一種由系列培養(yǎng)基組成的試劑盒及其在大豆遺傳轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種由系列培養(yǎng)基組成的試劑盒及其在大豆遺傳轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 大豆(Glycine max L.Merr.)是重要的糧油兼用作物，也是目前轉(zhuǎn)基因品種種植 面積最大的作物。由于傳統(tǒng)育種方法存在的局限性，使得轉(zhuǎn)基因技術(shù)成為大豆新品種培育 的重要手段。
[0003] 目前使用較為廣泛的大豆轉(zhuǎn)化體系，以根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的子葉節(jié)轉(zhuǎn)化體系和基因 槍介導(dǎo)的幼胚轉(zhuǎn)化體系為主。由于基因槍介導(dǎo)的幼胚轉(zhuǎn)化受外植體取材的限制，實(shí)際應(yīng)用 中主要還是采用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的子葉節(jié)轉(zhuǎn)化方法?，F(xiàn)有的根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化體系存在轉(zhuǎn)化 效率低的問題，制約著大豆分子育種的發(fā)展。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種由系列培養(yǎng)基組成的試劑盒及其在大豆遺傳轉(zhuǎn)化中的 應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明提供了一種用于大豆遺傳轉(zhuǎn)化的試劑盒，包括恢復(fù)培養(yǎng)基、篩選培養(yǎng)基、伸 長培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基；
[0006] 所述恢復(fù)培養(yǎng)基中含有45-55mg/L L-天冬酰胺、45-55mg/L L-谷氨酰胺、28-32mg/L EDTA鹽和ll-13mg/L FeS〇4;
[0007] 所述篩選培養(yǎng)基中含有45-55mg/L L-天冬酰胺、45-55mg/L L-谷氨酰胺、28-32mg/L EDTA鹽和ll-13mg/L FeS〇4;
[0008] 所述伸長培養(yǎng)基中含有45-55mg/L L-天冬酰胺、45-55mg/L L-谷氨酰胺、28-32mg/L EDTA鹽和 11-13mg/L FeS〇4;
[0009] 所述生根培養(yǎng)基中含有45-55mg/L L-天冬酰胺和45-55mg/L L-谷氨酰胺。
[0010]所述恢復(fù)培養(yǎng)基中具體含有50mg/L L-天冬酰胺、50mg/L L-谷氨酰胺、29.84mg/L EDTA鹽和12· 16mg/L FeS(k。所述恢復(fù)培養(yǎng)基的組成可如下：2·5-3·5g/L B5鹽、0·5-1 ·5ml/ 1^85有機(jī)、25-358/1蔗糖、130-17011^/1頭孢霉素、130-17011^/1特美汀、0.8-1.211^/16-8八、 0.8-1.2g/L 2-嗎啉乙磺酸、5-10g/L 瓊脂、28-32mg mg/L EDTA 鹽、ll-13mg/L FeS〇4、45-55mg/L L-天冬酰胺、45-55mg/L L-谷氨酰胺，余量為水。所述恢復(fù)培養(yǎng)基的組成具體如下： 3.1g/L B5鹽、lml/L B5有機(jī)、30g/L蔗糖、150mg/L頭孢霉素、150mg/L特美汀、lmg/L 6-BA、 0.98g/L 2-嗎啉乙磺酸、7.5g/L瓊脂、29.84mg/L EDTA鹽、12.16mg/L FeS〇4、50mg/L L-天 冬酰胺、50mg/L L-谷氨酰胺，余量為水。所述EDTA鹽具體可為Na2-EDTA。所述恢復(fù)培養(yǎng)基的 組成具體如下：3 · lg/L B5鹽、lml/L B5有機(jī)、30g/L蔗糖、150mg/L頭孢霉素、150mg/L特美 汀、lmg/L 6-BA、0.98g/L 2-嗎啉乙磺酸、7.5g/L瓊脂、4ml/L Fe鹽（200X)、50mg/L L-天冬 酰胺、50mg/L L-谷氨酰胺，余量為水。所述恢復(fù)培養(yǎng)基的pH可為5-6，具體可為5.4。
[0011]所述篩選培養(yǎng)基中具體含有50mg/L L-天冬酰胺、50mg/L L-谷氨酰胺、29.84mg/L EDTA鹽和12· 16mg/L FeS〇4。所述篩選培養(yǎng)基的組成可如下：2·5-3·5g/L B5鹽、0·5-1 ·5ml/ L B5有機(jī)、0 · 8-1 · 2g/L 2-嗎啉乙磺酸、25-35g/L蔗糖、130-170mg/L頭孢霉素、130-170mg/L 特美汀、〇 · 8-1 · 2mg/L 6-BA、6-1 Omg/L草丁膦、5-10g/L瓊脂、28-32mg/L EDTA鹽、11 -13mg/L FeS〇4、45-55mg/L L-天冬酰胺、45-55mg/L L-谷氨酰胺，余量為水。所述篩選培養(yǎng)基的組成 具體如下：3.1g/L B5鹽、lml/L B5有機(jī)、0.98g/L 2-嗎啉乙磺酸、30g/L蔗糖、150mg/L頭孢 霉素、150mg/L特美汀、lmg/L 6-BA、8mg/L草丁膦、7 · 5g/L瓊脂、29 · 84mg/L EDTA鹽、 12.16mg/L FeS〇4、50mg/L L-天冬酰胺、50mg/L L-谷氨酰胺，余量為水。所述EDTA鹽具體可 為Na2-EDTA。所述篩選培養(yǎng)基的組成具體如下：3.1g/L B5鹽、lml/L B5有機(jī)、0.98g/L 2-嗎 啉乙磺酸、30g/L鹿糖、150mg/L頭孢霉素、150mg/L特美汀、lmg/L 6-BA、8mg/L草丁膦、7·5g/ L瓊脂、4ml/L Fe鹽(200X)、50mg/L L-天冬酰胺、50mg/L L-谷氨酰胺，余量為水。所述篩選 培養(yǎng)基的pH可為5-6，具體可為5.4。
[0012]所述伸長培養(yǎng)基中具體含有50mg/L L-天冬酰胺、50mg/L L-谷氨酰胺、29.84mg/L EDTA鹽和12·16mg/LFeS04。所述伸長培養(yǎng)基的組成可如下：3-5g/LMS鹽、0·8-l·2ml/LB5 有機(jī)、0.5-0.78/12-嗎啉乙磺酸、25-358/1蔗糖、130-1701^/1頭孢霉素、130-1701!^/1特美 汀、0.08-0.1211^/11八八、0.4-0.611^/16八、0.8-1.211^/16-8八、7-911^/1草丁膦、5-1(^/1瓊 月旨、28-32mg/L EDTA鹽、ll-13mg/L FeS〇4、45-55mg/L L-天冬酰胺、45-55mg/L L-谷氨酰 胺，余量為水。所述伸長培養(yǎng)基的組成具體如下:4.Og/L MS鹽、lml/L B5有機(jī)、0.6g/L 2-嗎 啉乙磺酸、30g/L鹿糖、150mg/L頭孢霉素、150mg/L特美汀、0· lmg/L IAA、0.5mg/L GA、lmg/L 6-BA、8mg/L草丁膦、7.5g//L瓊脂、29.84mg/L EDTA鹽、12.16mg/L FeS〇4、50mg/L L-天冬酰 胺、50mg/L L-谷氨酰胺，余量為水。所述EDTA鹽具體可為Na2-EDTA。所述伸長培養(yǎng)基的組成 具體如下:4.0g/L MS鹽、lml/L B5有機(jī)、0.6g/L 2-嗎啉乙磺酸、30g/L蔗糖、150mg/L頭孢霉 素、150mg/L特美汀、0.1mg/L IAA、0.5mg/L GA、lmg/L 6_BA、8mg/L草丁膦、7.5g/L瓊脂、 4ml/L Fe鹽(200X)、50mg/L L-天冬酰胺、50mg/L L-谷氨酰胺，余量為水。所述伸長培養(yǎng)基 的pH可為5-6，具體可為5.6。
[0013]所述生根培養(yǎng)基中具體含有50mg/L L-天冬酰胺、50mg/L L-谷氨酰胺、29.84mg/L EDTA鹽和12· 16mg/L FeS〇4。所述生根培養(yǎng)基的組成可如下：2·5-3·5g/L MS鹽、0·8-1 ·2ml/ 185有機(jī)、0.5-0.78/12-嗎啉乙磺酸、15-258/1蔗糖、5-1(^/1瓊脂、45-5511^/11^-天冬酰 胺、45-55mg/L L-谷氨酰胺，余量為水。所述生根培養(yǎng)基的組成具體如下：2.165g/L MS鹽、 lml/L B5有機(jī)、0.6g/L 2-嗎啉乙磺酸、20g/L蔗糖、7.5g/L瓊脂、50mg/L L-天冬酰胺、50mg/ L L-谷氨酰胺，余量為水。所述生根培養(yǎng)基的pH可為5-6，具體可為pH5.7。
[0014] 以上任一所述Fe鹽（200 X )的制備方法具體如下：將7.46g Na2-EDTA和5.56g FeS〇4 · 7H20溶于水并用水定容到1000ml。
[0015] 所述試劑盒還包括發(fā)芽培養(yǎng)基和/或液體培養(yǎng)基和/或共培養(yǎng)培養(yǎng)基。所述液體培 養(yǎng)基為用于重懸農(nóng)桿菌以制備侵染菌液的培養(yǎng)基
[0016] 所述發(fā)芽培養(yǎng)基的組成可如下：2.5-3.5g/L B5鹽、0.8-1.2ml/L B5有機(jī)、15-25g/ L蔗糖、5-10g/L瓊脂，余量為水。所述發(fā)芽培養(yǎng)基的組成具體如下:3.12g/L B5鹽、lml/L B5 有機(jī)、20g/L蔗糖、7.5g/L瓊脂，余量為水。所述發(fā)芽培養(yǎng)基的pH可為5-6，具體可為5.8。 [0017] 所述液體培養(yǎng)基的組成可如下：0.3-0.6g/L MS鹽、0.8-1.2ml/L B5有機(jī)、30- 5〇1^/1乙酰丁香酮、13〇-17〇1^/1二硫蘇糖醇、8〇-12〇11^/1^-半胱氨酸、25-358/1蔗糖、3-5mg/L 2-嗎啉乙磺酸，余量為水。所述液體培養(yǎng)基的組成具體如下：0.43g/L MS鹽、lml/L B5有機(jī)、40mg/L乙酰丁香酮、150mg/L二硫蘇糖醇、100mg/L L-半胱氨酸、30g/L鹿糖、3 · 9mg/ L 2-嗎啉乙磺酸，余量為水。所述液體培養(yǎng)基的pH可為5-6，具體可為5.4。
[0018] 所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基的組成可如下：0.3-0.6g/L MS鹽、0.8-1.2ml/L B5有機(jī)、30-5〇1^/1乙酰丁香酮、13〇-17〇1^/1二硫蘇糖醇、8〇-12〇11^/1^-半胱氨酸、25-358/1蔗糖、5-l〇g/L瓊脂、3-5mg/L 2-嗎啉乙磺酸，余量為水。所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基的組成具體如下:0.43g/ L MS鹽、lml/L B5有機(jī)、40mg/L乙酰丁香酮、150mg/L二硫蘇糖醇、100mg/L L-半胱氨酸、 30g/L蔗糖、7.5g/L瓊脂、3.9mg/L 2-嗎啉乙磺酸，余量為水。所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基的pH可為5-6,具體可為5.4。
[0019] 所述試劑盒在大豆遺傳轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0020] 本發(fā)明還保護(hù)一種大豆遺傳轉(zhuǎn)化的方法，包括如下步驟：
[0021] (1)將大豆外植體置于侵染菌液中室溫浸泡;所述侵染菌液為重組農(nóng)桿菌菌懸液； 所述重組農(nóng)桿菌通過將含有目的基因的重組表達(dá)載體導(dǎo)入出發(fā)農(nóng)桿菌得到；
[0022 ] (2)完成步驟(1)后，取外植體，在所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)；
[0023] (3)完成步驟(2)后，取外植體，在所述恢復(fù)培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)；
[0024] (4)完成步驟(3)后，取外植體，在所述篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)；
[0025] (5)完成步驟(4)后，取外植體，切除子葉部分，將叢生芽轉(zhuǎn)接到所述伸長培養(yǎng)基 上，培養(yǎng)至叢生芽伸長3-4cm;
[0026] (6)完成步驟（5)后，取植株，剪取莖基部以上部分，先用吲哚丁酸溶液浸泡莖基 部，然后在所述生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)至生根。
[0027] 所述大豆外植體具體可為大豆子葉節(jié)外植體