抗酸表達盒及其篩選方法
【技術(shù)領域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程與合成生物學領域。具體地說，本發(fā)明涉及大腸桿菌的抗酸 表達盒和工業(yè)微生物抗酸表達盒高通量篩選的逐級評估方法，可用于提高工業(yè)微生物在工 業(yè)條件下的抗酸和發(fā)酵生產(chǎn)性能。
【背景技術(shù)】
[0002] 我國的有機酸發(fā)酵產(chǎn)業(yè)是生物產(chǎn)業(yè)的重要部分，近年來發(fā)展迅速，然而在生產(chǎn)的 經(jīng)濟性、環(huán)保性等方面尚存在諸多亟待解決的問題。
[0003] 工業(yè)微生物在發(fā)酵過程中會逐漸積累大量的酸性產(chǎn)物或副產(chǎn)物，不斷酸化發(fā)酵環(huán) 境，而酸性環(huán)境下工業(yè)微生物的生長和代謝會受到嚴重抑制，生產(chǎn)能力下降。因此實際工業(yè) 發(fā)酵過程（如氨基酸發(fā)酵）會使用大量的堿（如液氨）來中和發(fā)酵產(chǎn)生的酸性物質(zhì)，維持 中性發(fā)酵。為獲得酸性物質(zhì)的產(chǎn)品，還需在中性發(fā)酵后使用大量的酸，酸堿的大量使用會產(chǎn) 生大量的工業(yè)廢水。如果能提高工業(yè)微生物的抗酸能力，利用抗酸的工業(yè)微生物在酸性條 件發(fā)酵，就能有效地減少發(fā)酵過程的酸堿使用量，減少廢水排放，同時抑制雜菌污染和降低 相關(guān)的能耗，產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟效益，促進節(jié)能減排。
[0004] 國內(nèi)外對微生物抗脅迫研究，如抗酸、抗高溫、抗高滲透壓等，主要有傳統(tǒng)誘變、馴 化、簡單的基因克隆和敲除等，但這些方法的產(chǎn)業(yè)化效率較低。近年來，國內(nèi)外也開發(fā)了一 些新的基于調(diào)控基因的方法用于提高微生物的抗脅迫性能，如全局轉(zhuǎn)錄機器gTME、人工轉(zhuǎn) 錄因子、全局調(diào)控因子工程等，拓展了微生物抗脅迫改造的技術(shù)方法和思路[1]。
[0005] 近年來，合成生物學在概念理論、功能應用和方法技術(shù)方面都取得了顯著的進展。 在已知抗脅迫相關(guān)結(jié)構(gòu)基因和調(diào)控基因的基礎上，可利用合成生物學方法對其進行人工修 飾和集成，從而設計標準化的抗脅迫元表達盒，賦予微生物高效的抗脅迫性能，用于工業(yè)微 生物的實際生產(chǎn)。
[0006] 大腸桿菌主要有三類抗酸（Acid Resistence，AR)機制[2]。其中，第二類抗酸 系統(tǒng)（AR2)是非常重要且機理比較清楚的系統(tǒng)。第二類抗酸系統(tǒng)（AR2)由谷氨酰胺酶 YbaS[3]、谷氨酸脫羧酶GadA和GadB[4]、谷氨酸和γ-氨基丁酸（GABA)反向轉(zhuǎn)運蛋白 GadC[5]組成。這個系統(tǒng)的YbaS將谷氨酰胺轉(zhuǎn)化為谷氨酸，釋放出NH3中和胞內(nèi)質(zhì)子；GadA 和GadB使谷氨酸發(fā)生脫羧反應生成γ -氨基丁酸并消耗胞內(nèi)質(zhì)子；GadC攝入谷氨酰胺和 谷氨酸，排出谷氨酸和氨基丁酸。
[0007] EvgA是二組份信號傳導體系EvgAS的響應調(diào)控蛋白，也是大腸桿菌重要的中層 (middle-level)調(diào)控因子，能夠調(diào)控下游結(jié)構(gòu)基因和調(diào)控基因的表達，受其調(diào)控基因包括 多種抗酸相關(guān)基因，如第二類抗酸系統(tǒng)的gadB、gadC以及調(diào)控gadB、gadC表達的局部調(diào)控 因子ydeO和gadX等[6]。在大腸桿菌中過表達evgA基因能提高大腸桿菌的抗酸沖擊存活 率[7]。
[0008] 雖然目前大腸桿菌抗酸系統(tǒng)基因的機理研究比較詳細，但是目前沒有利用上述基 因結(jié)合人工啟動子開發(fā)標準化的合成生物學抗酸表達盒的研究，沒有高通量篩選并逐級評 估抗酸表達盒的抗酸性能和對發(fā)酵生產(chǎn)性能影響的方法。
[0009] 發(fā)明概述
[0010] 在第一方面，本發(fā)明提供了一種表達盒，其由一或多個啟動子、一或多個抗酸基因 和一或多個終止子組成，所述抗酸基因選自evgA基因、ybaS基因、gadB基因和gadC基因。 本發(fā)明的表達盒，在被導入至宿主細胞后能夠提高宿主細胞的抗酸性。
[0011] 在一些實施方式中，本發(fā)明的表達盒中的evgA基因編碼SEQ ID N0 :68所示的氨 基酸序列。在一些實施方式中，本發(fā)明的表達盒中的ybaS基因編碼SEQ ID N0 :71所示的 氨基酸序列。在一些實施方式中，本發(fā)明的表達盒中的gadB基因編碼SEQ ID NO :73、SEQ ID NO :74、SEQ ID NO :75、SEQ ID NO :76 或 SEQ ID NO :77 所示的氨基酸序列。在一些實 施方式中，本發(fā)明的表達盒中的gadC基因編碼SEQ ID NO :78所示的氨基酸序列。
[0012] 在一些實施方式中，本發(fā)明的表達盒中的啟動子選自SEQ ID NO :1-10所示的啟動 子、evgA基因啟動子、ybaS基因啟動子和gadB基因啟動子。在一些實施方式中，evgA基因 啟動子的核苷酸序列如SEQ ID N0 :67所示。在一些實施方式中，ybaS基因啟動子的核苷 酸序列如SEQ ID N0 :70所示。在一些實施方式中，gadB基因啟動子的核苷酸序列如SEQ ID N0 :72 所示。
[0013] 在一些實施方式中，本發(fā)明的表達盒中的終止子為rrnBT終止子。在一些實施方 式中，其中rrnBT終止子的核苷酸序列示于SEQ ID N0:69。
[0014] 在本發(fā)明一些實施方式中，所述表達盒從5'到3'由選自SEQ ID NO :1-10和evgA 基因啟動子的啟動子，evgA基因，以及rrnBT終止子組成。在一些具體的實施方式中，所述 表達盒的核苷酸序列如SEQ ID NO :26-36任一所示。在一些優(yōu)選的實施方式中，所述表達 盒的核苷酸序列為SEQ ID N0:34、35。
[0015] 在本發(fā)明另外一些實施方式中，所述表達盒由兩部分組成，第一部分從5'到3'包 含ybaS基因啟動子、ybaS基因和rrnBT終止子，第二部分從5'到3'包含gadB基因啟動 子、gadB基因、gadC基因和rrnBT終止子。在一些具體的實施方式中，所述表達盒的核苷酸 序列如SEQ ID NO :55-59任一所示。在一些優(yōu)選的實施方式中，所述表達盒的核苷酸序列 為 SEQ ID N0 :58、59。
[0016] 在本發(fā)明另外一些實施方式中，所述表達盒由三部分組成，第一部分從5'到3'包 含ybaS基因啟動子、ybaS基因和rrnBT終止子，第二部分從5'到3'包含gadB基因啟動 子、gadB基因、gadC基因和rrnBT終止子，第三部分從5'到3'包含選自SEQ ID NO :1-10 和evgA基因啟動子的啟動子、evgA基因和rrnBT終止子。在一些具體的實施方式中，所述 表達盒的核苷酸序列如SEQ ID NO :62-66任一所示。在一些優(yōu)選的實施方式中，所述表達 盒的核苷酸序列為SEQ ID N0 :62。
[0017] 在第二方面，本發(fā)明提供了表達構(gòu)建體，其包含本發(fā)明的表達盒。
[0018] 在第三方面，本發(fā)明提供了重組宿主細胞，其包含本發(fā)明的表達盒或本發(fā)明的表 達構(gòu)建體。所述重組宿主細胞優(yōu)選是原核生物細胞，更優(yōu)選細菌細胞，最優(yōu)選大腸桿菌細 胞。本發(fā)明的重組宿主細胞，與相應的不含所述表達盒或表達構(gòu)建體的細胞相比，其抗酸性 被提高。所述抗酸性能包括在酸沖擊下的存活率和在酸壓力條件下的生長率。
[0019] 在第四方面，本發(fā)明提供了通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)有機酸的方法，所述方法包括：
[0020] (a)將本發(fā)明的表達盒或表達構(gòu)建體導入產(chǎn)有機酸微生物；
[0021] (b)對所述微生物進行發(fā)酵；和
[0022] (c)收獲所產(chǎn)生的有機酸。
[0023] 本發(fā)明的通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)有機酸的方法中使用的產(chǎn)有機酸微生物優(yōu)選原核 微生物，更優(yōu)選細菌，最優(yōu)選大腸桿菌?？梢酝ㄟ^本發(fā)明的方法產(chǎn)生的有機酸包括氨基酸 (例如賴氨酸、蘇氨酸、色氨酸、谷氨酸）、丁二酸、檸檬酸和乳酸。
[0024] 在第五方面，本發(fā)明還提供了高通量篩選用于微生物發(fā)酵的抗脅迫表達盒的方 法，所述方法包括以下步驟：
[0025] (a)將待篩選的表達盒導入到所述微生物；
[0026] (b)在脅迫沖擊下高通量評估所述微生物的存活率；
[0027] (c)用高通量生長測試儀如BioscreenC評估所述微生物在脅迫壓力環(huán)境下的生 長率；
[0028] (d)用高通量微型發(fā)酵儀器如BioLector評估所述微生物在脅迫壓力環(huán)境下的發(fā) 酵性能；
[0029] (e)將能夠提高所述微生物的所述存活率和/或所述生長率和/或所述發(fā)酵性能 的表達盒鑒定為可以用于微生物發(fā)酵的抗脅迫表達盒。
【附圖說明】
[0030] 圖 1.示出 pNatevgA-rrnBT 抗酸表達盒表達質(zhì)粒 pACYC184-pNatevgA_rrnBT 的構(gòu) 建。
[0031] 圖2.示出pQevgA-rrnBT抗酸表達盒中間表達質(zhì)粒pBR322-pQevgA_rrnBT的構(gòu) 建。
[0032] 圖3.示出pQevgA-rrnBT抗酸表達盒表達質(zhì)粒pACYC184-pQevgA_rrnBT的構(gòu)建。
[0033] 圖4.示出對照質(zhì)粒pACYC184-rrnBT的構(gòu)建。
[0034] 圖5.示出ybaS-gadB-gadC三基因抗酸表達盒的中間克隆載體pACYC184_Hind III-pNatevgA-Xho I-rrnBT-BamH I 的構(gòu)建。
[0035] 圖6.示出ybaS-gadB-gadC三基因抗酸表達盒的中間克隆質(zhì)粒 pBR322-gadB-gadC47〇-r;rnBT 的構(gòu)建。
[0036] 圖7.示出ybaS-gadB-gadC三基因抗酸表達盒的中間克隆質(zhì)粒 pBR322-gadB (H465A/dHT/H465A&E89Q/dHT&E89Q) -gadC470-rrnBT 的構(gòu)建。
[0037] 圖8.示出ybaS-gadB-gadC三基因抗酸表達盒表達質(zhì)粒pACYC184-ybaS_rrnBT-g adB-gadC47〇-r;rnBT 的構(gòu)建。
[0038] 圖9.示出ybaS-gadB-gadC-evgA四基因抗酸表達盒表達質(zhì)粒pACYC184-ybaS-rr nBT-gadB-gadC47〇-rrnBT-pSevgA-rrnBT 的構(gòu)建。
[0039] 圖10.示出evgA抗酸表達盒在酸壓力沖擊的存活結(jié)果。
[0040] 圖11.示出ybaS-gadB-gadC三基因抗酸表達盒在酸壓力沖擊的存活結(jié)果。
[0041] 圖12.示出ybaS-gadB-gadC-evgA四基因抗酸表達盒在酸壓力沖擊的存活結(jié)果。
[0042] 圖13.示出evgA抗酸表達盒在酸壓力生長測試的結(jié)果。
[0043] 圖14.示出ybaS-gadB-gadC三基因抗酸表達盒在酸壓力生長測試的結(jié)果。
[0044] 圖15.示出ybaS-gadB-gadC-evgA四基因抗酸表達盒在酸壓力生長測試的結(jié)果。
[0045] 發(fā)明詳述
[0046] 本發(fā)明提供了由一或多個啟動子、一或多個抗酸基因和一或多個終止子組成的表 達盒。所述表達盒在宿主細胞中能夠表達其中的抗酸基因，從而提高宿主細胞的抗酸性，如 酸沖擊存活率、酸壓力環(huán)境的生長率和酸壓力環(huán)境下的發(fā)酵性能。
[0047] 在本發(fā)明的表達盒中，啟動子、抗酸基因和終止子可操縱地連接以實現(xiàn)希望的抗 酸基因的轉(zhuǎn)錄及最終在宿主細胞中表達所述抗酸基因編碼的抗酸蛋白。
[0048] 如本文所用，"抗酸基因"指的是編碼大腸桿菌的抗酸蛋白或其功能性變體的基 因，例如編碼抗酸調(diào)控蛋白的基因如evgA、ydeO和gadX等，以及編碼抗酸結(jié)構(gòu)蛋白的基因， 包括大腸桿菌的第二類抗酸系統(tǒng)（AR2)的抗酸結(jié)構(gòu)蛋白基因 ybaS、gadB、gadC等[6]。編 碼大腸桿菌其它抗酸蛋白的基因也可用于本發(fā)明的表達盒中。如本文所用，抗酸蛋白的"功 能性變體"指的是野生型抗酸蛋白通過取代、缺失、添加一或多個氨基酸所獲得的變體，條 件是其活性得以保留。
[0049] 在一些實施方式中，本發(fā)明的表達盒中的抗酸基因是大腸桿菌的抗酸調(diào)控基因 evgA。在一【具體實施方式】中，evgA基因編碼SEQ ID N0:68所示的野生型EvgA。
[0050] 在一些實施方式中，本發(fā)明的表達盒中的抗酸基因是大腸桿菌的野生型抗酸結(jié)構(gòu) 基因 ybaS。在一【具體實施方式】中，ybaS基因編碼SEQ ID N0:71所示的野生型YbaS。
[0051] 在一些實施方式中，本發(fā)明的表達盒中的抗酸基因是大腸桿菌的抗酸結(jié)構(gòu)基因 gadB。在一【具體實施方式】中，gadB基因編碼SEQ ID N0:73所示的野生型GadB。在一具體 實施方式中，gadB基因編碼SEQ ID N0:74所示的變體GadB(H465A)。在一【具體實施方式】 中，gadB基因編碼SEQ ID N0 :75所示的變體GadB (dHT) (GadB的C端末尾兩個氨基酸被去 除）。在一【具體實施方式】中，gadB基因編碼SEQ ID N0:76所示的變體GadB(H465A&E89Q)。 在一【具體實施方式】中，gadB基因編碼SEQ ID NO :77所示的變體GadB (dHT&E89Q) [10]。
[0052] 在一些實施方式中，本發(fā)明的表達盒中的抗酸基因是大腸桿菌的抗酸結(jié)構(gòu)基因 gadC。在一【具體實施方式】中，gadC基因編碼SEQ ID N0 :78所示的變體GadC470 (C端截斷， 保留1-470位氨基酸）[11]。
[0053] 上述的調(diào)控因子EvgA能夠調(diào)控多種抗酸基因，其中包括第二類抗酸系統(tǒng)的gadB、 gadC以及調(diào)控gadB、gadC表達的局部調(diào)控因子ydeO和gadX等。上述的GadB和GadC的 突變具有近中性的酸環(huán)境下活性比野生型高的特點。上述GadB的突變在pH 6.0的活性較 高，而野生型的GadB在pH 6. 0時的活性幾乎為零，野生型的GadB只有當環(huán)境pH降低至 5. 3時活性才較高[10]。上述的GadC突變GadC470相比于野生型的GadC的在pH 6. 5時 活性有大幅度提尚[11]。
[0054] 本發(fā)明的表達盒的啟動子包括序列示于SEQ ID N0 :67的evgA基因天然啟動子、 序列示于SEQ ID N0 :70的ybaS基因天然啟動子、序列示于SEQ ID N0 :72的gadB基因天 然啟動子、和序列分別示于SEQ ID NO :1-10的10個人工啟動子pQ、pZ、pV、pW、pN、pS、pAA、 pjj、pll、p00。上述10個人工啟動子是噬菌體的Ι\-λ組成型啟動子的人工突變后獲得的 強度由強至弱的一系列組成型啟動子[8]。本領域已知各種可以在宿主細胞中表達靶基因 的啟動子，這樣的啟動子也涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0055] 本發(fā)明的表達盒的終止子包括序列示于SEQ ID Ν0 :69的16s核糖體RNA rrnB操 縱子的終止子rrnBT [9]。本領域已知各種可以在宿主細胞中終止靶基因轉(zhuǎn)錄的終止子，這 樣的終止子也涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0056] 在一些實施方式中，本發(fā)明提供了一種利用大腸桿菌調(diào)控基因 evgA構(gòu)建的單基 因抗酸表達盒，其由啟動子、調(diào)控基因 evgA和終止子組成。在一些具體的實施方式中，使用 選自evgA的天然啟動子pNat、人工啟動子pQ、pZ、pV、pW、pN、pS、pAA、pJJ、pll、p00的啟 動子來啟動evgA表達，并使用終止子rrnBT終止evgA轉(zhuǎn)錄。在一些具體的實施方式中，本 發(fā)明的evgA單基因表達盒的核苷酸序列如SEQ ID NO :26-36任一所示。
[0057] 在另一些實施方式中，本發(fā)明提供利用大腸桿菌第二抗酸系統(tǒng)的ybaS、gadB、gadC 基因構(gòu)建的ybaS-gadB-gadC三基因抗酸表達盒。所利用的ybaS為野生型ybaS ;所利用 的gadB其中既包括野生型的gadB，也包括ga