一種b型流感嗜血桿菌莢膜多糖的制備方法及聯(lián)合疫苗的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及，具體涉及到一種B型流感嗜血桿菌莢膜多糖的制備方法及聯(lián)合疫苗。
【背景技術(shù)】
[0002]流感嗜血桿菌是常見(jiàn)的致病菌，僅對(duì)人類致病，分帶莢膜菌株和不帶莢膜菌株。莢膜菌株據(jù)莢膜多糖的特異性抗原不同分6個(gè)血清型(a-f)，其中b型抗原毒力最大，是小兒敗血癥、腦膜炎和肺炎的主要致病菌。Hib莢膜由脂多糖和莢膜多糖組成，主要成分是核糖基磷酸醇磷酸鹽(polyriboylribitolphosphate，PRP)，它的結(jié)構(gòu)包括一個(gè)核糖、一個(gè)核糖醇以及一個(gè)磷酸堿。
[0003]Hib通過(guò)飛沫傳播，主要感染5歲以下兒童。新生兒通過(guò)胎盤傳遞血清殺菌抗體，從母體獲得的。以蛋白質(zhì)為載體的結(jié)合疫苗接種兒童，產(chǎn)生的抗體比單獨(dú)用莢膜多糖疫苗高得多、且能維持較長(zhǎng)時(shí)間，這些疫苗的基礎(chǔ)是通過(guò)PRP多糖與有免疫原性的蛋白載體以共價(jià)鍵結(jié)合，使半抗原變成完全抗原，從而使非胸腺依賴抗原(T1-Ag)轉(zhuǎn)變成胸腺依賴抗原(Td-Ag)，促進(jìn)T細(xì)胞對(duì)B細(xì)胞的作用。T1-Ag僅能激發(fā)體液免疫，而Td-Ag不僅能激發(fā)體液免疫，而且還能引起細(xì)胞免疫，同時(shí)產(chǎn)生免疫記憶，通過(guò)抗原的轉(zhuǎn)變，不僅使小年齡兒童產(chǎn)生加強(qiáng)免疫反應(yīng)，而且對(duì)再次接種也能產(chǎn)生加強(qiáng)免疫反應(yīng)，由此提高了疫苗的保護(hù)性能。
[0004]為此人們將PRP或其衍生物結(jié)合于一種蛋白載體(如白喉類毒素蛋白、以減毒的白喉類毒素蛋白CPM197、破傷風(fēng)類毒素、腦膜炎奈氏菌外膜蛋白復(fù)合物等)上使其轉(zhuǎn)變成T細(xì)胞依賴性多糖抗原來(lái)增強(qiáng)應(yīng)答，結(jié)合疫苗具有很好的免疫原性。
[0005]近年來(lái)，由于抗菌素的濫用，B型流感嗜血桿菌(HoemophiIus influ enzatypeb，Hib)感染已成為導(dǎo)致世界各地幼兒發(fā)病和死亡的一個(gè)主要原因，每年約有30-50萬(wàn)兒童死于Hib引起的腦膜炎和肺炎等疾病。
[0006]感染性疾病仍然嚴(yán)重威脅著世界人類的健康，尤其是導(dǎo)致嬰幼兒發(fā)病、住院和死亡的重要原因。隨著科技的發(fā)展，新疫苗不斷地被研究和開(kāi)發(fā)，目前各個(gè)國(guó)家納人計(jì)劃免疫的疫苗種類也日益增多，中國(guó)自2008年開(kāi)始，將免疫規(guī)劃由原來(lái)的5苗防7病擴(kuò)大為14苗防15病。疫苗種類增多所帶來(lái)的兒童接種次數(shù)增加和疫苗管理負(fù)荷增加等，使得研制聯(lián)合疫苗勢(shì)在必行。目前國(guó)外的很多疫苗供應(yīng)商和一些國(guó)內(nèi)的疫苗企業(yè)都在致力于開(kāi)發(fā)聯(lián)合疫苗，其中以DTaP為基礎(chǔ)的聯(lián)合疫苗又是當(dāng)前開(kāi)發(fā)的重點(diǎn)。
[0007]使用Hib疫苗是控制Hib侵襲性疾病的有效措施。Hib疫苗具有較好的免疫原性，接種后可產(chǎn)生良好的免疫應(yīng)答，可誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生有效的保護(hù)性殺菌抗體。
[0008]預(yù)防白喉、破傷風(fēng)和百日咳三種疾病的DTaP疫苗在中國(guó)嬰幼兒免疫接種中已廣泛使用，預(yù)防嬰幼兒腦膜炎和肺炎等疾病的Hib結(jié)合疫苗已經(jīng)研制成功并被納入地方擴(kuò)大免疫規(guī)劃中，這兩種疫苗免疫程序相同，目前國(guó)外已有DTaP-Hib聯(lián)合疫苗商品問(wèn)世，但國(guó)內(nèi)尚未研制成功DTaP-Hib聯(lián)合疫苗。
[0009]目前研制的Hib結(jié)合疫苗是安全有效的，在接種3劑后，90%_99%的兒童會(huì)產(chǎn)生抗體。因此，WHO建議將Hib疫苗納入嬰幼兒常規(guī)免疫規(guī)劃。另外，該疫苗與無(wú)細(xì)胞百白破疫苗(DTaP)具有相同的免疫程序，因此，研制無(wú)細(xì)胞百白破B型流感嗜血桿菌聯(lián)合疫苗(DTaP/Hib)具有重大意義。聯(lián)合疫苗開(kāi)發(fā)的目的是在減少疫苗注射次數(shù)的同時(shí)預(yù)防更多種類的疾病。其意義不僅可以提高疫苗覆蓋率和接種率、減少多次注射給嬰兒和父母所帶來(lái)身體和心理的痛苦、減少疫苗管理上的困難、降低接種和管理費(fèi)用;還可減少疫苗生產(chǎn)中必含的防腐劑及佐劑等劑量，減低疫苗的不良反應(yīng)等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明的目的是提供一種B型流感嗜血桿菌莢膜多糖的制備方法及聯(lián)合疫苗。
[0011]為達(dá)上述目的，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中提供了一種B型流感嗜血桿菌莢膜多糖的制備方法，包括以下步驟:
[0012](I)發(fā)酵培養(yǎng):將B型流感嗜血桿菌接種到發(fā)酵罐中發(fā)酵，并于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的后期或靜止期的前期終止培養(yǎng)，獲得培養(yǎng)液；
[0013](2)滅菌沉淀:將培養(yǎng)液滅菌后高速離心，收集上清液，并在上清液中加入十六烷基三甲基溴化銨充分混勻，然后靜置再離心，收集沉淀物；
[0014](3)多糖提取和純化
[0015]在B型流感嗜血桿菌的沉淀物中加入氯化鈉溶液中解離，解離后離心收集上清液；上清液先進(jìn)行超濾濃縮，濃縮后加入乙醇至乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%，低溫靜置后離心去除沉淀，然后離心液中加入無(wú)水乙醇至乙醇含量為85%，低溫靜置后離心，收集沉淀并使用無(wú)水乙醇和丙酮洗滌，然后在沉淀中加入水溶解，溶解液再次離心，并將離心液進(jìn)行透析處理；濃縮得到粗制多糖；
[0016]將粗制多糖溶于飽和醋酸鈉溶液中，加入冷酚溶液抽提數(shù)次;然后攪拌離心收集上清液，并通過(guò)超濾或者透析脫酚，再加入乙醇至終濃度為60%?80%，離心后收集沉淀物，沉淀物使用無(wú)水乙醇和丙酮洗滌，然后真空干燥得到精制多糖；
[0017](4)多糖衍生
[0018]將精制多糖溶于蒸餾水中調(diào)節(jié)pH值至10.5?11，溫度20 °C?26 °C下活化，然后加入酸液至PH為9，然后加入己二酸二酰肼ADH反應(yīng)，反應(yīng)完畢后調(diào)節(jié)pH值至弱堿性攪拌12h以上，然后透析、過(guò)濾、干燥;得到多糖衍生品；
[0019](5)多糖蛋白結(jié)合物的制備
[0020]將多糖衍生品與載體蛋白混合后調(diào)節(jié)pH值至5.5?5.9，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺EDC于2°C?8°C反應(yīng)，反應(yīng)完畢后調(diào)節(jié)pH值至6.7?7.1透析，透析液經(jīng)過(guò)柱層析純化、濃縮后使用超濾膜除菌，得到B型流感嗜血桿菌莢膜多糖。
[0021 ]優(yōu)選的，步驟(I)中用發(fā)酵罐培養(yǎng)菌液，接種初濃度A600 = 0.18，培養(yǎng)pH為7.5，培養(yǎng)溫度為36°C，培養(yǎng)時(shí)間為1h?15h;收獲細(xì)菌濃度A600 2 4.0。
[0022]優(yōu)選的，步驟(2)中十六燒基三甲基溴化錢的終濃度體積分?jǐn)?shù)為0.1%。
[0023]優(yōu)選的，步驟(3)中氯化鈉加入后沉淀物多糖的終濃度為10mg/ml。
[0024]優(yōu)選的，步驟(3)中加入乙醇至乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%，在4°C下靜置12h以上后離心去除沉淀。
[0025]優(yōu)選的，步驟(4)中己二酸二酰肼ADH的加入量為精制多糖的3倍?4倍。
[0026]優(yōu)選的，步驟(4)精制多糖的含量為10mg/10ml。
[0027]優(yōu)選的，步驟(5)中載體蛋白為破傷風(fēng)類毒素蛋白。
[0028]本發(fā)明的另一個(gè)目的是公開(kāi)一種含有B型流感嗜血桿菌莢膜多糖的聯(lián)合疫苗，聯(lián)合疫苗中包括B型流感嗜血桿菌莢膜多糖、無(wú)細(xì)胞百日咳疫苗、白喉類毒素疫苗和破傷風(fēng)類毒素疫苗。
[0029]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供該疫苗的制備方法，包括將無(wú)細(xì)胞百日咳原液、精制白喉類毒素、精制破傷風(fēng)類毒素加入氫氧化鋁吸附后再加入B型流感嗜血桿菌莢膜多糖原液，然后使用生理鹽水稀釋，加入硫柳汞調(diào)節(jié)PH值至5.8，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺EDC反應(yīng)I小時(shí);再調(diào)節(jié)pH至7.0，然后降溫至4°C，最后透析、超濾濃縮后除菌，于4°C保存。
[0030]綜上所述，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn):
[0031]本發(fā)明公開(kāi)的制備方法，對(duì)現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，可以獲得高純度、低雜質(zhì)的B型流感嗜血桿菌莢膜多糖，同時(shí)本發(fā)明通過(guò)與多組分疫苗組合形成多價(jià)疫苗，可以同時(shí)對(duì)多種疾病進(jìn)行免疫，減少接種次數(shù)，降低醫(yī)療風(fēng)險(xiǎn)，可以一次接種獲得更好的免疫效果。
【具體實(shí)施方式】
[0032]實(shí)施例1
[0033]—種B型流感嗜血桿菌莢膜多糖的制備方法，包括以下步驟:
[0034](I)建立B型流感嗜血桿菌種子批菌種
[0035]采用B型流感嗜血桿菌CMCC58547或CMCC58534菌株，來(lái)源于中國(guó)藥品生物制品檢定所。主種子批啟開(kāi)后傳代次數(shù)不超過(guò)5代，工作種子批啟開(kāi)后至接種發(fā)酵罐培養(yǎng)傳代次數(shù)不得超過(guò)5代。
[0036](2)制備生產(chǎn)用種子
[0037]啟開(kāi)工作種子批菌種，接種在液體或固體Hib綜合培養(yǎng)基上，制備數(shù)量適宜的生產(chǎn)用種子。
[0038](3)制備生產(chǎn)用培養(yǎng)基
[0039]采用Hib綜合培養(yǎng)基，不得含有對(duì)人體有害或其他過(guò)敏原物質(zhì)。
[0040](3)發(fā)酵培養(yǎng):用300升發(fā)酵罐培養(yǎng)10L菌液，接種初濃度A600 = 0.18，培養(yǎng)pH為7.5、培養(yǎng)溫度為36 0C，培養(yǎng)10?15小時(shí)，收獲細(xì)菌濃度A600 >4.00在培養(yǎng)過(guò)程中取樣進(jìn)行純菌試驗(yàn)、涂片革蘭氏染色鏡檢，如發(fā)現(xiàn)污染雜菌，應(yīng)廢棄。
[0041](4)滅菌沉淀:當(dāng)細(xì)菌處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的后期或靜止期的前期終止培養(yǎng)，取樣進(jìn)行菌液濃度測(cè)定及純菌檢查，然后于培養(yǎng)物中加入適宜濃度的甲醛溶液或脫氧膽酸鈉溶液殺菌，以確保殺菌完全及不損傷Hib莢膜多糖為宜。培養(yǎng)液滅菌后高速離心，收集上清液，并在上清液中加入十六烷基三甲基溴化銨CTAB至終含量為0.1 %充分混勻，然后靜置再離心，收集沉淀物。
[0042](5)多糖提取和純化
[0043]在B型流感嗜血桿菌的沉淀物中加入0.6mol/L的氯化鈉溶液中使沉淀物濃度達(dá)到10mg/ml后解離，解離后在轉(zhuǎn)速6500r/min下離心30min收集上清液;上清液先進(jìn)行超濾濃縮，濃縮后加入乙醇至乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%沉淀，4°C下靜置14h后離心15min去除沉淀，然后離心液中加入無(wú)水乙醇至乙醇含量為85%，4°C靜置3h后離心，收集沉淀并使用無(wú)水乙醇和丙酮洗滌，然后在沉淀中加入水溶解，溶解液再次離心，并將離心液進(jìn)行透析處理;濃縮得到粗制多糖。
[0044]將粗制多糖溶于飽和醋酸鈉溶液中，采用酚提法，加入冷酚溶液抽提數(shù)次。然后攪拌離心收集上清液，