多巴胺能神經(jīng)元的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及多巴胺能神經(jīng)元(dopaminergic neuron)的制備方法。而且，本發(fā)明還提供含有由該方法得到的多巴胺能神經(jīng)元的藥物，以及用于該方法的試劑和試劑盒。
[0002](發(fā)明背景)
[0003]多巴胺(3，4_二羥基苯基乙基胺)是具有多種作用的生物學(xué)分子，主要作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)遞質(zhì)發(fā)揮作用。在生物體中，多巴胺是以氨基酸酪氨酸為起點，通過酪氨酸羥化酶和DOPA脫羧酶這兩種酶的作用而在細(xì)胞內(nèi)生物合成的。
[0004]多巴胺能神經(jīng)元是能夠合成和釋放多巴胺作為神經(jīng)遞質(zhì)的神經(jīng)細(xì)胞。在腦中，它主要存在于中腦，并且部分地存在于下丘腦。存在于中腦的多巴胺能神經(jīng)元在運動和情緒控制中扮演重要角色。當(dāng)中腦多巴胺能神經(jīng)元變性或脫落時，例如能夠引起嚴(yán)重的神經(jīng)退行性疾病例如帕金森氏病等。最為期待的治療這樣的神經(jīng)退行性疾病的一種治療方式是細(xì)胞移植治療，包括對對象進(jìn)行多巴胺能神經(jīng)元移植。
[0005]作為獲得多巴胺能神經(jīng)元的方法，目前已知有下述方法，該方法包括:將干細(xì)胞例如胚胎干細(xì)胞(本說明書中有時記作ES細(xì)胞)、人工多能性干細(xì)胞(本說明書中有時記作iPScell)等分化為神經(jīng)外胚層，并進(jìn)一步誘導(dǎo)分化為多巴胺能神經(jīng)元。
[0006]最近，有報道稱由底板細(xì)胞生產(chǎn)了中腦多巴胺能神經(jīng)元。此外，接連報道了下述方法:通過使用兩種SMAD(Small Mothers Against Decapentaplegic)信號抑制劑，將干細(xì)胞分化為底板細(xì)胞來得到中腦多巴胺能神經(jīng)元的方法(專利文獻(xiàn)I，非專利文獻(xiàn)I)，由人干細(xì)胞誘導(dǎo)底板細(xì)胞并且與神經(jīng)營養(yǎng)因子一起培養(yǎng)底板細(xì)胞來誘導(dǎo)中腦多巴胺能神經(jīng)元的方法(專利文獻(xiàn)2，非專利文獻(xiàn)2-4)，以及通過將人ES細(xì)胞與GSK3beta抑制劑和激活素/Nodal抑制劑反應(yīng)來有效誘導(dǎo)底板細(xì)胞的方法(非專利文獻(xiàn)5)。
[0007]然而，這些方法得到的多巴胺能神經(jīng)元的生產(chǎn)效率仍然停留在低水平，并且由于它們不能在體外再現(xiàn)對于氧化應(yīng)激和藥物刺激的應(yīng)答性等，所述細(xì)胞是功能不充分的。因此，仍然需要開發(fā)有效得到高品質(zhì)的多巴胺能神經(jīng)元的方法。
[0008]文獻(xiàn)列表
[0009][專利文獻(xiàn)]
[0010][專利文獻(xiàn)I]us-B-2012/0094381
[0011][專利文獻(xiàn)2]W02013/067362
[0012][非專利文獻(xiàn)]
[0013][非專利文獻(xiàn)I ]Fasano 等，Cell 干細(xì)胞6(2010)336-347
[0014][非專利文獻(xiàn)2]Kriks等，Nature480(2011)547-553
[0015][非專利文獻(xiàn)3]Kirkeby等，CellReports 1(2012)703-714
[0016][非專利文獻(xiàn)4]Xi等，干細(xì)胞s30(2012)1655-1663
[0017][非專利文獻(xiàn)5]Denham等，干細(xì)胞s30(2012)2400-2411
[0018]發(fā)明概述
[0019]發(fā)明所要解決的問題
[0020]本發(fā)明的目的是提供更有效制備高品的多巴胺能神經(jīng)元的方法。本發(fā)明的目的還在于提供含有由所述方法得到的多巴胺能神經(jīng)元的藥物，以及用于所述方法的試劑和試劑合
ΙΤΓΤ.0
[0021]解決問題的手段
[0022]基于上述問題，本發(fā)明人進(jìn)行了銳意研究并且發(fā)現(xiàn)，通過在含有(i)cAMP類似物和(i i )MEK抑制劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)神經(jīng)前體細(xì)胞，能夠以高密度并且良好的重現(xiàn)性制備多巴胺能神經(jīng)元。而且，他們確認(rèn)到所得到的多巴胺能神經(jīng)元是高品質(zhì)的多巴胺能神經(jīng)元，具有與在體內(nèi)的多巴胺能神經(jīng)元同樣的表型特征和機能等，從而完成了本發(fā)明。
[0023 ]因此，本發(fā)明提供以下方面的內(nèi)容。
[0024][I]多巴胺能神經(jīng)元的制備方法，該方法包括使底板細(xì)胞(floor plate cells)進(jìn)行下述步驟(I):
[0025](I)在含有(i)cAMP類似物(cAMP analogue)和(ii)MEK抑制劑的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)的步驟；
[0026][2]根據(jù)上述[I]的制備方法，其中，所述培養(yǎng)基是還含有抗壞血酸或其鹽的培養(yǎng)基;
[0027][3]根據(jù)上述[2]的制備方法，其中，所述培養(yǎng)基是還含有激活素受體樣激酶_4，7的活化劑(activator)的培養(yǎng)基；
[0028][4]根據(jù)上述[I]的制備方法，其中，所述cAMP類似物是二丁?；?cAMP;
[0029][5]根據(jù)上述[I ]的制備方法，其中，所述MEK抑制劑是
[0030](1外-[(21?)-2，3-二羥基丙氧基]-3，4-二氟-2-[(2-氟-4-碘-苯基)氨基]苯甲酰胺(PD0325901),
[0031](?)2-(2-氯-4-碘苯基氨基)-N-環(huán)丙基甲氧基-3,4-二氟苯甲酰胺(PD184352)，或
[0032](iii)2-[ (I，2-二氫-2-氧代-3H-吲哚-3-亞基)甲基]_4_甲基-1H-吡咯_3_丙酸(SU5402)；
[0033][6]根據(jù)上述[3]的制備方法，其中，所述激活素受體樣激酶_4，7的活化劑激活素；
[0034][7]根據(jù)上述[3]的制備方法，其中，所述cAMP類似物是二丁酰基-cAMP，
[0035]所述MEK抑制劑是
[0036](1外-[(21?)-2，3-二羥基丙氧基]-3，4-二氟-2-[(2-氟-4-碘-苯基)氨基]苯甲酰胺(PD0325901),
[0037](?)2-(2-氯-4-碘苯基氨基)-N-環(huán)丙基甲氧基-3,4-二氟苯甲酰胺(PD184352)，或
[0038](iii)2-[ (I，2-二氫-2-氧代-3H-吲哚-3-亞基)甲基]_4_甲基-1H-吡咯_3_丙酸(SU5402)，以及
[0039]激活素受體樣激酶_4，7的活化劑是激活素(activin);
[0040][8]藥物，其包含根據(jù)[I]的制備方法得到的多巴胺能神經(jīng)元；
[0041][9]用于由底板細(xì)胞制備多巴胺能神經(jīng)元的試劑，所述試劑包括:
[0042](i) cAMP 類似物，和(i i) MEK抑制劑；
[0043][10]用于由底板細(xì)胞制備多巴胺能神經(jīng)元的試劑盒，所述試劑盒包括:(i)cAMP類似物，和(ii)MEK抑制劑；
[0044][ 11 ] (i) cAMP類似物和(i i)MEK抑制劑用于由底板細(xì)胞制備多巴胺能神經(jīng)元的用途。
[0045]發(fā)明的效果
[0046]根據(jù)本發(fā)明，由神經(jīng)前體細(xì)胞能夠非常有效地制備高品質(zhì)的多巴胺能神經(jīng)元。本發(fā)明制備的多巴胺能神經(jīng)元具有與體內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元相似的表型特征和機能，因為它顯示出在通過常規(guī)方法制備的多巴胺能神經(jīng)元中沒有觀察到的對于氧化應(yīng)激以及藥物刺激的應(yīng)答性等。因此，本發(fā)明制備的多巴胺能神經(jīng)元能夠獲得高移入率(engrafted rate)并且對于用來治療由于多巴胺的降低的產(chǎn)出(釋放)而引起的疾病的細(xì)胞移植治療是極為有用的，所述疾病例如神經(jīng)退行性疾病例如帕金森氏病等，而且也能夠用于各種應(yīng)用，例如篩選用于預(yù)防和/或治療所述疾病的化合物，化合物的毒性評價，藥物研發(fā)靶標(biāo)的核實，疾病機制的分析等。
【附圖說明】
[0047]圖1顯示了底板細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)變化的結(jié)果，所述結(jié)果是通過使用添加有不同組合的分化誘導(dǎo)因子的NeUro/B27，誘導(dǎo)底板細(xì)胞的分化，并且通過定量RT-PCR檢測在培養(yǎng)第13天的表達(dá)變化而得到的。[-]顯示沒有添加各分化誘導(dǎo)因子，[AU]顯示使用了全部5種LDN193189(LDN)，SB431542(SB),Sonic Hedgehog(SHH),purmorphamine(Pur)和CHIR99021(CHIR)的情況。[-factor name]顯示除去各因子的情況。作為細(xì)胞株，使用了253G1株和201B7株。Y軸的值顯示以GAPDH的拷貝數(shù)修正后的各基因的拷貝數(shù)，誤差棒顯示標(biāo)準(zhǔn)偏差。
[0048]圖2顯示將誘導(dǎo)的底板細(xì)胞在培養(yǎng)的第13天用抗-F0XA2抗體和抗-LMXlA抗體進(jìn)行了免疫焚光染色的結(jié)果。作為細(xì)胞株，使用了253G1株。紅色顯示F0XA2陽性細(xì)胞的核，綠色顯示LMXlA陽性細(xì)胞的核，以及藍(lán)色(DAPI染色)顯示細(xì)胞核。
[0049]圖3顯示NURRl的表達(dá)變化的結(jié)果，該結(jié)果是通過誘導(dǎo)底板細(xì)胞的分化，在誘導(dǎo)后13天起，通過添加抗壞血酸(AA)、二丁?；?cAMP(dbcAMP)和ro0325901(H))的不同組合來培養(yǎng)細(xì)胞，并且在第45天以定量RT-PCR檢測表達(dá)變化而得到的。作為細(xì)胞株，使用了253G1株和201B7株。Y軸的值顯示以GAPDH的拷貝數(shù)修正后的各基因的拷貝數(shù)，誤差棒顯示標(biāo)準(zhǔn)偏差。.
[0050]圖4顯示在按照與圖3中相同的方式進(jìn)行了分化誘導(dǎo)后，在培養(yǎng)第45天使用抗-TH抗體和抗-NURRl抗體進(jìn)行的免疫熒光染色的結(jié)果。作為細(xì)胞株，使用了253G1株和201B7株。綠色顯示TH陽性細(xì)胞的細(xì)胞體(cell body)，紅色顯示NURRl陽性細(xì)胞的核。
[0051]圖5顯示免疫熒光染色的結(jié)果，其是通過誘導(dǎo)底板細(xì)胞的分化，在誘導(dǎo)后13天起，通過添加抗壞血酸(AA)、二丁酰基-cAMP(dbcAMP)和ro0325901(ro)來培養(yǎng)細(xì)胞，并且在第45天(253G1株)或第52天(201B7株)使用抗-TH抗體、抗-NURRl抗體和抗-F0XA2抗體進(jìn)行免疫熒光染色而得到的結(jié)果。作為細(xì)胞株，使用了253G1株和201B7株。綠色顯示TH陽性細(xì)胞的細(xì)胞體，紅色顯示NURRl陽性細(xì)胞的核，洋紅顯示F0XA2陽性細(xì)胞的核，以及藍(lán)色(DAPI染色)顯示細(xì)胞核。
[0052]圖6顯示以高倍率對圖5中的使用253G1株所得到的結(jié)果進(jìn)行觀察。。綠色顯示TH陽性細(xì)胞的細(xì)胞體，紅色顯示NURRl陽性細(xì)胞的核，以及藍(lán)色(DAPI染色)顯示細(xì)胞核。
[0053]圖7顯示在以與圖5中相同的方式進(jìn)行了分化誘導(dǎo)后，在培養(yǎng)的第50天，評價以高-KCl刺激釋放多巴胺的能力的結(jié)果。作為細(xì)胞株，使用了253G1株和201B7株，并且顯示了兩個獨立試驗的結(jié)果。Ctrl顯示用HBSS刺激的情況，KCL顯示用含有55mM KCl的HBSS刺激的情況。Y軸的值顯示當(dāng)以對照組中的多巴胺釋放量作為I時的相對值，誤差棒顯示標(biāo)準(zhǔn)偏差。
[0054]圖8顯示NURRl的表達(dá)偏差的結(jié)果，其是通過誘導(dǎo)底板細(xì)胞的分化，在誘導(dǎo)后13天起，通過除抗壞血酸(AA)和二丁?；?cAMP( dbcAMP)外還添加各種MEK抑制劑(包括FGFR抑制劑)來培養(yǎng)細(xì)胞，并且在第45天以定量RT-PCR檢測表達(dá)變化而得到的。作為細(xì)胞株，使用了 25 3GI株和201B7株。Y軸的值顯示以GAPDH的拷貝數(shù)修正后的各基因的拷貝數(shù)，誤差棒顯示標(biāo)準(zhǔn)偏差。.
[0055]圖9顯示由人iPS細(xì)胞誘導(dǎo)分化成底板細(xì)胞和多巴胺能神經(jīng)元的方法的模式圖。
[0056]圖10顯示當(dāng)根據(jù)圖9的方法進(jìn)行分化誘導(dǎo)時，以定量RT-PCR進(jìn)行檢測的各種分化標(biāo)記物的經(jīng)時表達(dá)變化的結(jié)果。[All]、[-]、[-SHH]和[-Pur]分別表示:根據(jù)圖9進(jìn)行了分化誘導(dǎo)、排除了 CHIR99021、LDNl 93189、SB431542、Sffi^Ppurmorphamine、排除了單獨的 SHH、以及排除了單獨的purmorphamine。作為細(xì)胞株，使用了 253G1株和201B7株。Y軸的值顯示以GAPDH的拷貝數(shù)修正后的各基因的拷貝數(shù)，誤差棒顯示標(biāo)準(zhǔn)偏差。.
[0057]圖11顯示多巴胺能神經(jīng)元標(biāo)記物的表達(dá)變化的結(jié)果，其是通過在圖9所示的步驟3中通過添加抗壞血酸(AA)、二丁?；?cAMP(dbcAMP)，PD0325901(PD)和激活素A(Act)的各種組合來誘導(dǎo)分化，并且在培養(yǎng)的第26天以定量RT-PCR檢測多巴胺能神經(jīng)元標(biāo)記物的表達(dá)變化而得到的。[_]顯示沒有添加各分化誘導(dǎo)因子。作為細(xì)胞株，使用了 253G1株和201B7株。Y軸的值顯示以GAPDH的拷貝數(shù)修正后的各基因的拷貝數(shù)，誤差棒顯示標(biāo)準(zhǔn)偏差。.
[0058]圖12顯示在與圖11同樣方式地分化誘導(dǎo)后，在培養(yǎng)的第26天，使用抗-TH抗體和抗-NURRl抗體進(jìn)行的免疫熒光染色的結(jié)果。作為細(xì)胞株，使用了253G1株和201B7株。綠色顯示TH陽性細(xì)胞的細(xì)胞體，紅色顯示NURRl陽性細(xì)胞的核。
[0059]圖13顯示多巴胺能神經(jīng)元標(biāo)記物的表達(dá)變化的結(jié)果，其是通過在圖9所示的步驟3中，通過添加抗壞血酸(AA)、二丁?；?cAMP(dbcAMP)、PD0325901(PD)和激活素A(Act)的各種組合來誘導(dǎo)分化，在培養(yǎng)的第26天將細(xì)胞凍結(jié)保存，將細(xì)胞解凍，通過添加AA、dbcAMP ,PD和ACT的各種組合培養(yǎng)細(xì)胞2周，并