、治療方面的實際應用。
[0005] 參考文獻：
[0006] l.Abe Y,Matsumoto S，Kito K，et al.Cloning and expression of a novel MAPKK-like protein kinase ,lymphokine-activated killer T~cel1-originated protein kinase,specifically expressed in the testis and activated lymphoid cells.J Biol Chem 2000;275:21525-21531.
[0007] 2.Gaudet S，Branton D，Lue RA.Characterization of PDZ-binding kinase，a mitotic kinase.Proc Natl Acad Sci 2000;97:5167-5172.
[0008] 3.Dougherty JD,Garcia AD,Nakano I,et al.ΡΒΚ/Τ0ΡΚ,a proliferating neural progenitor-specific mitogen activated protein kinase kinase.J Neurosci,2005；25(46):1077-10785.
[0009] 4.Nandi A,Tidwell M,Karp J,et al.Protein expression of PDZ-binding kinase is up-regulated in hematologic malignancies and strongly down-regulated during terminal differentiation of HL_601eukemic cells.Blood Cells Mol Dis,2004；32(l):240-245.
[0010] 5.Matsumoto S,Abe Y,Fujibuchi T,et al.Characterization of a MAPKK-like protein kinase PBK/TOPK.Biochem Biophys Res Commun 2004;325:997-1004.
[0011] 6.Park JH,Nishidate T，Nakamura Y，et al.Critical roles of T-LAK cell-originated protein kinase in cytokinesis.Cancer Sci 2010；101:403-411.
[0012] 7.Fukukawa C,Ueda K,Nishidate T,et al.Critical roles of LGN/ GPSM2phosphorylation by ΡΒΚ/Τ0ΡΚ in cell division of breast cancer cells.Genes Chromosomes Cancer 2010;49:861-872.
[0013] 8·Shinde SR，Gangula NR，Kavela S，et al·ΡΒΚ/Τ0ΡΚ and PTEN participate in CHFR mediated mitotic checkpoint.Cell Signal 2013;25:2511-2517.
[0014] 9.Zhu F,Zykova TA，Kang BS，et al.Bidirectional signals transduced by PBK/T0PK-ERK interaction increase tumorigenesis of HCT116 colorectal cancer cells.Gastroenterology 2007；133:219-231.
[0015] 10.Oh SM,Zhu F,Cho YY,et al.T-lymphokine-activated killer cell-originated protein kinase functions as a positive regulator of c-Jun_NH2-kinase 1 signaling and H-Ras-induced cell transformation.Cancer Res 2007;67: 5186-5194.
[0016] ll.Ayllon VjO'connor R.PBK/T0PK promotes tumour cell proliferation through p38MAPK activity and regulation of the DNA damage response.Oncogene 2007;26:3451-3461.
[0017] 12.Zykova TA，Zhu F，Lu C,et al.Lymphokine-activated killer T-cell-originated protein kinase phosphorylation of histone H2AX prevents arsenite- induced apoptosis in RPMI7951melanoma cells . Clin Cancer Res 2006；12:6884-6893.
[0018] 13.Zykova TA，Zhu F，Vakorina TI，et al.T-LAK cell-originated protein kinase(ΡΒΚ/Τ0ΡΚ)phosphorylation of Prxl at Ser-32 prevents UVB-induced apoptosis in RPMI7951 melanoma cells through the regulation of Prxl peroxidase activity.J Biol Chem2010；285:29138-29146.
[0019] 14.Zlobec I,Molinari F,Kovac M,et al.Prognostic and predictive value of TOPK stratified by KRAS and BRAF gene alterations in sporadic，hereditary and metastatic colorectal cancer patients.Br J Cancer 2010；102:151-161.
[0020] 15·Siegel RL，Miller KD，Jemal A·Cancer statistics，2015·CA Cancer J Clin 2015;65:5-29.
[0021] 16.Lei B,Liu SG,Qi WJ,et al.ΡΒΚ/ΡΒΚ/Τ0ΡΚ expression in non-small-cell lung cancer: its correlation and prognostic significance with Ki67 and p53 expression[J].Histopathology,2013,63(5):696-703.
[0022] 17.Shih MC,Chen JY,ffu YC,et al.PBK/TOPK promotes cell migration via modulation of the PI3K/PTEN/AKT pathway and is associated with poor prognosis in lung cancer[J].0ncogene,2011,31(19):2389-400.
[0023] 18·Chen F，Li Rff,ffang CJ,et al.T-LAK cell-originated protein kinase is essential for the proliferation of hepatocellular carcinoma SMMC_7721cells [J].Cell Bioche Funct，2013,31(8):736-742.
[0024] 19.Park JH,Lin ML,Nishidate T,et al.PDZ-binding kin