一種串聯(lián)鴨α、γ干擾素基因及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域的基因融合表達(dá)，具體涉及一種串聯(lián)鴨α、γ干擾素基因 及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 干擾素（interferon，IFN)是一類在同種細(xì)胞上具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等 多種生物學(xué)功能的糖蛋白。1957年，由Isaacs等首次發(fā)現(xiàn)。國際干擾素命名委員會(huì)根據(jù)干擾 素的抗原特性和分子結(jié)構(gòu)的差異，將干擾素分為2個(gè)型。α干擾素（IFN-α)屬I型干擾素，在 1995年，由Schultz等成功克隆并表達(dá)，隨后，研究者相繼克隆出北京鴨、番鴨、麻鴨和紹興 鴨的IFN-a基因。IFN-a基因由576個(gè)核苷酸構(gòu)成，共編碼191個(gè)氨基酸，含有信號(hào)肽。不同品 種間的鴨a干擾素基因相對(duì)較保守，核苷酸序列同源性在99.5 %~100 %之間。IFN-a主要參 與抗病毒、抗腫瘤過程，研究表明，重組鴨IFN-a對(duì)DHV有一定的治療作用，可以減少乙肝病 毒cccDNA向pgRNA的轉(zhuǎn)錄。此外，重組鴨a干擾素對(duì)流感病毒、新城疫病毒和呼腸孤病毒也有 一定的抑制作用。γ干擾素（IFN-γ )屬于II型干擾素，1999年，Schultz等證明了鴨IFN-γ 開放閱讀框含有495個(gè)堿基，可編碼164個(gè)氨基酸。IFN-γ可誘導(dǎo)病毒感染的細(xì)胞表達(dá)病毒 抗原，增加免疫系統(tǒng)識(shí)別和殺傷感染細(xì)胞的能力，還可作為免疫佐劑參與機(jī)體的免疫反應(yīng)。 目前，關(guān)于鴨重組干擾素的研究仍局限于對(duì)單個(gè)干擾素的表達(dá)及活性研究，尚無將兩個(gè)鴨 干擾素基因串聯(lián)表達(dá)并檢測(cè)其抗病毒活性的例子。
[0003] 禽流感(Avian influenza,AI)是由流感病毒(Avian influenza virus)引起的急 性高度接觸性傳染病，臨床表現(xiàn)為嚴(yán)重的發(fā)病和死亡，或輕度呼吸道感染，或無癥狀。1878 年首次在意大利發(fā)現(xiàn)，目前，幾乎已遍布世界各地，給養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。流感 在家禽中以雞和火雞的易感性最高，鴨、鵝和鵪鶉等動(dòng)物也能感染，1956年英國科學(xué)家首次 證明甲型流感病毒能夠感染鴨。近年來，在我國部分省份不斷出現(xiàn)鴨感染流感病毒的現(xiàn)象， 嚴(yán)重阻礙養(yǎng)鴨業(yè)的健康發(fā)展。
[0004] 鴨瘟(Duck plague，DP)是鴨的一種急性敗血性傳染病，臨床特征主要為體溫升 高，下痢，兩腳發(fā)軟無力，部分發(fā)病鴨表現(xiàn)為頭頸部腫大。該病傳播迅速，發(fā)病率高，鴨群感 染鴨瘟病毒后，往往引起大批量死亡。鴨瘟主要通過疫苗預(yù)防，若出現(xiàn)發(fā)病，可用聚肌胞(簡(jiǎn) 稱Poly I: C，屬A級(jí)干擾素誘生劑)肌肉注射，效果顯著。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為克服上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺點(diǎn)與不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種串聯(lián) 鴨α、γ干擾素基因。本發(fā)明所述的串聯(lián)鴨α、γ干擾素基因易于生產(chǎn)，成本低，活性高，具有 疊加的鴨IFN-a、IFN- γ抗病毒功能，對(duì)流感和鴨瘟均有很好的治療效果。
[0006] 本發(fā)明的另一目的在于提供上述串聯(lián)鴨α、γ干擾素基因的制備方法。
[0007] 本發(fā)明的另一目的在于提供上述表達(dá)串聯(lián)鴨α、γ干擾素基因的原核表達(dá)質(zhì)粒 pET32a-IFNa-linker-IFNy。
[0008] 本發(fā)明的另一目的在于提供上述原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a-IFNa-linker-IFNy的制 備方法。
[0009] 本發(fā)明的再一目的在于提供上述串聯(lián)鴨α、γ干擾素基因的應(yīng)用。
[0010]本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種串聯(lián)鴨〇、γ干擾素基因（1?_-linker-IFNy )，其核苷酸序列如下：
[0011] Ttctcctgcagccccctgcgcctccacgacagcgccttcgcctgggacagcctccagctcctccgcaacatggctcc cagccccacacagccctgcccgcagcaacacgcgccttgctccttcccggacaccctcctggacaccaacgacacgc agcaagccgcacacaccgccctccacctcctccaacacctcttcgacaccctcagcagccccagcacccccgcgcac tggctccacaccgcacgccacgacctcctcaaccagcttcagcaccacatccaccacctcgagcgctgcttcccagc cgacgccgcgcgcctccacaggcgagggccccgcaaccttcacctcagcatcaacaagtacttcggctgcatccaac acttcctccagaaccacacctacagcccctgcgcatgggaccacgtccgcctcgaggctcacgcctgcttccagcgc atccaccgcctcacccgcaccatgcgcggtggaggaggctctggtggaggcggtagcggaggcggagggtcgatgac ttgccagacctactgcttgtttgttctctctgtcatcatgatttattttggatgttctggaagtgctttatttctag gtcaacttcaaaatgacatagacaaactgaaagctgattttaatgcaagtaattcggatgtagctgatggcaatcct gtttttatagagaaagtgaaaaactggacagagagaaatgaaaaaaggatcatactgagccagattgttaccctgta cttggaaatgctaaagaaaactgacatgtcaaagccacacatcaaaaatttatctgagcagctcaatactctgagaa ataccctttccaatgactacaagaagttcagagacctcgtggaactgtcaaaccttcagctgactggcttgaaaatc caacgcaaggctgtgagtgagctgttcagtgtcttacagaaactggtggagacttcgacttccaaaaggaaaaggag ccagtctccaaagagatgcagatgttaa〇
[0012] 所述的串聯(lián)鴨α、γ干擾素基因是應(yīng)用重疊延伸PCR(gene splicing by overlap eXtenSi〇n，S0E-PCR)方法，將去除信號(hào)肽的鴨α、γ干擾素基因通過一疏水性柔性氨基酸接 頭（linker)(G4S)3連接，然后將串聯(lián)好的鴨IFNa-linker-IFNy基因克隆至原核表達(dá)載體 pET32a( + )上，構(gòu)建成重組表達(dá)載體pET32a-IFNa-linker-IFNγ，通過BL21系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)， 鑒定純化后，分別在體內(nèi)和體外檢測(cè)其抗流感和鴨瘟活性。
[0013]上述的串聯(lián)鴨α、γ干擾素基因的制備方法，具體包括以下步驟：
[0014] (1)引物的設(shè)計(jì)與合成
[0015] 根據(jù)Genbank中提供的鴨IFN-a和IFN-γ序列，分別設(shè)計(jì)2對(duì)引物IFNa-Fl、IFNa-Rl 和IFN γ -FI、IFN γ -R1，用于擴(kuò)增去除信號(hào)肽后的鴨IFN-a基因（核苷酸序列信息如SEQ ID N0:2)和IFN-γ基因（核苷酸序列信息如SEQ ID N0:3)，并分別在IFN-a上游和IFN-γ下游 加入BamH I和Hind III兩個(gè)酶切位點(diǎn)；同時(shí)，設(shè)計(jì)用于S0E-PCR的引物IFNa-R2和IFNy -F2， 其中，IFNa-R2中含有部分linker序列，IFN γ-F2中含有與IFNa-R2互補(bǔ)的linker序列；引物 序列如下:去除信號(hào)肽后IFN-a的擴(kuò)增引物：
[0016] IFNa-Fl:CGGGATCC TTCTCCTGCAGCCCCCTGCG;
[0017] IFNa-Rl：CCCAAGCTTTTAGCGCATGGTGCGGGTGA；
[0018] IFNa-R2：
[0019] CTCCGCTACCGCCTCCACCAGAGCCTCCTCCACCGCGCATGGTGCGGGTG;去除信號(hào)肽后IFN- γ 的擴(kuò)增引物：
[0020] IFN γ-FI：CGGGATCC TCTGGAAGTGCTTTATTTCT；
[0021] IFN γ-F2：
[0022] TCTGGTGGAGGCGGTAGCGGAGGCGGAGGGTCGTCTGGAAGTGCTTTATTTCT；
[0023] IFN γ-R1:CCCAAGCTTTTAACATCTGCATCTCTTTGGA;
[0024] (2)鴨α、γ干擾素基因的擴(kuò)增
[0025] 從鴨外周血淋巴細(xì)胞中抽提RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后，得到擴(kuò)增鴨α、γ干擾素基因的cDNA 模板；以此cDNA為模板，分別用上述引物IFNa-Fl、IFNa-Rl和正以41、正"-1?1，擴(kuò)增出所 需鴨a、γ干擾素目的基因；
[0026] (3)S0E_PCR擴(kuò)增串聯(lián)鴨α、γ干擾素基因（鴨IFNa-linker-IFNy基因）
[0027] 該過程主要包含3個(gè)PCR反應(yīng)，第一個(gè)PCR:以IFNa-Fl和IFNa-R2為引物擴(kuò)增出含有 部分1 inker序列的IFN-a，以IFN γ -F2和IFN γ -R1為引物擴(kuò)增出含有部分1 inker序列的 IFN- γ，并分別進(jìn)行膠回收;第二個(gè)PCR:以第一個(gè)PCR擴(kuò)增出的基因?yàn)槟０澹患右?，進(jìn)行 10-15個(gè)PCR反應(yīng);第三個(gè)PCR反應(yīng)，以