一種利用木糖生產(chǎn)乙醇酸的重組菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種利用木糖生產(chǎn)乙醇酸的重組菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用，屬于基因工 程技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 有機(jī)酸是目前市場(chǎng)需要非常大的一類化合物，每年生產(chǎn)的有機(jī)酸約數(shù)百萬(wàn)噸，應(yīng) 用于食品、醫(yī)藥、化妝品、化工等眾多領(lǐng)域。同時(shí)有機(jī)酸也是利用代謝改造微生物合成的一 類重要的生物基產(chǎn)品。乙醇酸是一種最簡(jiǎn)單的羥基酸，在眾多領(lǐng)域中都有重要的使用價(jià) 值，例如在化妝品行業(yè)：乙醇酸可以有效保護(hù)皮膚的柔韌性，提高皮膚的抗病性；乙醇酸復(fù) 合金屬離子后能夠作為一種去污清潔劑；乙醇酸的單聚體或者與其他有機(jī)酸的多聚體可以 作為性能良好的塑料，具有廣泛的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。
[0003]目前乙醇酸的化學(xué)合成法主要通過(guò)高溫高壓條件下甲醛羧化形成，生物法主要通 過(guò)轉(zhuǎn)化乙二醇或者乙醛酸形成乙醇酸?；瘜W(xué)合成的條件嚴(yán)苛，耗能大，污染嚴(yán)重，而生物法 合成由于污染小、原料可再生等優(yōu)勢(shì)越來(lái)越受到重視。目前微生物法利用的碳源主要是植 物衍生的糖類和淀粉，然而木質(zhì)纖維素原料的應(yīng)用也是人們普遍重視的、未來(lái)生物技術(shù)的 重要研究方向。木質(zhì)纖維素的主要組成成分為D-葡萄糖和D-木糖，D-葡萄糖能夠被多數(shù)微 生物代謝形成目標(biāo)產(chǎn)品，而D-木糖的利用范圍相對(duì)較小，僅有少數(shù)微生物能夠代謝，鑒于此 原因，代謝工程改造仍然集中于以葡萄糖為底物的生物合成途徑的研究。D-木糖作為木質(zhì) 纖維素的重要成分，來(lái)源廣泛、成本低，以D-木糖作為底物，生物法合成乙醇酸的研究具有 重要的科學(xué)和應(yīng)用價(jià)值。但是現(xiàn)有技術(shù)中尚沒(méi)有以木糖為底物，利用該途徑成功合成乙醇 酸的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為實(shí)現(xiàn)利用生物法以木糖為原料合成乙醇酸，本發(fā)明提供了一種利用木糖生產(chǎn)乙 醇酸的重組菌，所采取的技術(shù)方案如下：
[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種利用木糖生產(chǎn)乙醇酸的重組菌，該重組菌過(guò)表達(dá)木糖 脫氫酶基因，木糖酸內(nèi)酯酶基因，木糖酸脫水酶基因，3-脫氧-D-甘油戊酮糖酸醛縮酶基因 和乙醇醛脫氫酶基因。
[0006] 優(yōu)選地，所述木糖脫氫酶基因，為來(lái)源于新月丙桿菌(Caulobacter crescentus) 的木糖脫氫酶基因 xdh;所述木糖酸內(nèi)酯酶基因，為來(lái)源于新月丙桿菌（Caulobacter crescentus)的木糖酸內(nèi)酯酶基因 xy 1C;所述木糖酸脫水酶基因，為來(lái)源于大腸桿菌 (Escherichia coli)的木糖酸脫水酶基因 yjhG;所述3-脫氧-D-甘油戊酮糖酸醛縮酶基因， 為來(lái)源于大腸桿菌(Escherichia coli)的3-脫氧-D-甘油戊酮糖酸醛縮酶基因 yjhH;所述 乙醛酸脫氫酶基因，為來(lái)源于大腸桿菌(Escherichia coli)的乙醇醛脫氫酶基因 aldA。
[0007] 本發(fā)明的另一目的是提供一種所述重組菌的構(gòu)建方法，該方法的步驟如下：
[0008] 1)克隆獲得木糖脫氫酶基因 xdh，木糖酸內(nèi)酯酶基因 xy 1C，木糖酸脫水酶基因 y jhG，3-脫氧-D-甘油戊酮糖酸醛縮酶基因 y jhH，乙醇醛脫氫酶基因 aldA;
[0009] 2)將步驟1)所得的木糖脫氫酶基因 xdh，木糖酸內(nèi)酯酶基因 xylC和3-脫氧-D-甘油 戊酮糖酸醛縮酶基因 yjhH連接到質(zhì)粒載體，獲得重組質(zhì)粒I;
[0010] 3)將步驟1)所得的木糖酸脫水酶基因 yjhG和乙醇醛脫氫酶基因 aldA連接到質(zhì)粒 載體上，獲得重組質(zhì)粒II;
[0011] 4)將步驟2)和步驟3)所得的重組質(zhì)粒導(dǎo)入到宿主細(xì)胞，獲得重組菌。
[00?2] 優(yōu)選地，步驟2)所述質(zhì)粒載體，為質(zhì)粒pETDuet-Ι。
[00?3] 優(yōu)選地，步驟3)所述質(zhì)粒載體，為質(zhì)粒pACY⑶uet-Ι。
[0014]優(yōu)選地，步驟4)所述宿主細(xì)胞，為大腸桿菌BL21(DE3)。
[0015]所述方法的具體步驟如下：
[0016] 1)以新月柄桿菌的基因組DNA為模板，設(shè)計(jì)引物分別克隆木糖脫氫酶基因 xdh，木 糖酸內(nèi)酯酶基因 xylC;以大腸桿菌MG1655基因組DNA為模板，設(shè)計(jì)引物分別克隆木糖酸脫水 酶基因 yjhG，3-脫氧-D-甘油戊酮糖酸醛縮酶基因 yjhH和乙醇醛脫氫酶基因 aldA;
[0017] 2)將步驟1)所得的脫氫酶基因 xdh，木糖酸內(nèi)酯酶基因 xylC和3-脫氧-D-甘油戊酮 糖酸醛縮酶基因 yjhH連接到質(zhì)粒pETDuet-Ι上，獲得重組質(zhì)粒pETDuet-1-yjhH-xdh-xylC;
[0018] 3)將步驟1)木糖酸脫水酶基因 yjhG和乙醇醛脫氫酶基因 aldA連接到質(zhì)粒 pACYCDuet-Ι 上，獲得重組質(zhì)粒 pACYCDuet-1-aldA-y jhG;
[0019] 4)將步驟2)所得的重組質(zhì)粒pETDuet-1-yjhH-xdh-xylC，將步驟3)獲得重組質(zhì)粒 pACYCDuet-1-aldA-yjhG同時(shí)導(dǎo)入受體細(xì)胞E.coli BL21(DE3)，獲得重組菌。
[0020] 優(yōu)選地，所述方法步驟1)中所述木糖脫氫酶基因 xdh的Gene ID為7329904;所述木 糖酸內(nèi)酯酶基因 xylC的Gene ID為7329903;所述木糖酸脫水酶基因 yjhG的Gene ID為 946829;所述3-脫氧-D-甘油戊酮糖酸醛縮酶基因 yjhH的Gene ID為948825;所述乙醇醛脫 氫酶基因 aldA的Gene ID為945672。
[0021] 優(yōu)選地，所述方法步驟1)中克隆木糖脫氫酶基因 xdh所用引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1-SEQ ID N0.2所示;克隆木糖酸內(nèi)酯酶基因 xylC所用引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3-SEQ ID NO. 4所示；克隆木糖酸脫水酶基因 yjhG所用引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.6所示；克隆3-脫氧-D-甘油戊酮糖酸醛縮酶基因 yjhH所用引物的核苷酸 序列如SEQ ID NO.7-SEQ ID N0.8所示；克隆乙醇醛脫氫酶基因 aldA所用引物的核苷酸序 列如SEQIDN0·9-SEQIDN0·10所示。
[0022]所述重組菌在發(fā)酵生產(chǎn)乙醇酸中的應(yīng)用在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0023]所述應(yīng)用的步驟如下：
[0024] 1)活化權(quán)利要求1或2所述的重組菌，獲得活化重組菌；
[0025] 2)將步驟1)所得的活化重組菌接種到含有氨芐青霉素和氯霉素的M9液體培養(yǎng)基 中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。
[0026]優(yōu)選地，所述應(yīng)用中步驟2)所述發(fā)酵培養(yǎng)，是按1 %的接種量接種，在37°C，180rpm 的條件下培養(yǎng)至〇D6〇〇達(dá)到1.0時(shí)，加入100μΜ異丙基硫代半乳糖苷（IPTG)誘導(dǎo)，誘導(dǎo)后置于 30°C，180rpm的條件下繼續(xù)培養(yǎng)48h后終止發(fā)酵。
[0027]所述重組載體導(dǎo)入宿主菌的方法采用熱激轉(zhuǎn)化法。
[0028]本發(fā)明獲得的有益效果是：
[0029] 本發(fā)明以大腸桿菌這種模式菌株為宿主菌，實(shí)現(xiàn)了以D-木糖為底物，合成得到乙 醇酸，為D-木糖的生物利用以及乙醇酸的微生物合成提供了新的技術(shù)方法。
[0030] 本發(fā)明通過(guò)在大腸桿菌中過(guò)表達(dá)新月丙桿菌的木糖脫氫酶基因 xdh和木糖酸內(nèi)酯 酶基因 xylC;同時(shí)過(guò)表達(dá)大腸桿菌MG1655的木糖酸脫水酶基因 yjhG，3-脫氧-D-甘油戊酮糖 酸醛縮酶基因 yjhH和乙醇醛脫氫酶基因 aldA，首次實(shí)現(xiàn)以D-木糖為碳源，經(jīng)乙醇醛轉(zhuǎn)化形 成乙醇酸的生物合成路徑。
[0031] 定義和縮寫(xiě)
[0032] 在本發(fā)明中使用下列的縮寫(xiě)或簡(jiǎn)稱：
[0033]木糖脫氫酶基因 ：xdh
[0034] 木糖酸內(nèi)酯酶基因 ：xylC
[0035] 木糖酸脫水酶基因 :yjhG
[0036] 3-脫氧-D-甘油戊酮糖酸醛縮酶基因 :yjhH
[0037] 乙醇醛脫氫酶基因 ：aldA
[0038] 大腸埃希氏桿菌(Escherichia coli) :Ε·coli
[0039] 新月丙桿菌（Caulobacter crescentus) :C.crescentus
[0040] "熱激轉(zhuǎn)化"或"熱轉(zhuǎn)化"指分子生物學(xué)中轉(zhuǎn)染技術(shù)的一種，用來(lái)將外來(lái)基因整合到 宿主基因中并穩(wěn)定表達(dá)，其利用受到熱激后，細(xì)胞膜出現(xiàn)裂隙，將外來(lái)基因?qū)胨拗骰蚧?將外來(lái)質(zhì)粒導(dǎo)入宿主原生質(zhì)體，又熱激轉(zhuǎn)化或熱轉(zhuǎn)化等。
[0041] "過(guò)量表達(dá)"或"過(guò)表達(dá)"指特定的基因在生物體中大量表達(dá)，表達(dá)量超過(guò)正常水平 (即，野生型表達(dá)水平），可以通過(guò)增強(qiáng)內(nèi)源表達(dá)或引入外源基因來(lái)實(shí)現(xiàn)。
【附圖說(shuō)明】
[0042]圖1為利用木糖合成乙醇酸的代謝途徑示意圖。
[0043] 圖2為重組大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)物的高效液相色譜檢測(cè)；
[0044] (圖中，A為標(biāo)準(zhǔn)品;B為實(shí)驗(yàn)組檢測(cè)發(fā)酵產(chǎn)物;其中箭頭所指的色譜峰為乙醇酸）。
【具體實(shí)施方式】
[0045]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明不受實(shí)施例的限制。
[0046]以下實(shí)施例中所用材料、試劑、儀器和方法，未經(jīng)特殊說(shuō)明，均為本領(lǐng)域中的常規(guī) 材料、試劑、儀器和方法，均可通過(guò)商業(yè)渠道獲得。
[0047]所用酶試劑購(gòu)自MBI Fermentas公司，提取質(zhì)粒所用的試劑盒和回收DNA片段所用 的試劑盒購(gòu)自美國(guó)OMEGA公司，相應(yīng)的操作步驟按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行;所有培養(yǎng)基如無(wú)特別 說(shuō)明均用去離子水配制。
[0048]培養(yǎng)基配方：
[0049] 1)種子液搖瓶培養(yǎng)基
[0050] LB培養(yǎng)基:5g/L酵母粉，10g/L NaCl，10g/L蛋白胨，其余為水，121°C，20min滅菌。 [00511 2)發(fā)酵生產(chǎn)搖瓶培養(yǎng)基
[0052] ]?9培養(yǎng)基：1(^/1〇171〇86，148/11(2冊(cè)04.3!12〇,5.2 8/11012?〇4，1區(qū)/1恥(：1，18/1 NH4CI,0.25g/L MgS〇4 · 7H2〇,0.2g/L yeast extract,20g/L glucose.
[0053]在實(shí)際培養(yǎng)過(guò)程中，可向上述培養(yǎng)基中添加一定濃度的抗生素以維持質(zhì)粒的穩(wěn)定 性，如l〇〇mg/L的氨節(jié)青霉素和50mg/L的氯霉素。
[0054]實(shí)施例1外源基因的克隆
[0055] 木糖脫氫酶基因：（xdh)(Gene ID:7329904)的克隆是以C.crescentus為模板，通 過(guò)PCR擴(kuò)增獲得，引物序列為：xdh-F 5'-GGGAATTCCATATGTCCTCAGCCATCTATCCC-3'，xdh-R 5 ' -CGGGGTACCTCAACGCCAGCCGGCGTCGAT-3 ' ；木糖酸內(nèi)酯酶基因 （xy