一種基于唾液蛋白檢測糖鏈標志物的凝集素芯片及其方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種用于檢測糖鏈標志物的凝集素芯片，具體涉及一種基于蛋白檢測 糖鏈標志物的凝集素芯片及其方法。
【背景技術】
[0002] 胃癌是一類常見的惡性腫瘤，由于缺乏顯著的早期特征，在全球范圍內(nèi)具有很高 的發(fā)病率和死亡率，在東亞、東歐、南美地區(qū)尤為嚴重。目前常用的胃癌診斷標志物包括： CEA、CA19-9、CA72-4、CA125、AFP等，但都存在局限性。病理組織學檢查仍是目前胃癌診斷的 金標準，但鑒于組織學檢查固有的缺陷如損傷性檢查、不能動態(tài)檢測、存在取樣差異等，因 此尋求非損傷性檢查，進行胃癌早期診斷，是防控胃癌的關鍵。
[0003]隨著社會的進步，科學技術的發(fā)展，人們對醫(yī)學檢查的要求也越來越高，要求無 倉|J、簡便、快速的疾病檢查診斷方法。與血清標本相比，唾液采集安全方便、無創(chuàng)傷和無血源 性疾病傳播的危險，而且近年來，唾液作為臨床樣本已被廣泛應用于多種疾病諸如艾滋病、 自身免疫性疾病、酒精性肝硬化、囊性纖維病、糖尿病、心血管病、齲病等的藥物水平監(jiān)測、 病情監(jiān)控和療效評價當中。
[0004] 研究發(fā)現(xiàn)腫瘤發(fā)生時，蛋白質糖基化的異常會導致糖鏈發(fā)生種類和豐度的改變， 相應的和這些糖鏈相互作用的糖結合蛋白的表達也發(fā)生異常改變，從變化的唾液糖蛋白糖 鏈中可以找到與疾病相關的生物標志物。
[0005] 隨著分子生物學及細胞生物學的發(fā)展，糖蛋白糖型被更多的研究者所關注，糖鏈 與糖鏈，糖鏈與蛋白，糖鏈與細胞外基質的相互作用調控細胞識別、信號傳遞、細胞內(nèi)吞以 及細胞生長、分化和凋亡等生物學行為。
[0006] 例如在胃癌的研究方面已發(fā)現(xiàn)了一些功能性糖鏈，其中有代表性的是胃癌細胞中 N-乙酰葡糖氨轉移酶V(GnT-V)上調表達導致合成β1，6連接的N-乙酰葡糖胺分支型N-糖鏈 (β?，6GlcNAc branched N-Glycan)，這種分支型糖鏈影響了連環(huán)蛋白絡氨酸磷酸化，導致β 連環(huán)蛋白和Ρ120蛋白的受損，破壞了連環(huán)蛋白與Ν-糖鏈結合的穩(wěn)定性，影響了細胞間的粘 著能力，增加了細胞的轉移侵染能力。以及胃癌細胞中核心巖藻糖基化Ν-糖鏈的下調以及α GlcNAc的減少，提高了腫瘤細胞有絲分裂活性，導致細胞異常增殖。
[0007] 上述研究說明在疾病中糖蛋白的糖基化發(fā)生了異常改變，而不同疾病，其功能性 糖鏈與細胞外基質作用發(fā)生的異常改變不同，通過檢測這種異常改變，我們可以判斷為何 種疾病。
[0008] 隨著糖生物學與糖組學研究的發(fā)展，生物芯片已成為取得相關信息的重要手段， 提供了快速、高效高通量篩選差異糖鏈的方法，從全新的角度解析了胃癌發(fā)生、發(fā)展過程中 潛在的分子機制以及發(fā)現(xiàn)新的生物標志物，凝集素芯片通過固定于芯片上的凝集素探針與 樣品中糖蛋白糖鏈特異性結合，能夠檢測出樣品中糖蛋白糖鏈結構和連接方式的異常變 化，是研究糖蛋白糖鏈結構變化最有效的分析工具之一。且可以與多種檢測手段聯(lián)用，快 速、準確檢測出待測樣本中糖鏈數(shù)量及種類的差異。具有檢測樣品用量少、高通量、靈敏度 極高的優(yōu)點，有助于發(fā)展新的診斷和監(jiān)測胃癌的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的在于提供一種非損傷，通過鑒別唾液中蛋白檢測糖鏈標志物的凝集 素芯片及其方法。
[0010] 本發(fā)明提供一種基于唾液蛋白檢測糖鏈標志物的凝集素芯片，包括測試凝集素探 針組，所述測試凝集素探針組包括蠶豆凝集素(VVA)、橙黃網(wǎng)胞盤菌凝集素(AAL)、豌豆凝集 素(PSA)、四棱豆凝集素-n(PTL-n)和四棱豆凝集素-I(PTL-I)，其中四棱豆凝集素 -Π (PTL-Π )和四棱豆凝集素-I(PTL-I)作為內(nèi)參凝集素。
[0011] 上述凝集素探針組還包括花生凝集素(PNA)、歐洲衛(wèi)矛凝集素(EEL)、番茄凝集素 (LEL)和孤挺花凝集素(HHL)。
[0012] 本發(fā)明還提供基于唾液蛋白檢測糖鏈標志物的方法，包括唾液采集、唾液蛋白處 理與熒光標記、凝集素芯片制備及孵育和對熒光圖像進行中值分析步驟，所述凝集素芯片 制備及孵育步驟中凝集素芯片采用蠶豆凝集素(VVA)、橙黃網(wǎng)胞盤菌凝集素(AAL)、豌豆凝 集素(PSA)、四棱豆凝集素-n(PTL-n)和四棱豆凝集素-I(PTL-I)做芯片矩陣，其中四棱豆 凝集素 -Π (PTL-Π )和四棱豆凝集素-I(PTL-I)作為內(nèi)參凝集素。
[0013] 所述凝集素芯片中還包括花生凝集素(PNA)、歐洲衛(wèi)矛凝集素(EEL)、番茄凝集素 (LEL)和孤挺花凝集素(HHL)。
[0014] 上述對熒光圖像進行中值分析后，檢測標志物的方法檢測標準為:將熒光圖像進 行中值分析的Fold-change值作為判定標準，最低標準為，PTL-Π 和PTL-I無變化，VVA上調， 同時AAL、PSA都下調;最高標準為，PTL-Π 和PTL-I無變化，VVA、PNA、EEL、LEL、HHL都上調，同 時AAL、PSA都下調。
[0015] 所述Fold-change >2和Fold_change〈0 · 5上調和下調表達的糖鏈，所述Fold-change值是通過將樣品每個凝集素對應的歸一化后熒光強度比基礎對照組的歸一化后熒 光強度得到。
[0016] 所述基礎對照組為從健康人群提取的唾液樣品。
[0017]對熒光圖像進行中值分析步驟中通過軟件將芯片掃描結果圖轉化為數(shù)據(jù)，將原始 數(shù)據(jù)中小于背景值加兩倍背景標準偏差的值去掉，每張芯片上每個樣本6個重復點的有效 值再取平均值(AS)，每組平均值表示為組內(nèi)每個樣本平均值(AS)的均值(AG) 土標準偏差 (SDG)，得到歸一化后熒光強度(NFI)。
[0018]本發(fā)明中唾液采集、唾液蛋白處理與熒光標記、凝集素芯片制備及孵育步驟分別 如下所示： (1) 唾液采集： 飯后兩小時，約9點到10點之間，生理鹽水漱口三次后迅速采集自然分泌的全唾液，唾 液采集至少1 ml并立即置于冰上，加入蛋白酶抑制劑(每毫升唾液加入lyL)防止蛋白降解； (2) 唾液蛋白處理與熒光標記： 將收集到的全唾液經(jīng)12 000 rpm 4°C離心10 min后吸取上清棄去不溶沉淀物，上清液 再經(jīng)0.22 μπι孔徑的濾膜過濾，過濾后樣本經(jīng)Cy3熒光染料標記后用除鹽柱去掉游離熒光； (3) 凝集素芯片制備及孵育： 1) 玻片的環(huán)氧修飾 將玻片用無水乙醇清洗三次，每次lOmin，甩干浸泡入250mL 10%Na0H溶液中，避光，搖 床上反應12h后超聲15min，超純水清洗四次，每次2min，無水乙醇清洗兩次，每次2min，甩 干，再將玻片浸泡到200mL 10% GPTS溶液中，避光，搖床上孵育反應3h，對玻片進行環(huán)氧化 修飾，超聲清洗15min，無水乙醇清洗三次，每次lOmin，甩干后將玻片干燥3h，保存?zhèn)溆茫?2) 凝集素芯片的制備 設計凝集素芯片矩陣，選用lmg/mL BSA作陰性質控，Cy3熒光染料標記的BSA作位置標 記，與5種凝集素共同構成6 X 7矩陣，每種凝集素重復點樣6次，每張芯片上重復8個矩陣，在 384孔板中按矩陣設計順序依次加入配制好的點樣液，在環(huán)氧修飾片基上點制芯片，在室溫 且濕度為55%~65%的環(huán)境中孵育6h后，37°C真空干燥芯片，使凝集素固定于芯片上，將制備 好的凝集素芯片放置于4°C干燥器，避光保存，備用； 3) 凝集素芯片的封閉 將點制好的凝集素芯片從4°C干燥器中取出，回溫，首先用PBST、PBS各清洗玻片一次， 每次3 min，離心甩干，將凝集素芯片與600 μL封閉緩沖液在芯片雜交盒中孵育，25°C旋轉 反應1 h，封閉結束后用PBST、PBS各清洗玻片兩次，每次3 min，甩干； 4) 唾液樣本的凝集素芯片檢測 將熒光標記的唾液蛋白3 yg與孵育緩沖液混勻，配置成600μ1上樣體系，并均勻加載在 蓋玻片上，蓋上封閉后的凝集素芯片，于芯片雜交儀中25°C避光旋轉孵育3 h，孵育結束后 用PBST、PBS各清洗玻片兩次，每次5 min，離心甩干。
[0019] 本發(fā)明具有如下有益效果： 本發(fā)明通過固定于芯片上的特定凝集素探針與樣品中糖蛋白糖鏈特異性結合，可以快 速檢測出樣品中糖蛋白糖鏈結構和連接方式變化后的標志物，通過標志物的變化，迅速判 斷出是否樣品中功能性糖鏈變化對應是否產(chǎn)生胃部癌變。
【附圖說明】
[0020] 圖1、2為本發(fā)明凝集素芯片上兩種凝集素探針布局圖； 圖3-7分別為5種凝集素卩11-1、？11-11、164、?￥1、5嫩識別的糖鏈； 圖8為PTL-I與PTL-II的相對熒光信號值； 圖9-15分別為7種凝集素芯片VVA、PNA、EEL、LEL、HHL、AAL、PSA的結果散點圖。
【具體實施方式】
[0021] 下面通過給出的具體實施例對本發(fā)明做進一步說明，但不作為對本發(fā)明的限定。 [0022]選取健康志愿者12例，且一周之內(nèi)未服用任何藥物，已確診的胃癌患者64例（胃癌 I期21例，二期18例，三期20例，四期5例），其年齡分布如表1所示。
[0023]表 1
將健康志愿者作為基礎對照組，已確證的胃癌患者作為樣品組。
[0024] (1)唾液采集： 將上述人群在飯后2小時，即9-10點之間，用生理鹽水漱口三次后迅速采集自然分泌的 全唾液，唾液采集至少lml并立即置于冰上，加入蛋白酶抑制劑防止蛋白降解，每毫升唾液 加入lyL; (2) 唾液蛋白處理與熒光標記： 將收集的全唾液經(jīng)12000 rpm 4°C離心10 min后吸取上清棄去不溶沉淀物，上清液再 經(jīng)0.22 μπι孔徑的濾膜過濾掉細菌和其它微生物，過濾后樣本經(jīng)Cy3熒光染料標記后用 Sephadex G-25除鹽柱去掉游離熒光，標記好的蛋白準備用于凝集素芯片孵育； (3) 凝集素芯片制備及孵育： 1) 玻片的環(huán)氧修飾 將未處理的玻片用無水乙醇清洗三次，每次lOmin，離心甩干后將玻片浸泡入250mL10% NaOH溶液中，搖床上輕搖反應，避光過夜，超聲15min，再用超純水清洗4次，每次2min，無水 乙醇清洗2次，每次2min，甩干離心后再將玻片浸泡到200mL10%GPTS溶液中，搖床上輕搖，避 光反應3h，然后超聲清洗15min，無水乙醇清洗3次，每次lOmin，離心甩干，完成芯片的環(huán)氧 化修飾，將修飾好的玻片放置于4°C干燥器中保存?zhèn)溆茫?2) 凝集素芯片的制備 制備好的凝集素芯片的點樣設計如圖2所示，每張芯片共分為4個矩陣，每個矩陣規(guī)格 為12* 10，每個樣品點重復三次，在室溫且濕度為55%~65%的環(huán)境中孵育6h后，37 °C真空干燥 芯片，使凝集素固定于芯片上，將制備好的凝集素芯片放置于4°C干燥器，避