一種生物催化生產(chǎn)磷酸肌酸的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及磷酸肌酸的制備方法的技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種利用生物酶催化技術(shù) 生產(chǎn)磷酸肌酸的生物催化方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 磷酸肌酸(phosphocreatine)是在肌肉或其他可興奮組織(如腦和神經(jīng)）中的一種 高能磷酸化合物，是高能磷酸基的暫時貯存形式。磷酸肌酸的作用非常多，其主要作用有以 下七點：（1)心肌保護劑:磷酸肌酸廣泛地分布于身體各組織，90%在肌肉組織中，磷酸肌酸 是用來維持ATP水平的，磷酸肌酸通過開放合成通路和減少分解作用，保護肌纖維膜免受缺 血損害并維持細胞的核酸儲備。臨床用于心麻痹癥的心臟保護及心肌代謝窘迫的其他狀 況。適用于心肌缺血、肥厚、心梗及心衰的治療(輔助治療），亦可用作各種心臟手術(shù)；（2)緩 沖肌肉中酸性物質(zhì)突然增高；（3)磷酸肌酸(CP)還參與能量運輸，即把能量從線粒體運載到 肌肉的其它部位；（4)運動員首選的運補劑:磷酸肌酸對于增加運動員的體能，提高運動成 績有明顯的效果、安全有效，無副作用。在比賽中，磷酸肌酸(CP)水平的增加能提高訓(xùn)練和 比賽成績；（5)ATP的貯存形式:磷酸肌酸可以把高能磷酸轉(zhuǎn)移給ADP生成ATP，因此磷酸肌酸 是ATP的貯存形式；（6)與ADP作用而產(chǎn)生ATP:當體內(nèi)肌酸磷酸激酶降低至零之前，腦組織缺 氧時，磷酸肌酸均能與ADP作用而產(chǎn)生ATP; (7)緩沖劑的作用:磷酸肌酸除提供能量外，在大 強度練習中還可以對控制肌肉中的酸性物質(zhì)起緩沖劑的作用，這是因為磷酸肌酸在合成 ATP過程中需要消耗大強度練習中堆積在肌肉中乳酸釋放出來的氫離子，而肌肉中氫離子 過多會阻礙肌肉收縮，所以磷酸肌酸能起緩沖作用并推遲疲勞的出現(xiàn)。
[0003] 現(xiàn)有技術(shù)中，磷酸肌酸的生產(chǎn)方法包括化學合成法和生物催化法?；瘜W合成法具 有反應(yīng)條件苛刻、激烈、不易控制，生成產(chǎn)物復(fù)雜，污染環(huán)境，合成過程中需要用到有毒且易 燃的原料等缺點；而生物催化法則是以肌酸和ATP為底物，在肌酸激酶的催化下，專一生成 磷酸肌酸，具有反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)速度快、專一性強及低碳環(huán)保等優(yōu)點。但是，由于肌酸激 酶的活力較低，且來源受限，致使磷酸肌酸的生產(chǎn)成本過高，嚴重制約了磷酸肌酸生物催化 法的規(guī)模化和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對上述【背景技術(shù)】中提到的磷酸肌酸現(xiàn)有生產(chǎn)方法存在的缺陷，本發(fā)明的目的在 于提供一種產(chǎn)率高、成本低、適于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的磷酸肌酸的生物催化生產(chǎn)方法。
[0005] 為實現(xiàn)上述目的，發(fā)明人對具有如SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列的Oryctolagus cuniculus肌酸激酶親本基因進行定點突變，PCR擴增后插入適當?shù)妮d體，隨后在LB培養(yǎng)基 上篩選，從而獲得了具有高催化活性的肌酸激酶突變體，因此，本發(fā)明提供了一種生物催化 生產(chǎn)磷酸肌酸的方法，其特征在于：以肌酸和三磷酸腺苷為底物，在肌酸激酶突變體的催化 作用下生產(chǎn)磷酸肌酸，所述肌酸激酶突變體具有如SEQ ID N0:3所示的氨基酸序列。
[0006] 上述肌酸激酶突變體可以是未經(jīng)純化的粗酶形式;也可以是經(jīng)部分純化或完全純 化的酶，純化過程可采用常規(guī)的Histag法;如果需要，還可以是利用固化技術(shù)制成的固相酶 或者固相細胞形式的固化酶。
[0007]優(yōu)選地，所述肌酸與所述三磷酸腺苷的摩爾比為20:1。
[0008] 優(yōu)選地，所述催化過程還需加入MgCl2和三聚磷酸鈉。
[0009] 優(yōu)選地，所述催化過程是在pH值為7~8的緩沖溶液中進行。
[0010] 所述緩沖溶液優(yōu)選為Tr is-HCl緩沖溶液。
[0011] 優(yōu)選地，所述肌酸激酶突變體為固定在酶固定化載體上的固定化肌酸激酶突變 體。
[0012] 所述酶固定化載體優(yōu)選為環(huán)氧型LX-3000、二氧化硅、活性炭、玻璃珠或者大孔型 聚N-氨乙基丙稀酰胺-聚乙稀。
[0013] 優(yōu)選地，所述固定化肌酸激酶突變體的加入量為0.01-0.5g/ml緩沖溶液。
[0014] 優(yōu)選地，所述固定化肌酸激酶突變體的制備方法包括以下步驟：
[0015] ⑴制備洗酶緩沖液：〇.〇2M Tris-HCl和0.001M EDTA的混合溶液，pH值為7.0;
[0016] (2)制備PB溶液:2 · Omol/L磷酸二氫鉀，pH值為7 · 5;
[0017] (3)用步驟（1)制備的洗酶緩沖液將所述肌酸激酶突變體稀釋至5-10mg/ml，并將 得到的酶稀釋液與步驟(2)制備的PB溶液等體積混合，再加入所述酶固定化載體，于搖床中 反應(yīng)，所述酶固定化載體的加入量為10毫克酶/克載體；
[0018] (4)待步驟(3)反應(yīng)完全后將所得反應(yīng)液過濾，并用步驟（1)制備的洗酶緩沖液清 洗，即得固定化肌酸激酶突變體。
[0019]以O(shè)ryctolagus cuniculus肌酸激酶親本的基因為模板制備上述肌酸激酶突變體 的方法優(yōu)選包括以下步驟：
[0020] (l)PCR擴增具有如SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列的肌酸激酶親本，擴增引物對 如下
[0021] ckm-F:5 ' GACATATGAGAGGGTTTATAATTGGT 3 '，
[0022] ckm-R:5'GAGGATCCTTATTTGTCTGTCTGAGCTAAT 3'；
[0023] (2)步驟(1)擴增的產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后與載體連接，得質(zhì)粒A;
[0024] (3)以步驟(2)得到的質(zhì)粒A為模板，PCR擴增得F-DR片段，擴增引物對如下
[0025] ckm-F:5 ' GACATATGAGAGGGTTTATAATTGGT 3 '，
[0026] 121DR:5'TTAATAACTTCAACAACTGCTTTAGGAACCA 3'；
[0027] (4)以步驟(2)得到的質(zhì)粒A為模板，PCR擴增得DF-R片段，擴增引物對如下
[0028] 121DF:5'GCAGTTGTTGAAGTTATTAAAGAAATAAAAGGTGT 3'，
[0029] ckm-R:5 ' GAGGATCCTTATTTGTCTGTCTGAGCTAAT 3 '；
[0030] (5)以步驟(3)得到的F-DR片段以及步驟(4)得到的DF-R片段為模板，PCR擴增得全 長突變體基因 L121D，擴增引物對如下
[0031] ckm-F:5 ' GACATATGAGAGGGTTTATAATTGGT 3 '，
[0032] ckm-R：5'GAGGATCCTTATTTGTCTGTCTGAGCTAAT 3'；
[0033] (6)步驟(5)得到的L121D經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后與載體連接，得質(zhì)粒B;
[0034] (7)將步驟(6)得到的質(zhì)粒B轉(zhuǎn)化感受態(tài)細菌細胞中，對轉(zhuǎn)化細菌進行增殖培養(yǎng)并 誘導(dǎo)表達，然后進行細胞破碎處理，提取即得肌酸激酶突變體。
[0035] 本發(fā)明提供的上述肌酸激酶突變體的制備方法中，載體優(yōu)選為pRSET-A。當然，其 還可采用任何適用的其他載體，例如:包括PRSET和pES21在內(nèi)的原核表達載體、包括pUCl 8/ 19和pBluscript-SK在內(nèi)的克隆載體等。
[0036] 本發(fā)明提供的上述肌酸激酶突變體的制備方法中，所獲得的肌酸激酶突變體基因 可以在原核細胞或真核細胞胞內(nèi)表達，也可采用本領(lǐng)域已知的任何其它適當方法實現(xiàn)在原 核細胞或真核細胞胞外表達。
[0037] 本發(fā)明提供的上述肌酸激酶突變體的制備方法中，載體的宿主細胞可以是包括大 腸桿菌在內(nèi)的原核細胞，也可以是包括釀酒酵母和畢赤巴斯德酵母在內(nèi)的真核細胞。
[0038] 有益效果：
[0039] 本發(fā)明提供的磷酸肌酸的生物催化生產(chǎn)方法除具備傳統(tǒng)的生物催化方法所共同 具備的反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)速度快、專一性強及低碳環(huán)保等優(yōu)點之外，還兼具目前現(xiàn)有的磷 酸肌酸的生物催化方法所不具備的產(chǎn)率高、成本低、適于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的優(yōu)點。前述后 一部分優(yōu)點的獲得在本發(fā)明中主要來源于以下兩個方面：1、經(jīng)酶活性測定，本發(fā)明人工誘 導(dǎo)獲得的具有如SEQ ID N0:3所示的氨基酸序列的肌酸激酶突變體的比活性較肌酸激酶親 本高出52% ;2、經(jīng)過固定化的肌酸激酶突變體具有更高的活力和更好的穩(wěn)定性，可提高酶 重復(fù)使用率。經(jīng)試驗證實，本發(fā)明提供的生物催化方法使肌酸轉(zhuǎn)化為磷酸肌酸的轉(zhuǎn)化率超 過 85 %。
【具體實施方式】
[0040] 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步的詳細說明，以下實施例是對本發(fā)明的解 釋，本發(fā)明并不局限于以下實施例，實施例中未注明具體條件者，按常規(guī)條件或制造商建議 的條件進行。
[0041 ] 實施例1
[0042]肌酸激酶親本基因的擴增與克隆
[0043] 肌酸激酶親本系指來自O(shè)ryctolagus cuniculus的肌酸激酶(CKM)，其核苷酸序列 如SEQIDN0:l所示（參考GenBankNM_001082239)，氨基酸序列如SEQIDN0:2所示（參考 GenBank ΝΡ_00 1075708 )。根據(jù)肌酸激酶親本的基因序列設(shè)計引物對ckm-F: 5' GACATATGAGAGGGTTTATAATTGGT 3 ' 和ckm-R: 5 ' GAGGATCCTTATTTGTCTGTCTGAGCTAAT 3 '。用引 物對ckm_F和ckm-R從Oryctolagus cuniculus cDNA文庫中擴增肌酸激酶編碼基因。
[0044] 擴增條件為：20mM Tris-HCl(pH 8.8)，10mM KCl，10mM(NH4)2S〇4,2mM MgS〇4， 0.1%Triton X-100,50mM dATP，50mM dTTP，50mM dCTP，50mM dGTP，400nM引物ckm-F， 400nM引物ckm-R，100ng cDNA，1.0U Pfu DNA聚合酶（Promega，USA)，再用無菌水調(diào)反應(yīng)體 積至50ml。
[0045] PCR擴增反應(yīng)程序為:95°C3分鐘，35圈循環(huán):95°C50秒、50°C30秒和72°C1分鐘，最 后7 2 °C 10分鐘。擴增的產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶Nd e I和BamH I酶切后與經(jīng)同樣限制性內(nèi)切酶 Ndel和BamHI酶切的載體pRSET-A(源自 Invitrogen，USA)連接，得質(zhì)粒pRSET-ckm。經(jīng)DNA測 序，確定該被克隆的肌酸