一種重組載體及其在制備或篩選抗流感藥物中的應(yīng)用
【專利說明】
[00011 本申請是申請?zhí)枮?012100197129、發(fā)明名稱為"抑制流感病毒相關(guān)基因的siRNA 及其應(yīng)用"、申請日為2012年1月20日的專利申請的分案申請。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域,特別涉及抑制小窩蛋白2和表面活性蛋白D基因表達的 siRNA、siRNA的核苷酸序列、可編碼該siRNA的重組載體以及可編碼轉(zhuǎn)錄因子A和對氧磷酸 酶3的重組載體,以及它們各自的基因在制備和篩選抗流感藥物方面的用途。
【背景技術(shù)】
[0003] 病毒入侵宿主過程伴隨著宿主基因表達變化,最終決定感染細(xì)胞和病毒各自的命 運。病毒感染宿主后需要利用宿主細(xì)胞的代謝過程完成病毒自身的復(fù)制,在這一過程病毒 必然會調(diào)控宿主細(xì)胞內(nèi)基因組的表達,抑制抗病毒基因表達,增強對病毒復(fù)制有益的基因 表達。因此,病毒感染宿主細(xì)胞后,宿主細(xì)胞內(nèi)表達變化的這些基因往往和病毒復(fù)制有密切 的關(guān)系。通過生物學(xué)手段調(diào)控宿主細(xì)胞內(nèi)這些基因中一個或同時調(diào)控多個基因表達可能具 有抑制流感病毒復(fù)制的作用,具有潛在預(yù)防和治療流感病毒感染的應(yīng)用價值。
[0004] 流感病毒為正粘病毒科流感病毒屬分節(jié)段單股負(fù)鏈RNA病毒。病毒粒子剛分離時 呈多晶形,在體內(nèi)傳代后變成球形,直徑80-120nm(Palese,et al.,2007)。病毒粒子由0.8-1 %的RNA、70-75 %的蛋白質(zhì)、20 %的脂類和5-8 %的糖類組成,此處比例均為質(zhì)量比。
[0005] 流感病毒分為A、B、C三型,其中A型(甲型)最為重要。甲型流感病毒能引起人類、 豬、馬和各種禽類的自然感染和發(fā)病。由于其表面抗原HA和NA容易變異,已知HA有16個亞型 (H1-H16),NA有9個亞型(N1-N9),它們之間的不同組合,使甲型流感病毒有許多亞型(如 !1謂1、!12吧、!13吧、!15磯等),在豬體中主要流行!1謂1和!13吧亞型。
[0006] 不同動物有不同的流感病毒,如豬流感、人流感、馬流感,一般情況下這些流感只 感染各自的本屬動物。但是,流感病毒具有宿主種的適應(yīng)性。在不同種動物的個體之間也容 易發(fā)生傳播,形成感染多種動物的新流感病毒。另一個特點是豬這種動物比較特殊,豬對其 它動物的流感病毒也易感,這是其它動物不具有的特性。所以一旦豬同時感染了人流感、豬 流感、禽流感等,這多種病毒會在豬體內(nèi)發(fā)生重組,可能就會出來一種既能感染豬、人、禽的 流感病毒。所以狹義的豬流感不是人獸共患病。流感在人與人之間傳播范圍很有限,跟流感 的傳播途徑有關(guān)。比如2009年甲型流感,就是人流感、豬流感、禽流感共同感染豬后產(chǎn)生的 新流感病毒,最開始感染的人基本都是接觸過或跟豬關(guān)系密切的人,隨后會有更多人感染 流感病毒。人類發(fā)展史上流感病毒的大爆發(fā)都給社會經(jīng)濟發(fā)展、人的健康帶來重大危害。為 預(yù)防和治療流感,各國都投入了大量人力物力,不斷研究治療方法和藥物。近年來,從宿主 細(xì)胞內(nèi)尋找具有抗病毒功能的基因或蛋白是一個熱門領(lǐng)域。
[0007] 人類發(fā)展史上流感病毒的大爆發(fā)都給社會經(jīng)濟發(fā)展、人的健康帶來重大危害。為 預(yù)防和治療流感,各國都投入了大量人力物力,不斷研究治療方法和藥物。近年來,針對宿 主細(xì)胞內(nèi)具有抗病毒功能的基因或蛋白作為靶點研發(fā)抗病毒藥物是一個熱門領(lǐng)域。
[0008]以細(xì)胞內(nèi)功能分子作為抗病毒治療的靶點具有廣譜抗病毒、不易產(chǎn)生耐藥毒株的 優(yōu)勢,逐漸成為研究開發(fā)抗病毒治療藥物的熱點途徑。近年來國際高水平論文多次報道在 宿主細(xì)胞內(nèi)信號通路中篩選具有潛在抗病毒功能的分子取得突破性成就。例如,鋅指抗病 毒蛋白(Zinc-finger antiviral protein,ZAP)能通過降解特異病毒RNA進而抑制鼠白血 病病毒等多種病毒的復(fù)制,被證明是一種重要的抗病毒因子(Chen et al. (2008) Proc.Natl. Acad. Sci.USA. 105,4352-4357)。利用鋅指蛋白為載體攜帶特異的酶阻斷T細(xì)胞 中的CCR5表達,可促進Τ細(xì)胞清除HIV病毒(Holt et al. UOlO^at.BiotechnoUSASg-Sd?) <^3 泛素連接酶 RNF5 定位于線粒體 ,通過泛素化修飾 ΜΙΤΑ( 也稱為 STING) 并引起其降解 而負(fù)調(diào)控病毒感染后I型干擾素表達(Zhong et al.(2009)Immunity.30,397-407)〇 Tetherin(宿主細(xì)胞蛋白)以二聚體錨定HIV在其復(fù)制的細(xì)胞膜上,阻斷病毒從胞漿膜出芽 釋放(Perez-Caballero et al.UOOWCell.mdgg-SllhAPOBECSGQpolipoprotein B mRNA-editing enzyme catalytic polypeptide-like 3G)可誘導(dǎo)HIV基因變異,使病毒不 能復(fù)制(Shirakawa et al · (2008)Nat · Struct .Mol · Biol · 15,1184-1191)。目前細(xì)胞周期素 依賴激酶、前列腺素、熱休克蛋白作為藥靶分子廣泛用于如,1?1^、!11¥、!^¥、腺病毒和乳頭 狀瘤等病毒病治療。
[0009] RNAi是一種高效的特異性強的基因阻斷技術(shù),近年來發(fā)展迅速,很快就成為功能 基因組研究的有力工具。通過實驗手段將dsRNA分子導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi),特異性地降解細(xì)胞內(nèi)與其 序列同源的mRNA,封閉內(nèi)源性基因表達,從反向遺傳的角度研究人類或其他生物基因組中 未知基因的功能。早期就有人應(yīng)用此項技術(shù)分離了果蠅胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑通路中的各種 成分。近來也有實驗報道通過RNAi研究細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)平衡過程中涉及的各條途徑。在這之前, 曾利用反義RNA與革巴mRNA序列互補的特性來抑制其表型的發(fā)生,但由于反義RNA對內(nèi)源性表 達的基因抑制作用較弱,往往會產(chǎn)生一些過渡表型,易造成對基因功能判斷錯誤,目前已通 過審批認(rèn)為臨床上具有治療作用的僅有一種藥物Vitravene。
[0010] RNAi特異性更高,作用更迅速,副反應(yīng)小,在有效地沉默靶基因的同時,對細(xì)胞本 身的調(diào)控系統(tǒng)也沒有影響。最近在人類體細(xì)胞里已經(jīng)成功地對近20種基因功能進行了"敲 除",尤其是因此而了解了人類空泡蛋白TsglOl對HIV在人體內(nèi)增殖的作用,進一步深化了 對HIV的研究。Leonid等以脊髓灰質(zhì)炎病毒為模型,利用RNAi來誘導(dǎo)細(xì)胞的胞內(nèi)免疫,產(chǎn)生 抗病毒效應(yīng),尤其是針對RNA病毒。對于易突變的病毒,可設(shè)計多種靶向病毒基因保守序列 的dsRNA,減少它對dsRNA的抵抗。Maen等也應(yīng)用RNAi技術(shù)成功地阻斷了MCF-7乳腺癌細(xì)胞中 一種異常表達的與細(xì)胞增殖分化相關(guān)的核轉(zhuǎn)錄因子基因21的功能。RNAi技術(shù)的應(yīng)用,不僅 能大大推動人類后基因組計劃(蛋白組學(xué))的發(fā)展,高通量地篩選藥物靶基因,逐條檢測人 類基因組的表達抑制情況來明確基因的功能,并且它還將應(yīng)用于基因治療、新藥開發(fā)、生物 醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域,用RNAi技術(shù)來抑制基因的異常表達,為治療各種疾病開辟了新的途徑。 [0011]由于近年來分子生物學(xué)技術(shù)和細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展,分子藥理學(xué)研究也不 斷深入,新的藥物作用靶點、功能蛋白質(zhì)、基因表達的變化,生物活性成分等不斷發(fā)現(xiàn),為藥 物篩選提供了大量新的靶點,如新的受體、酶等。這些新的靶點為新藥篩選提供了新的信息 和機會。細(xì)胞分子水平藥物篩選模型的應(yīng)用為自動化操作奠定了基礎(chǔ),使藥物篩選由傳統(tǒng) 的手工篩選形式轉(zhuǎn)變?yōu)橛捎嬎銠C控制的自動化大規(guī)模篩選的新技術(shù)體系,形成了高通量藥 物篩選。
[0012] 高通量藥物篩選的優(yōu)點:實現(xiàn)了藥物篩選的規(guī)模化,較大限度地利用了藥用物質(zhì) 資源,提高了藥物發(fā)現(xiàn)的概率,同時提高了發(fā)現(xiàn)新藥的質(zhì)量;篩選實驗是在微量篩選系統(tǒng)中 完成的,樣品用量一般在微克級(yg),節(jié)省了樣品資源,奠定了"一藥多篩"的物質(zhì)基礎(chǔ),同 時節(jié)省了實驗材料,降低了單藥篩選成本;高通量藥物篩選為高度自動化操作減少了操作 誤差的發(fā)生,降低了勞動強度,而且提高了藥物篩選的效率和結(jié)果的準(zhǔn)確性;具有多學(xué)科理 論和技術(shù)結(jié)合的特點。
[0013] 藥物篩選模型是發(fā)現(xiàn)新藥的重要條件。新模型的建立將會帶動新型藥物的出現(xiàn)。 分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、計算機科學(xué)的發(fā)展,特別是人類基因組計劃的完成,為醫(yī)藥研究 帶來了良好的機遇,也為建立新的藥物篩選模型,提供了理論、技術(shù)、材料等多方面的優(yōu)勢 條件。因此,我們應(yīng)充分利用各學(xué)科的發(fā)展技術(shù)建立更多新的篩選模型,促進新藥的發(fā)現(xiàn)。
[0014] DNA疫苗是上世紀(jì)九十年代發(fā)展起來的新技術(shù),即將外源基因克隆到真核表達載 體上構(gòu)建DNA疫苗質(zhì)粒,DNA疫苗經(jīng)過各種途徑注射到動物基體內(nèi)后,可被宿主細(xì)胞吸收和 攝取,進入宿主細(xì)胞的細(xì)胞核中轉(zhuǎn)錄成mRNA,再在胞漿中翻譯成蛋白質(zhì)。其中一部分蛋白質(zhì) 在降解后與MHC I類分子結(jié)合,并被遞呈到細(xì)胞表面被CD8T細(xì)胞的受體識別,而激活細(xì)胞毒 性T細(xì)胞的活性;另一部分蛋白質(zhì)也可以分泌出去,再像外源蛋白一樣被抗原提呈細(xì)胞攝 取,在吞噬溶酶體內(nèi)降解成多肽,并進一步與MHC II類分子結(jié)合,有抗原提呈細(xì)胞提呈到細(xì) 胞表面被Th2細(xì)胞的受體識別,然后由Th2細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子作用于B細(xì)胞,而刺激以抗體 產(chǎn)生為主的體液免疫。DNA疫苗不僅可誘導(dǎo)產(chǎn)生體液免疫,而且可誘導(dǎo)強烈而持久的細(xì)胞免 疫,還可避免向外界排毒,而且DNA疫苗與減毒和弱毒疫苗不一樣,其不存在毒力反強等問 題。其安全性及高效性是傳統(tǒng)疫苗所達不到的,所以,該技術(shù)在病毒、細(xì)胞內(nèi)寄生所引起的 傳染病、寄生蟲以及腫瘤防治中顯示出巨大的潛力。Wolff對重組質(zhì)??梢栽谛∈篌w內(nèi)表達 進行了報道,外源蛋白可以在小鼠體內(nèi)表達長達60天,提示質(zhì)粒DNA可以在體內(nèi)相當(dāng)一段時 間內(nèi)進行表達,可以用作治療性作用,并引起了廣泛的研究。
[0015] 基因治療對于癌癥、動脈粥樣硬化、骨質(zhì)疏松、關(guān)節(jié)炎、阿耳茨海默氏病因為特定 基因活動異常而引起的疾病的預(yù)防和治療很有前景。該療法是一種將核酸引入人細(xì)胞以用 來修改它們的遺傳特性而達到治療目的的治療策略。通常,該核酸是能夠編碼起治療作用, 破壞作用或者標(biāo)記作用的蛋白質(zhì)的雙鏈DNA分子(dsDNA)。該核酸也可能是與宿主細(xì)胞里的 目標(biāo)序列結(jié)合,通過阻止mRNAs或者啟動子來抑制特定基因表達的反義RNA或者單鏈DNA (ssDNA)。至今,以質(zhì)粒為基礎(chǔ)的基因治療、癌癥疫苗等已經(jīng)超過了600例,質(zhì)粒DNA的基因免 疫模擬了病原體在細(xì)胞內(nèi)的基因表達途徑,已經(jīng)成功地應(yīng)用來治療下肢的局部缺血,心血 管再生,并極有希望通過核酸疫苗來預(yù)防現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的疑難雜癥,包括瘧疾、艾滋病、乙肝和 結(jié)核病等。對于基因治療,質(zhì)粒不能整合入基因組DNA也許是個缺點,但是質(zhì)??梢愿郊芋w 的形式存在于細(xì)胞核中,也可以持續(xù)表達相當(dāng)長的一段時間。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0016] 因此,本發(fā)明要解決的技術(shù)問題就是設(shè)計抑制宿主體內(nèi)和流感病毒復(fù)制相關(guān)基因 的siRNA序列,構(gòu)建能夠編碼該siRNA的重組載體,以及含有該序列開放閱讀框的重組載體 在制備抗流感藥物方面的應(yīng)用。
[0017] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案之一是:一種針對小窩蛋白2基因的 s iRNA,其中本發(fā)明所述的s iRNA對應(yīng)的靶序列是小窩蛋白2基因的mRNA,本發(fā)明所述的 siRNA的長度為16-30bp,且可使經(jīng)其轉(zhuǎn)染后的哺乳動物細(xì)胞的mRNA或蛋白表達下降60%以 上。
[0018]其中所述的哺乳動物包括選自豬、犬、鼠、人等哺乳動物,本發(fā)明中較佳的是豬,本 發(fā)明的siRNA在豬中具有較好的沉默基因的效果。
[0019] 本發(fā)明中所述的siRNA,長度為16-30bp,更佳地為18-25bp。較佳的,所述的siRNA 含有選自SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列,或如序列表中SEQ ID NO: 1表示。更佳地,所述的 siRNA的3 '端含有2個T或含有2個U的延伸結(jié)構(gòu)。
[0020] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案之二是:一種編碼所述的抑制小窩蛋 白2表達的s iRNA的重組載體。
[0021] 根據(jù)本發(fā)明,所述的重組載體采用的載體可以是本領(lǐng)域常規(guī)的載體,包括腺病毒 載體,如以5型(Ad5)、2型(Ad2)為基礎(chǔ)的各