一種羊草金屬硫蛋白基因LcMT3的克隆方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[000? ]本發(fā)明屬于金屬硫蛋白制備領(lǐng)域，尤其涉及一種羊草金屬硫蛋白基因 LcMT3的克 隆方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 羊草(Leymus chinensis(Trin. )Tzvel.)又名堿草，它是歐亞大陸草原區(qū)東部草 甸草原及干旱草原上的重要建群種之一。我國東北部松嫩平原及內(nèi)蒙古東部為其分布中 心，在河北、山西、河南、陜西、寧夏、甘肅、青海、新疆等省（自治區(qū)）均有分布。
[0003] 羊草抗寒、抗旱、耐鹽堿、耐土壤瘠薄，適應(yīng)范圍廣。羊草在漫長的進(jìn)化過程中積累 了豐富的抗逆基因，形成了一套完善的抗逆機制。
[0004] 金屬硫蛋白（me tall othi one in, MT)是一類在動物、植物和微生物體內(nèi)均廣泛存 在，富含半胱氨酸(Cys)殘基，能被金屬誘導(dǎo)的低分子量金屬結(jié)合蛋白。
[0005] 早在1957，Margoshes和Vallee在研究重金屬錫的生物學(xué)功能時，從馬腎的細(xì)胞中 首次分離除了動物MTXasterline和Barnett于1977年從大豆根中首次發(fā)現(xiàn)植物MT。目前已 從擬南芥、水稻、玉米、番茄、豌豆等多重植物中發(fā)現(xiàn)并克隆了植物MT基因。根據(jù)植物MT中 Cys殘基的位置和排列方式，將植物MT分為4個亞家族，分別為MT1、MT2、MT3和MT4(Binz et al，1999)〇
[0006] ΜΤ參與了植物許多生理過程，如生長發(fā)育、胚胎發(fā)生、小孢子發(fā)生、衰老、果實發(fā) 育、成熟和抗逆等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種羊草金屬硫蛋白基因 LCMT3的克隆方法，旨在解決目 前克隆羊草金屬硫蛋白基因 LcMT3的方法簡陋的問題。
[0008] 本發(fā)明實施例是這樣實現(xiàn)的，一種羊草金屬硫蛋白基因 LCMT3的克隆方法，該方法 包括以下步驟：
[0009] 步驟一、羊草LcMT3基因的克隆及生物信息學(xué)分析；
[0010] 步驟二、半定量RT-PCR分析羊草LcMT3基因的組織表達(dá)模式；
[0011]步驟三、半定量RT-PCR分析羊草LcMT3基因的脅迫誘導(dǎo)表達(dá)模式；
[0012] 步驟四、LcMT3基因酵母表達(dá)及耐鹽性鑒定；
[0013] 步驟五、LcMT3基因原核表達(dá)、純化及耐鹽性鑒定。
[0014] 進(jìn)一步，羊草LcMT3基因的克隆及生物信息學(xué)分析的具體方法為：
[0015] 1)處理羊草種子；
[0016] 2)提取羊草葉片總RNA;
[0017] 3)3'RACE;
[0018] 4)RT-PCR克隆羊草LcMT3全長基因；
[0019] 5)生物信息學(xué)分析。
[0020] 進(jìn)一步，處理羊草種子的方法為：
[0021] 羊草種子在蛭石中萌發(fā)，室溫光照16小時，溫度25°C培養(yǎng)，用1/2MS澆灌至四葉期， 每隔三天饒一次，用l〇〇mmol/L Na2C〇3脅迫處理24小時后，取羊草葉片至于液氮中冷凍保 存。
[0022] 進(jìn)一步，3'RACE的具體步驟如下：
[0023] 步驟一、在0.2ml離心管中加入lyg RNA，lyl 3'-〇)S primer A，然后加入RNase-free水補足5μ1，混合離心；72°C水浴2分鐘，再冰浴2分鐘，瞬時離心;加入提前混合好的5μ1 混合物，包括2μ1 5 XFirst-Strand Buffer，ΙμL DDT(20mmol/L)，ΙμL dNTP Mi χ( 1 Ommol / L)，lyl M-MLV Reverse Transcriptase;輕吸混合物使之均勾，瞬時離心；42°C水浴1.5小 時;加入Tricine-EDTA Buffer 100yl;72°C水浴7分鐘，分裝后-20°C冰箱中保存?zhèn)溆茫?br>[0024] 步驟二、根據(jù)羊草LcMT3基因 EST設(shè)計3'RACE特異性引物GSP(5'-TCACAAGCCAAGACCACCATG-3,）：
[0025] 以 cDNA為模板，以 GSP 和 lOXUniversal Primer A Mix(5'_ CTAATACGACTCACTATAGGGC-3'）為引物，50μ1 PCR反應(yīng)體系：34·5μ1 PCR-Grade Water，5yl lOXAdvantage 2PCR Buffer,ΙμL dNTP Mix( lOmmol/L) , ΙμL 50XAdvantage 2Polymerase Μ?χ,?μL GSP(10ymol/L),5μ110XUniversal Primer A Mix(2ymol/L),2.5μ 1 cDNA；
[0026] 步驟二中PCR反應(yīng)條件:94 °C 2分鐘；94 °C 30秒，55 °C 30秒，72 °C 1分鐘，30個循環(huán);72 °C10分鐘；
[0027] 步驟三、用1%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物，回收目的片段，與pMD 18-T載體連 接，轉(zhuǎn)化大腸感覺ToplO感受態(tài)細(xì)胞，選取陽性克隆，進(jìn)行測序。
[0028] 進(jìn)一步，RT-PCR克隆羊草LcMT3全長基因的具體步驟為：
[0029] 步驟一、將lyg RNA于70°C孵育10分鐘，瞬時離心，置于冰上；4μ1 25mmol/L MgCl2,2yl Reverse Transcription 10XBuffer，2μ1 lOmmol/L dNTP Mixture,0.5μ1 Ribonuclease inhibitor,15U AMV Reverse Transcriptase,0.5yg 01igo(dT)i5Primer, 加入去離子水至20μ1;
[0030] 步驟二、根據(jù)3'RACE的測序結(jié)果與EST(⑶808743)序列拼接后得到的序列設(shè)計引 物FI(5 '-TCACAAGCCAAGACCACCATG-3 '）和R1(5 '-ACGGGTAGACGGTGATGAGAG '-3 '）：
[0031] 以 cDNA 為模板，以 F1 和 R1 為引物，50μ1 PCR 反應(yīng)體系：1μ1 cDNA，lyl Fl(10ymol/ L)，lyl Rl(10ymol/L)，25yl Premix Taq?，22yl去離子水;PCR反應(yīng)條件：94°C2分鐘；94°C 30秒，55 °C30秒，72°C 1分鐘，30個循環(huán);72 °C 10分鐘；用1 %瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物，回 收目的片段，與pMD 18-T載體連接，構(gòu)建重組載體pMD 18-T-LcMT3,轉(zhuǎn)化大腸感覺ToplO感 受態(tài)細(xì)胞，選取陽性克隆，進(jìn)行測序。
[0032]進(jìn)一步，半定量RT-PCR分析羊草LcMT3基因的組織表達(dá)模式的具體方法為：
[0033]將羊草培養(yǎng)四葉期，取羊草葉和根至于液氮中冷凍保存；
[0034] 提取羊草葉和根總RNA，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA;
[0035]根據(jù)羊草Act iη基因序列（AB181991)設(shè)計引物F2 (5 ' -GGACCTTGCTGGTCGTGACC-3 '） 和R2(5 '-CCTCAGGGCACCTGAACCTTT-3 '）；
[0036] 以羊草葉和根cDNA為模板，以F1和R1 (或F2和R2)為引物，50μ1 PCR反應(yīng)體系：1μ1 。0嫩，1以1?1(或卩2)(1(^111〇1/1)，1411?1(或1?2)(1(^111〇1/1)，2541?代11^叉了&9*，2241去離 子水;PCR反應(yīng)條件:94°C 2分鐘;94°C 30秒，55 °C 30秒，72 °C 1分鐘，30個循環(huán);72 °C 10分鐘； [0037]用1 %瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物。
[0038]進(jìn)一步，半定量RT-PCR分析羊草LcMT3基因的脅迫誘導(dǎo)表達(dá)模式的具體方法為：
[0039] 將羊草培養(yǎng)至四葉期，用400mmol/L NaCl，100mmol/L Na2C03和20%PEG6000處理 四葉期羊草，脅迫處理后0小時、6小時、12小時、24小時后，提取羊草葉片RNA;
[0040] 將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以羊草cDNA為模板，以F1和R1為引物，50μ1 PCR反應(yīng)體系：1μ 1 cDNA，lyl lOymol/L Fl，lyl lOymol/L Rl，25yl Premix Taq?，22yl去離子水；
[0041 ] PCR 反應(yīng)條件：94 °C 2 分鐘；94 °C 30 秒，55 °C 30 秒，72 °C 1 分鐘，30 個循環(huán)；72 °C 10 分 鐘；
[0042]用1 %瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物。
[0043] 進(jìn)一步，LcMT3基因酵母表達(dá)及耐鹽性鑒定的步驟包括：
[0044] l)pYES2/CT_LcMT3 載體構(gòu)建；
[0045] 2)轉(zhuǎn)化釀酒酵母菌株INVScl;
[0046] 3) Northern 雜交；
[0047] 4)轉(zhuǎn)LcMT3基因酵母的誘導(dǎo)培養(yǎng)及耐鹽性分析。
[0048]進(jìn)一步，LcMT3基因原核表達(dá)、純化及耐鹽性鑒定的步驟包括：
[0049] l)pGEX-4T-l_LcMT3 載體構(gòu)建；
[0050] 2)pGEX-4T-1-LcMT3 誘導(dǎo)表達(dá)；
[0051] 3)蛋白純化；
[0052] 4)Western 雜交分析；
[0053] 5)耐鹽性分析。
[0054] 進(jìn)一步，轉(zhuǎn)LcMT3基因酵母誘導(dǎo)培養(yǎng)具體步驟如下：
[0055] 挑取對照酵母和轉(zhuǎn)基因酵母單菌落，接種與加入終濃度為2%葡萄糖的SC-U液體 培養(yǎng)基中中，30°C振蕩培養(yǎng)24小時；
[0056] 調(diào)整5ml的培養(yǎng)液0D600為0 · 3; 6000rpm離心1分鐘；
[0057]用lml誘導(dǎo)培養(yǎng)基重懸菌體，接種于50ml的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中30°C振蕩培養(yǎng)24小時。 [0058]本發(fā)明提供的羊草金屬硫蛋白基因 LcMT3的克隆方法操作過程嚴(yán)謹(jǐn)科學(xué)，為金屬 硫蛋白在科研和生產(chǎn)中的應(yīng)用提供了重要作用。
【附圖說明】
[0059] 圖1是本發(fā)明實施例提供的羊草金屬硫蛋白基因 LcMT3的克隆方法流