一種用MspI鑒定人HOTAIR基因多態(tài)性rs920778的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[00011本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種用MspI鑒定人HOTAIR基因多態(tài)性rs920778的 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP)，主要是指在基因組水 平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性，包括剪輯的置換/插入和缺失等形式。 SNP是人類可遺傳的變異中最常見的一種，現(xiàn)已廣泛用于簡單和復(fù)雜疾病的遺傳連鎖分析/ 關(guān)聯(lián)分析及疾病易感基因的定位，指導(dǎo)易感基因克隆.較常見的單堿基多態(tài)性位點(diǎn)的檢測 方法包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)(PCR-RFLP)，三引物等位基因擴(kuò)增 法(TP-PCR)和測序等方法。這些方法雖各有優(yōu)點(diǎn)，但也各有其不足之處。
[0003] PCR-RFLP是一種快速，簡便，準(zhǔn)確的檢測SNP基因型的經(jīng)典方法.其原理是：限制性 內(nèi)切酶是一類識別DNA特異位點(diǎn)(通常4-6bp)，并在特異位點(diǎn)進(jìn)行切割的酶類。酶切位點(diǎn)的 特異性意味著對特定等位基因的完全消化會(huì)產(chǎn)生同樣的片段序列。而堿基的置換，插入和 缺失可以產(chǎn)生或消除一個(gè)特定酶切位點(diǎn)，從而改變酶切后產(chǎn)生片段的大小和數(shù)目。這些酶 切片段帶型的不同稱為限制性片段長度多態(tài)性。如果SNP產(chǎn)生和消除了某個(gè)限制性內(nèi)切酶 位點(diǎn)，則可以通過對PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切、電泳加以檢測。改方法的優(yōu)點(diǎn)在于快速簡單，終點(diǎn)判 斷準(zhǔn)確。但其主要缺點(diǎn)在于酶切位點(diǎn)的選擇，要求待測多態(tài)性位點(diǎn)和某一酶切位點(diǎn)相關(guān)。酶 的選擇具有局限性，并不是所有的SNP位點(diǎn)都可以用這種方法來鑒別，且部分內(nèi)切酶價(jià)格昂 貴，實(shí)驗(yàn)成本高。三引物等位基因擴(kuò)增法(TP-PCR)-種不需要限制性內(nèi)切酶和連接酶的重 組DNA方法。反應(yīng)體系中有2種模板和3種引物，從而在同一個(gè)反應(yīng)體系中產(chǎn)生一個(gè)重組DNA 分子。這種方法的主要優(yōu)點(diǎn)是快速，不依賴連接片段的限制酶位點(diǎn)。但其缺點(diǎn)是擴(kuò)增效率 低，擴(kuò)增特異性差，無法保證PCR產(chǎn)物的特異性和穩(wěn)定性，分型結(jié)果易造成誤判。Taqman熒光 探針法是一種新型高效準(zhǔn)確的基因分型方法，其優(yōu)點(diǎn)是檢測靈敏度高，分型準(zhǔn)確。但該方法 需要昂貴的儀器和較長的步驟，成本較高。
[0004] 人同源異型盒（Η0Χ)基因座的反義RNA(H0X antisense intergenic RNA，H0TAIR) 位于人類染色體12ql3.13，長約2.2kb.越來越多的證據(jù)表明HOTAIR與原發(fā)性乳腺癌的轉(zhuǎn) 移和預(yù)后密切相關(guān)。HOTAIR可通過募集核心蛋白復(fù)合體(Polycomb repressive complex 2，PRC2)連接到同源異型盆位點(diǎn)(homebox D，hoxD)，引起組蛋白H3賴氨酸(27位）甲基化，導(dǎo) 致腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)連接黏附分子2( junctional adhesion molecule 2,JAM2)、人原|丐黏素1 (protocadherin 1，PCDH1)等多個(gè)腫瘤抑制基因沉默，促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移3.
[0005] rs920778位于人HOTAIR的2號內(nèi)含子上（美國國立衛(wèi)生研究院國立醫(yī)學(xué)圖書館生 物信息技術(shù)中心，http: //www.ncbi .nlm.nih. gov)。通常該多態(tài)在人群中存在三種HOTAIR 基因的基因型:CC型（人基因組rs920778多態(tài)位點(diǎn)的兩個(gè)等位基因堿基均為C)，CT型（人基 因組rs920778多態(tài)位點(diǎn)的兩個(gè)等位基因堿基分別為C和T)和TT型（人基因組rs920778多態(tài) 位點(diǎn)的兩個(gè)等位基因堿基均為T)。
[0006] 目前人HOTAIR基因多態(tài)rs920778的鑒定長采用PCR-RFLP方法。目前鑒定人HOTAIR 基因多態(tài)rs920778時(shí)常使用的限制性內(nèi)切酶價(jià)格昂貴(關(guān)于部分內(nèi)切酶的參考價(jià)格可參考 后面的表1)，實(shí)驗(yàn)成本高，難以在實(shí)驗(yàn)室中普及使用。
[0007] 因此，本領(lǐng)域存在對操作簡單，成本低，使用范圍廣的新型檢測SNP方法的需求。本 領(lǐng)域迫切需要在節(jié)約實(shí)驗(yàn)成本的前提下，通過PCR-RFLP技術(shù)的改進(jìn)，來開發(fā)經(jīng)濟(jì)、快速的檢 測人HOTAIR rs920778基因多態(tài)性的試劑盒。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，本發(fā)明提供一種用MspI鑒定人HOTAIR基因多態(tài) 性rs920778的方法，通過創(chuàng)造酶切位點(diǎn)法(Created Restriction Site PCR，CRS-PCR)，應(yīng) 用引物3'端錯(cuò)配技術(shù)，在PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切電泳后進(jìn)行基因型的鑒定，從而提供一種操作簡 單、成本低、適用范圍廣泛的檢測人HOTAIR多態(tài)性rs920778的方法及檢測試劑盒。
[0009] 其技術(shù)方案如下：
[0010] 一種用MspI鑒定人HOTAIR基因多態(tài)性rs920778的方法，包括以下步驟：
[0011] (a)抽提樣品的基因組DNA;
[0012] (b)提供擴(kuò)增人HOTAIR基因多態(tài)性rs920778位點(diǎn)附近序列的正向引物和反向引 物，以所述待測人基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，獲取擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0013] (c)使用限制性內(nèi)切酶對所述擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，獲取相應(yīng)的酶切產(chǎn)物；
[0014] (d)將酶切產(chǎn)物采用3 %的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，以判定Η0 T AIR基因多態(tài)性 rs920778的各基因型。
[0015]優(yōu)選地，所述反向引物其3'末端倒數(shù)第一位堿基與多態(tài)rs920778堿基相鄰，倒數(shù) 第二位堿基為錯(cuò)配堿基C，以便在擴(kuò)增產(chǎn)物中與多態(tài)C等位基因形成CCGG結(jié)構(gòu)，第二個(gè)堿基C 為多態(tài)等位基因，第四個(gè)堿基G為錯(cuò)配堿基。
[0016] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果：
[0017] 本發(fā)明針對使用CRS-PCR鑒定HOTAIR rs920778多態(tài)性，對傳統(tǒng)PCR-RFLP法進(jìn)行改 進(jìn)，應(yīng)用了引物3,端錯(cuò)配技術(shù)，克服了傳統(tǒng)PCR-RFLP法內(nèi)切酶選擇余地小，價(jià)格昂貴，實(shí)驗(yàn) 成本高等缺點(diǎn)，本發(fā)明建立的HOTAIR rs920778多態(tài)性的檢測方法，內(nèi)切酶價(jià)格十分便宜， 同時(shí)PCR產(chǎn)物純度較高，酶切結(jié)果易于分辨。該檢測方法通過測序驗(yàn)證，其結(jié)果準(zhǔn)確可靠。
【附圖說明】
[0018] 圖1是HOTAIR rs920778位點(diǎn)的電泳圖譜；
[0019] 圖2是HOTAIR rs920778位點(diǎn)CC基因型測序圖譜；
[0020] 圖3是HOTAIR rs920778位點(diǎn)CT基因型測序圖譜；
[0021] 圖4是HOTAIR rs920778位點(diǎn)TT基因型測序圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0022]下面結(jié)合附圖和實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案。
[0023]通過本發(fā)明的方法可以通過引物上的錯(cuò)配堿基將SNP附近的序列改變?yōu)榭杀活A(yù)先 確定的限制性內(nèi)切酶識別的序列。因此，可以克服傳統(tǒng)的PCR-RFLP方法所存在的需要采用 昂貴內(nèi)切酶的缺陷，進(jìn)而大大降低了檢測SNP的成本。具體而言，由于在該反向引物序列中 倒數(shù)第二位堿基為錯(cuò)配堿基C(該堿基在人HOTAIR基因序列中的相應(yīng)位置為T)，因此錯(cuò)配后 PCR產(chǎn)物中多態(tài)附近序列由CCGT或CTGT更改為CCGG或CTGG(其中第二個(gè)堿基C/T多態(tài)位點(diǎn)， 第四個(gè)堿基G為錯(cuò)配堿基）。因此擴(kuò)增產(chǎn)物中C等位基因片段可被識別CCGG序列的限制性內(nèi) 切酶識別（即C等位基因片段可被內(nèi)切酶切開）。進(jìn)而，可以根據(jù)片段切開情況來判斷多態(tài)基 因型。更具體地，經(jīng)序列分析可知，基因原始序列中C/T多態(tài)可由表1中前三種內(nèi)切酶識別。 如通過堿基錯(cuò)配PCR將多態(tài)性位點(diǎn)后面第二位堿基T改變?yōu)镚，則該多態(tài)為C等位基因經(jīng)PCR 擴(kuò)增后包含CCGG序列可被識別CCGG序列的限制性內(nèi)切酶識別(如MspI，HpaII)，而T等位基 因不能切開。
[0024]經(jīng)序列分析發(fā)現(xiàn)，檢測該C/T多態(tài)的方法可使用表一中的5種酶，其中表中前三種 酶價(jià)格昂貴，且酶切效果不理想。在采用創(chuàng)造酶切位點(diǎn)法（Created Restriction Site PCR，CRS-PCR)對反向引物序列中倒數(shù)第二位堿基錯(cuò)配為C后，PCR產(chǎn)物中多態(tài)附近序列生成 CCGG序列，從而可被限制性內(nèi)切酶MspI，HpaII識別。由于識別特定位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶 MspI適用范圍廣，價(jià)錢較為經(jīng)濟(jì)，進(jìn)而大大降低了檢測SNP的成本。因此，綜合考慮簡單操作 性與經(jīng)濟(jì)實(shí)用性，限制性內(nèi)切酶MspI是不二選擇。
[0025] 表1中提供的限制性內(nèi)切酶的價(jià)格從NEB公司(http://www.neb-china.com)，限制 性內(nèi)切酶的選擇從WatCut限制性內(nèi)切酶分析軟件上獲取(http: //watcut · uwater loo · ca/ template.php?act = snp_new)，以此作為限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)和價(jià)格的參考。
[0026] 表1幾種限制性內(nèi)切酶識別序列及其價(jià)格
[0027]
[0028]在本發(fā)明的實(shí)施方案中，正向引物和反向引物的設(shè)計(jì)采用Primer6.0軟件進(jìn)行，設(shè) 計(jì)的原則綜合考慮引物對PCR擴(kuò)增的靈敏度、特異度以及擴(kuò)增效率的影響。按照堿基互不配 對的原則設(shè)計(jì)引物，引物長度一般在15~30堿基之間，過長或短均會(huì)造成特異性差，過長還 會(huì)導(dǎo)致其延伸溫度大于74°C，不適于TaqDNA聚合酶進(jìn)行反應(yīng)。引物GC含量在40 %~60 %之 間，Tm值最好接近72°C，GC含量過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)。堿基要隨機(jī)分布，引物自身 及引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，否則引物自身會(huì)折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)使引物本身復(fù)性。引物5' 端和中間AG值應(yīng)該相對較高，而3'端AG值較低。擴(kuò)增產(chǎn)物的單鏈不能形成