用于檢測多種呼吸道病原體的pcr引物組、探針組及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及用于檢測多種呼吸道病原體的PCR引物組、探針組及試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 呼吸道感染是臨床最常見的疾病之一，可由多種病原體引起，其中包括細(xì)菌、病 毒、支原體、衣原體等。其中急性呼吸道感染(Acute Respiratory Tract Infection，ARTI) 是世界范圍內(nèi)導(dǎo)致兒童患病和死亡的重要原因。世界衛(wèi)生組織(WH0)2005年在《柳葉刀》雜 志發(fā)表文章報(bào)道:在2000-2003年，每年1060萬5歲以下死亡兒童中，因傳染性疾病死亡占 54 %，其中因肺炎死亡的患兒占19 %。ARTI的嚴(yán)格定義是所有的呼吸道感染，然而，實(shí)際上， 在嚴(yán)重呼吸道疾病中急性下呼吸道占據(jù)大多數(shù)，占世界范圍內(nèi)學(xué)齡前兒童死亡總數(shù)的 20%，其中90%為肺炎。大量的證據(jù)表明，營養(yǎng)不良、低出生體重、被動(dòng)吸煙、人工喂養(yǎng)、經(jīng)濟(jì) 困難、居住環(huán)境擁擠、免疫功能缺陷、HIV感染是嚴(yán)重ARTI的危險(xiǎn)因素，因此，大多數(shù)因急性 呼吸道感染死亡的病例發(fā)生在發(fā)展中國家。ARTI主要的致病微生物包括細(xì)菌和病毒，還包 括一些非典型病原體，如真菌、支原體、衣原體等，根據(jù)臨床癥狀和影像報(bào)告臨床工作者很 難將它們區(qū)分，因此病原分析對(duì)于臨床診斷和治療至關(guān)重要。
[0003] 傳統(tǒng)檢測呼吸道病原體的方法主要有培養(yǎng)方法、生化方法和免疫方法等，培養(yǎng)法 操作復(fù)雜，檢測周期長、費(fèi)用高，不適合作為臨床樣品的常規(guī)檢測。生化檢測方法操作簡單、 快速，費(fèi)用低，是目前門診檢驗(yàn)的常規(guī)檢測方法;但該方法靈敏度和特異性不高，影響因素 多，不能區(qū)分病原體的具體種類。免疫檢測方法快速簡便;但一個(gè)檢測只能針對(duì)其中一種病 原體。
[0004] 隨著醫(yī)療水平的發(fā)展，用上述傳統(tǒng)的方法已經(jīng)不能滿足對(duì)呼吸道病原體的檢測， 臨床上需要一種能夠靈敏、特異，并且快速、簡便的呼吸道多病原體鑒定檢測方法，以便能 夠更好的做到個(gè)體化的治療、并滿足對(duì)衛(wèi)生防疫和疫情控制、進(jìn)行傳染病流行病學(xué)研究的 需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的主要目的在于提出一種準(zhǔn)確、快速、靈敏的用于檢測多種呼吸道病原體 的PCR引物組、探針組、PCR反應(yīng)液及試劑盒。
[0006] 其中，所述PCR引物組包括以下至少兩對(duì)引物對(duì)：
[0007] 由序列表中SEQ ID NO. 1和SEQ ID N0.2所示的兩條序列組成的針對(duì)腺病毒的引 物對(duì)；
[0008] 由序列表中SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示的兩條序列組成的針對(duì)博卡病毒的 引物對(duì)；
[0009] 由序列表中SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.6所示的兩條序列組成的針對(duì)嗜肺軍團(tuán)菌 的引物對(duì)；
[0010]由序列表中SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.8所示的兩條序列組成的針對(duì)百日咳博德 特氏菌的引物對(duì)；
[0011]由序列表中SEQ ID N0.9和SEQ ID N0.10所示的兩條序列組成的針對(duì)肺炎衣原體 的引物對(duì)；
[0012]由序列表中SEQ ID N0.11和SEQ ID N0.12所示的兩條序列組成的針對(duì)肺炎支原 體的引物對(duì)。
[0013]所述探針組包括以下至少兩條分子信標(biāo)探針：
[0014]由序列表中SEQ ID N0.13所示的序列或其反向互補(bǔ)序列組成的針對(duì)腺病毒的分 子信標(biāo)探針；
[0015] 由序列表中SEQ ID N0.14所示的序列或其反向互補(bǔ)序列組成的針對(duì)博卡病毒的 分子信標(biāo)探針；
[0016] 由序列表中SEQ ID N0.15所示的序列或其反向互補(bǔ)序列組成的針對(duì)嗜肺軍團(tuán)菌 的分子信標(biāo)探針；
[0017] 由序列表中SEQ ID N0.16所示的序列或其反向互補(bǔ)序列組成的針對(duì)百日咳博德 特氏菌的分子信標(biāo)探針；
[0018] 由序列表中SEQ ID N0.17所示的序列或其反向互補(bǔ)序列組成的針對(duì)肺炎衣原體 的分子信標(biāo)探針；
[0019] 由序列表中SEQ ID N0.18所示的序列或其反向互補(bǔ)序列組成的針對(duì)肺炎支原體 的分子信標(biāo)探針；
[0020] 每一條分子信標(biāo)探針的兩端分別帶有熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)。
[0021] 優(yōu)選地，每一條所述分子信標(biāo)探針的整體為莖環(huán)結(jié)構(gòu)，兩端為互補(bǔ)的莖結(jié)構(gòu)，中間 為與對(duì)應(yīng)呼吸道病原體擴(kuò)增產(chǎn)物特異雜交的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。
[0022]優(yōu)選地，每一條所述分子信標(biāo)探針的熔解溫度范圍在55°C~80°C，至少兩條所述 分子信標(biāo)探針中若具有相同的熒光基團(tuán)，則具有相同熒光基團(tuán)標(biāo)記的分子信標(biāo)探針的Tm設(shè) 計(jì)成一定的梯度，差異在2°C以上。
[0023] 優(yōu)選地，所述熒光基團(tuán)選自FAM、HEX和TAMRA，所述淬滅基團(tuán)為Dabcy 1。
[0024] 其中，所述PCR反應(yīng)液，包含所述的PCR引物組和所述的探針組
[0025] 所述的試劑盒包括至少一人份所述的PCR反應(yīng)液。
[0026] 本發(fā)明的有益效果包括：
[0027] 采用本發(fā)明的技術(shù)方案，可以檢測并鑒別多種呼吸道病原體，而且該方法操作簡 便、檢測準(zhǔn)確、靈敏、快速，4小時(shí)內(nèi)可出結(jié)果。本發(fā)明利用多重PCR熒光分子信標(biāo)熔解曲線技 術(shù)，PCR擴(kuò)增后直接對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行熔解曲線分析，無需開蓋分析，可有效避免產(chǎn)物污染;多色熒 光和熔解曲線相結(jié)合，保證了檢測的足夠通量，可進(jìn)行多病原體的分型檢測，應(yīng)用分子信標(biāo) 探針技術(shù)，檢測的特異性高，成本較低，適合在臨床大量推廣使用。
【附圖說明】
[0028]圖1為本發(fā)明【具體實(shí)施方式】中的腺病毒(AdV)、博卡病毒(HBoV)的熒光熔解曲線 圖；
[0029]圖2為本發(fā)明【具體實(shí)施方式】中的嗜肺軍團(tuán)菌(LP)、百日咳博德特氏菌(BP)的熒光 熔解曲線圖；
[0030] 圖3為本發(fā)明【具體實(shí)施方式】中的肺炎衣原體(CP)、肺炎支原體(MP)的熒光熔解曲 線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0031] 本發(fā)明涉及對(duì)多種呼吸道病原體分型檢測的PCR引物組、探針組、PCR反應(yīng)液及試 劑盒。下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)該強(qiáng)調(diào)的是，下述說明 僅僅是示例性的，而不是為了限制本發(fā)明的范圍及其應(yīng)用。
[0032] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，對(duì)多種呼吸道病原體檢測的PCR引物組、探針組、PCR反應(yīng)液 及試劑盒將用于以下6種呼吸道病原體中的至少2種的分型檢測，分別為：腺病毒、博卡病 毒、嗜肺軍團(tuán)菌、百日咳博德特氏菌、肺炎衣原體和肺炎支原體。
[0033] 在一些實(shí)施例中，可以通過PCR擴(kuò)增待檢者的鼻咽拭子呼吸道病原體的保守基因 片段，其中PCR引物序列優(yōu)選為以下表1中的至少一對(duì)：
[0034] 表 1
[0035]
[0036] 其中，"F"表示上游引物，"R"表示下游引物。
[0037] 在一些實(shí)施例中，采用如下6條針對(duì)呼吸道病原體的分子信標(biāo)探針中的至少兩條， 分子信標(biāo)探針的兩端分別標(biāo)記熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)，探針序列如下表2:
[0038] 表2
[0039]
[00411其中FAM、HEX、TAMRA為熒光基團(tuán)，Dabcyl為淬滅基團(tuán)。每一條分子信標(biāo)探針的熔解 溫度范圍在55°C~80°C，具有相同的熒光基團(tuán)的分子信標(biāo)探針的Tm設(shè)計(jì)成一定的梯度，即 差異在2°C以上。
[0042] 當(dāng)然，在其他實(shí)施例中，每一條分子信標(biāo)探針的熒光基團(tuán)可以相同也可以不同，各 序列對(duì)應(yīng)的熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)不限于上述特定類型，且熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的位置也可 以互換。
[0043] 在其他實(shí)施例中，除了上述表2中的序列之外，本發(fā)明的分子信標(biāo)探針的序列還可 以是對(duì)應(yīng)于上述各序列的反向互補(bǔ)序列。
[00