一種高轉(zhuǎn)化率的枯草芽孢桿菌及其構(gòu)建方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種高轉(zhuǎn)化率的枯草芽孢桿菌及其制備與應(yīng)用。本發(fā)明首先通過(guò)質(zhì)粒表達(dá)的方法解決了枯草芽孢桿菌A164轉(zhuǎn)化效率低的問(wèn)題，然后通過(guò)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化的方法將含有comk表達(dá)框的線性片段整合到A164基因組上，借助cre/lox特異重組系統(tǒng)消除抗性，得到了不含抗性標(biāo)記的、易于操作的、高轉(zhuǎn)化效率和高分泌能力的枯草芽孢桿菌A164S。本發(fā)明的枯草芽孢桿菌A164S，研究結(jié)果表明，其轉(zhuǎn)化效率為A164的1000倍以上；A164S能有效攝取同源DNA，高效分泌外源蛋白，在外源基因的重組表達(dá)方面有著較大的應(yīng)用潛力。
【專利說(shuō)明】
一種高轉(zhuǎn)化率的枯草芽孢桿菌及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種高轉(zhuǎn)化率的枯草芽孢桿菌及其制備與 應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 枯草芽孢桿菌被認(rèn)定為是一般安全(GRAS，Generally Recognized as Safe)的生 物，因其無(wú)致熱源、高分泌、易培養(yǎng)，其產(chǎn)物可直接用于人們的日常使用等優(yōu)點(diǎn)，成為工業(yè)多 肽類產(chǎn)品、藥劑和酶制劑分泌表達(dá)的首選?？莶菅挎邨U菌A164(ATCC 6051a)相比于模式菌 株A168,其生長(zhǎng)特性、分泌能力等生化特征非常優(yōu)異，是發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)菌構(gòu)建的理想出發(fā)菌 株。但是A164由于DNA轉(zhuǎn)化效率極抵，基因操作困難，使得A164工程菌改造的工作限制大，影 響了其在工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用的前景。
[0003] 枯草芽孢桿菌的攝取外源DNA的能力，即感受態(tài)效率受到信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)嚴(yán)密的調(diào) 控。感受態(tài)轉(zhuǎn)錄因子Comk在其中扮演著重要的作用，Comk的編碼基因 comk的表達(dá)也在轉(zhuǎn)錄 和轉(zhuǎn)錄后水平上受到嚴(yán)格調(diào)控。comk的表達(dá)受到至少三個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，包括AbrB、Rok(Ykuw) 和CodY的抑制，同時(shí)也受到DeqSu雙組分調(diào)控系統(tǒng)及Comk本身的正向調(diào)控。因此，提高枯草 芽孢桿菌的感受態(tài)效率，可以從兩個(gè)方面著手，其一是敲除comk基因的抑制因子，其二就是 過(guò)表達(dá)Comk正向調(diào)控因子。事實(shí)證明，這兩種方式均切實(shí)可行，通過(guò)失活Rok的編碼基因 rok，可以使枯草芽孢桿菌BD630的轉(zhuǎn)化效率提高5倍;而通過(guò)將含有木糖啟動(dòng)子xylA的comk 基因?qū)肟莶菅挎邨U菌1A751，得到的枯草芽孢桿菌1A976對(duì)DNA的轉(zhuǎn)化效率可以提高1000 倍。
[0004] 另一方面，經(jīng)基因工程改造的微生物通常含有抗生素基因以用于遺傳操作篩選， 但用于多肽、工業(yè)酶生產(chǎn)的領(lǐng)域?qū)股氐奶砑蛹翱股鼗虻拇嬖谑置舾?，因此，一?要求生產(chǎn)菌株不含抗生素基因。因此，在對(duì)枯草芽孢桿菌進(jìn)行分子改造時(shí)，通常會(huì)使用反向 篩選標(biāo)記，利用細(xì)胞自身的同源重組系統(tǒng)將抗性基因敲除，但這種方式下的重組效率不高， 菌株二次篩選時(shí)的工作量比較大，也比較耗時(shí)；因此近年來(lái)多利用位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)，比 如cre/lox系統(tǒng)，通過(guò)外源重組酶的催化，大大提高重組效率，使得基因無(wú)痕敲除/敲入的操 作省時(shí)高效。
[0005] 但是即使是利用現(xiàn)代的遺傳操作工具，雖然它們對(duì)枯草芽孢桿菌A168、1A976等模 式菌株十分有效，但是對(duì)于有生產(chǎn)應(yīng)用前景的A164而言，依舊十分困難，因?yàn)锳164的轉(zhuǎn)化效 率極低，幾乎不接受外源DNA的轉(zhuǎn)化。同時(shí)，為了保證外源基因在枯草芽孢桿菌的遺傳穩(wěn)定 性，會(huì)通過(guò)同源重組整合到宿主的染色體中，利用線性DNA往往可以一次性完成這種分子改 造，但對(duì)于A164而言，這種由線性DNA介導(dǎo)的分子改造工作十分困難，耗時(shí)耗力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了克服目前野生型枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)化效率低的問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供一 種高轉(zhuǎn)化率的枯草芽孢桿菌及其制備與應(yīng)用。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的以及其他相關(guān)目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0008] 本發(fā)明的第一方面，提供了一種枯草芽孢桿菌，所述枯草芽孢桿菌的基因組中含 有xylR-Pxy lA-comk表達(dá)單元，所述xylR-PxylA-comk表達(dá)單元的序列包括5 '至3 '方向依次 排列的xylR基因序列、xylA啟動(dòng)子基因序列、comk基因序列。
[0009] 優(yōu)選地，所述枯草芽孢桿菌的基因組中整合有xylR-Pxy lA-comk表達(dá)單元，所述 xylR-PxylA-comk表達(dá)單元的序列包括5'至3'方向依次排列的xyIR基因序列、xyIA啟動(dòng)子 基因序列、comk基因序列。
[0010] 優(yōu)選地，所述xylR-PxylA-comk表達(dá)單元的基因序列如SEQ ID NO. 12所示。
[0011]優(yōu)選地，所述枯草芽孢桿菌由枯草芽孢桿菌A164改造獲得。
[0012]優(yōu)選地，所述枯草芽孢桿菌是將枯草芽孢桿菌A164中的中性蛋白酶基因 nprE敲除 并替換為xylR-PxylA-comk表達(dá)單元構(gòu)建獲得。
[0013]優(yōu)選地，被敲除的中性蛋白酶基因 nprE的基因序列如SEQ ID NO. 11所示。
[0014]進(jìn)一步地，所述枯草芽孢桿菌除了中性蛋白酶基因 nprE被敲除和替換之外，還可 經(jīng)過(guò)其他基因改造。
[0015] 基因改造具體是指通過(guò)生物或化學(xué)或物理的手段使基因相比改造前在結(jié)構(gòu)上發(fā) 生變化。這種變化主要是指堿基對(duì)組成的變化，包括但不限于一個(gè)或多個(gè)堿基對(duì)的替換、增 添、缺失引起的改變。
[0016] 本發(fā)明的第二方面，提供了前述枯草芽孢桿菌的制備方法，包括步驟:將枯草芽孢 桿菌A164中的中性蛋白酶基因 nprE敲除，并替換為xylR-PxylA-comk表達(dá)單元。
[0017]相比中性蛋白酶基因 nprE未被敲除替換的枯草芽孢桿菌，本發(fā)明的枯草芽孢桿菌 轉(zhuǎn)化效率更高。
[0018] 優(yōu)選地，采用基因重組介導(dǎo)的基因操作敲除和替換中性蛋白酶基因 nprE。
[0019] 可以采用現(xiàn)有的基因重組方法敲除和替換所述中性蛋白酶基因 nprE。在優(yōu)選地實(shí) 施例中，采用Cre-LoxP重組酶系統(tǒng)介導(dǎo)的基因重組方法敲除和替換所述中性蛋白酶基因 nprE。還可采用其他方法實(shí)現(xiàn)基因敲除和替換，并不限于實(shí)施例所列舉的方式。
[0020] 基于中性蛋白酶基因 nprE的敲除和替換，nprE的完整序列從染色體DNA中去除和 被替換。
[0021] 進(jìn)一步的，所述枯草芽孢桿菌還經(jīng)過(guò)其他基因改造。
[0022]所述的其他基因改造是指除中性蛋白酶基因 nprE的敲除和替換以外的基因改造。 所述其他基因改造可以是單個(gè)目標(biāo)基因的改造或者為多個(gè)感興趣目標(biāo)基因的改造。感興趣 目標(biāo)基因并不特指，可以根據(jù)研究需要設(shè)定并改造。例如，可以是一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)以上目標(biāo) 基因的改造。由于本發(fā)明中性蛋白酶基因 nprE被敲除和替換的苦草芽孢桿菌可在體外傳 代，因此理論上可以不斷對(duì)其進(jìn)行基因改造，對(duì)于目標(biāo)基因的改造數(shù)量可以按照需要操作， 沒(méi)有特別限制。
[0023]所述基因改造包括但不限于目標(biāo)基因的敲入、目標(biāo)基因的敲除、目標(biāo)基因的替換 等。目標(biāo)基因的敲入、目標(biāo)基因的敲除、目標(biāo)基因的替換可以采用基因打靶、同源重組等技 術(shù)來(lái)完成，包括但不限于基于Cre-LoxP重組酶系統(tǒng)、ZFN(鋅指核酸酶）、TALEN(轉(zhuǎn)錄激活樣 效應(yīng)因子核酸酶)和CRISPR/Cas9(成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)技術(shù))等的基因操作。
[0024]凡是可以實(shí)現(xiàn)中性蛋白酶基因 nprE被敲除和替換及其他基因突變的其他生物技 術(shù)手段均可用于構(gòu)建中性蛋白酶基因 nprE被敲除和替換且經(jīng)其他基因改造的枯草芽孢桿 菌。
[0025] 優(yōu)選地，還包括對(duì)所述枯草芽孢桿菌進(jìn)行了單個(gè)或者多個(gè)感興趣目標(biāo)基因的改 造。
[0026] 本發(fā)明的第三方面，提供了前述枯草芽孢桿菌的用途，為將所述枯草芽孢桿菌作 為表達(dá)宿主。
[0027] 進(jìn)一步地，將所述枯草芽孢桿菌作為表達(dá)宿主用于外源基因的高效表達(dá)。
[0028] 進(jìn)一步地，還可將所述枯草芽孢桿菌作為表達(dá)宿主用于工業(yè)多肽類產(chǎn)品、蛋白類 產(chǎn)品、藥劑和酶制劑等的高效表達(dá)。
[0029] 本發(fā)明的第四方面，提供了一種表達(dá)外源基因的方法，包括如下步驟：
[0030] 1)構(gòu)建含有外源基因的重組表達(dá)載體；
[0031] 2)將步驟1)獲得的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染本發(fā)明前述枯草芽孢桿菌，并在合適表達(dá)所 述外源基因的條件下培養(yǎng)所述宿主。
[0032]通過(guò)常規(guī)的重組DNA技術(shù)即可構(gòu)建含有外源基因的重組表達(dá)載體，例如將目的外 源基因片段插入所述表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)。所述目的外源基因片段應(yīng)當(dāng)至少包含所要表 達(dá)的外源基因的完整編碼區(qū)。
[0033] 獲得的轉(zhuǎn)有重組表達(dá)載體的枯草芽孢桿菌可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達(dá)外源基因。 根據(jù)所用的枯草芽孢桿菌的具體情況，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選用已知的各種合適的培養(yǎng) 基或培養(yǎng)液，在適于宿主細(xì)胞生長(zhǎng)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)并表達(dá)外源基因。如果需要，可利用其 物理的、化學(xué)的和其它特性或添加純化標(biāo)簽通過(guò)各種分離方法分離和純化外源基因表達(dá)所 得產(chǎn)品。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于：用蛋白沉 淀劑處理(鹽析方法）、離心、滲透破壁、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過(guò)濾）、吸附層析、 離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。
[0034] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：
[0035]本發(fā)明首先通過(guò)質(zhì)粒表達(dá)的方法解決了枯草芽孢桿菌A164轉(zhuǎn)化效率低的問(wèn)題，然 后通過(guò)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化的方法將含有comk表達(dá)框的線性片段整合到A164基因組上，借助cre/lox 特異重組系統(tǒng)消除抗性，得到了不含抗性標(biāo)記的、易于操作的、高轉(zhuǎn)化效率和高分泌能力的 枯草芽孢桿菌A164S。本發(fā)明的枯草芽孢桿菌A164S，研究結(jié)果表明，其轉(zhuǎn)化效率為A164的 1000倍以上;A164S能有效攝取同源DNA，高效分泌外源蛋白，在外源基因的表達(dá)方面有著較 大的應(yīng)用潛力。
【附圖說(shuō)明】
[0036] 圖1:重組質(zhì)粒pMK4_cre的質(zhì)粒圖譜。
[0037] 圖2:重組質(zhì)粒pGSNE-nprlR-comk的質(zhì)粒圖譜。
[0038] 圖3:重組質(zhì)粒pMK4_comk的質(zhì)粒圖譜。
[0039]圖4:枯草芽孢桿菌164S的構(gòu)建流程圖。
[0040]圖5:枯草芽孢桿菌164S淀粉酶基因的敲的功能鑒定。
【具體實(shí)施方式】
[0041]在進(jìn)一步描述本發(fā)明【具體實(shí)施方式】之前，應(yīng)理解，本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于下 述特定的具體實(shí)施方案;還應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明實(shí)施例中使用的術(shù)語(yǔ)是為了描述特定的具體 實(shí)施方案，而不是為了限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的試驗(yàn)方法， 通常按照常規(guī)條件，或者按照各制造商所建議的條件。
[0042]當(dāng)實(shí)施例給出數(shù)值范圍時(shí)，應(yīng)理解，除非本發(fā)明另有說(shuō)明，每個(gè)數(shù)值范圍的兩個(gè)端 點(diǎn)以及兩個(gè)端點(diǎn)之間任何一個(gè)數(shù)值均可選用。除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和 科學(xué)術(shù)語(yǔ)與本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的意義相同。除實(shí)施例中使用的具體方法、設(shè)備、 材料外，根據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的掌握及本發(fā)明的記載，還可以使用與本 發(fā)明實(shí)施例中所述的方法、設(shè)備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術(shù)的任何方法、設(shè)備和材料來(lái)實(shí) 現(xiàn)本發(fā)明。
[0043] 除非另外說(shuō)明，本發(fā)明中所公開(kāi)的實(shí)驗(yàn)方法、檢測(cè)方法、制備方法均采用本技術(shù)領(lǐng) 域常規(guī)的分子生物學(xué)、生物化學(xué)、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和分析、分析化學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、重組DNA技術(shù)及 相關(guān)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。這些技術(shù)在現(xiàn)有文獻(xiàn)中已有完善說(shuō)明，具體可參見(jiàn)Sambrook等 MOLECULAR CL0NING:A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989and Third edition，2001;Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BI0L0GY?John Wiley&Sons?New York?1987and periodic updates；the series METHODS IN ENZYM0L0GY ,Academic Pressman Diego ； Wolf fe ? CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION,Third edition?Academic Pressman Diego?1998；METH0DS IN ENZYM0L0GY，Vol·304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，Academic Press，San Diego，1999;和METHODS IN MOLECULAR BI0L0GY，Vol.ll9，Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等〇
[0044] 實(shí)施例1表達(dá)質(zhì)粒pMK4_cre、表達(dá)質(zhì)粒pMK4_comk和重組質(zhì)粒pGSNE-nprlR-comk 的構(gòu)建
[0045] I .pMK4_cre的構(gòu)建
[0046] pMK4-cre是在pMK4載體的基礎(chǔ)上連接了含有一個(gè)Pspac啟動(dòng)子的Cre酶表達(dá)基因 cre，用于在苦草芽孢桿菌中表達(dá)Oe酶。pMK4-cre的序列如SEQ N0.1所示，具體為：
[0047] gcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgact ggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatg cttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgc caagcttggctgcaggtcgacggatccccgggaattctacacagcccagtccagactattcggcactgaaattatgg gtgaagtggtcaagacctcactaggcaccttaaaaatagcgcaccctgaagaagatttatttgaggtagcccttgcc tacctagcttccaagaaagatatcctaacagcacaagagcggaaagatgttttgttctacatccagaacaacctctg ctaaaattcctgaaaaattttgcaaaaagttgttgactttatctacaaggtgtggcataatgtgtggaattgtgagc ggataacaattaagcttaaggaggaagcaggtatgtccaatttactgaccgtacaccaaaatttgcctgcattaccg gtcgatgcaacgagtgatgaggttcgcaagaacctgatggacatgttcagggatcgccaggcgttttctgagcatac ctggaaaatgcttctgtccgtttgccggtcgtgggcggcatggtgcaagttgaataaccggaaatggtttcccgcag aacctgaagatgttcgcgattatcttctatatcttcaggcgcgcggtctggcagtaaaaactatccagcaacatttg ggccagctaaacatgctteatcgtcggtccgggctgccacgaccaagtgacagcaatgctgtttcactggttatgcg 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[0048] 其中的PSpac-cre片段以質(zhì)粒pDGC為模板，以Pc re-F(SEQIDN0.5)為上游引物， 以Pcre-R(SEQIDN0.6)為下游引物PCR擴(kuò)增得到。
[0049] Pcre_F(SEQ ID NO·5)，具體為：taccgaattctacacagcccagtccaga〇
[0050] Pcre_R(SEQ ID NO·6)，具體為：ctaggaattcgcatgcctaatcgccatcttccag〇
[0051] PCR反應(yīng)體系如下：
[0052] 5x PS buffer (購(gòu)自 TaKLaRa 公司，含 Mg 離子等） 10 pL dNTP mix(2,5 mM) 3μ【 PcF 上游引物（10: μΜ) 3.0 rL Pcre-R 下游引物(ΙΟμΜ) 3.0 LiL DNA 模板 Ι.ΟμΙ PrimeSTAR..聚合酉每（.2,5 U/μΙ) LOpL 加水至 50 μL。
[0053] 在Mastercycler普通PCR儀(Eppendorf)上運(yùn)行以下程序：
[0054] (1)98°(：，2π?η;(2)98°(：，158θ(3 ;(3)55°(：，158θ(3;(4)72°(：，1π?η 30sec;(5)循環(huán)從 (2)到(4)，30次；（6)72°(：，1〇1^11;(7)4°(：，保存。
[0055] PCR產(chǎn)物經(jīng)Axygen PCR清潔試劑盒回收純化后，以限制性內(nèi)切酶Eco RI酶切，與經(jīng) Eco RI和去磷酸化處理的線性質(zhì)粒pMK4以T4DNA連接酶連接，連接液轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5a，從 大腸桿菌中分離得到重組質(zhì)粒pMK4-cre。所述重組質(zhì)粒pMK4-cre的結(jié)構(gòu)示意圖如圖1所示D
[0056] 2. pMK4_comk 的構(gòu)建
[0057] pMK4-comk是在pMK4載體的基礎(chǔ)上連接了含有啟動(dòng)子xylA及其抑制基因 xylR的 comk表達(dá)基因，pMK4_comk用于在枯草芽抱桿菌中表達(dá)Comk
[0058] pMK4_comk的序列如SEQ NO. 3所示，具體為：
[0059] gcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgact ggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatg cttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgc caagcttggctgcagtcgcgatgattaattaattcagaacgctcggttgccgccgggcgttttttatgcagcaatgg caagaacgtcccggggagctcctaacttataggggtaacacttaaaaaagaatcaataacgatagaaaccgctecta aagcaggtgcattttttcctaacgaagaaggcaatagttcacatttattgtctaaatgagaatggactctagaagaa acttcgtttttaatcgtatttaaaacaatgggatgagattcaattatatgatttctcaagataacagcttctatatc aaatgtattaaggatattggttaatccaattccgatataaaagccaaagttttgaagtgcatttaacatttctacat catttttatttgcgcgttccacaatctcttttcgagaaatattcttttcttctttagagagcgaagccagtaacgct ttttcagaagcatataattcccaacagcctcgatttccacagctgcatttgggtccattaaaatctatcgtcatatg acccatttccccagaaaaaccctgaacacctttatacaattcgttgttaataacaagtccagttccaattccgatat taatactgatgtaaacgatgttttcatagttttttgtcataccaaatactttttcaccgtatgctcctgcattagct 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[0060] 其中的xylR-PxylA-comk片段以質(zhì)粒pMD19T-kan-comk-lacA(SEQIDN0.4)為模 板，以Comk-psF(SEQIDN0.7)為上游引物，以Comk-psR(SEQIDN0.8)為下游引物PCR擴(kuò)增 得到。
[0061 ] pMD19T-kan-comk-lacA(SEQ ID Ν0.4)具體為：
[0062] gcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgact ggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatg cttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgc caagcttgcatgcctgcaggtcgacgatcaggtcgcctgacaatatgtctcctgtcattatgtccttcacactctga tcaaacgtgaccagctgtttttcttccgtgaaattcatgacaaaaatataatcattgtcctgatcctgcctcgcttg tacggagacgccttttccgtgccgaaccggaaaaactggagagagagacaggtctgtgatcagaccctcatagaaat cacgctgaaattgatcctccaaacgcgcgccgataaaatacgccttgccctgctgatactcatggcttgtgaccgct ggcgtgcgcgcataaaaatcttcttgatacaccgcttccactgaagctgtctttacatcaatcacggttgcataatc cttcatttcatatatttggctgcggtagctgacagcgtttcgatccttcggatacagggtgtccgtttcaagaggct caactccaaatatagcttgaaatcgatatctctgcagtcgcgatgattaattaattcagaacgctcggttgccgccg ggcgttttttatgcagcaatggcaagaacgtcccggggagctcctaacttataggggtaacacttaaaaaagaatca ataacgatagaaaccgctcctaaagcaggtgcattttttcctaacgaagaaggcaatagttcacatttattgtctaa 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[0063] Comk_psF(SEQ ID NO·7)具體為：cgatatctctgcagtcgcgatgattaattaattcag〇
[0064] Comk_psR(SEQ ID N0.8)具體為：cagtctgcaggatatggtgcaagtcagcacgaac。
[0065] PCR反應(yīng)體系如下：
[0066] 5x PS buffer (購(gòu)自 TaKaRa 公…，含 Mg 離子等） 10 pL dNTP mix(2.5 mM) 3μL Comk-psF 上游引物（10 μΜ) 3.0 tuL Comk-psR 下游引物（10 μΜ) 3.0 [!L DNA 模板 I 0 tuL PrimeSTAR 聚合晦 C2.5 U/μΙ) LO 加水至 5:0 μΙ
[0067] 在Mastercycler普通PCR儀(Eppendorf)上運(yùn)行以下程序：
[0068] (1)98°(：，2π?η;(2)98°(：，158θ(3 ;(3)55°(：，158θ(3;(4)72°(：，2π?η;(5)循環(huán)從（2)到 (4)，30次；（6)72°(：，1〇1^11;(7)4°(：，保存。
[0069] PCR產(chǎn)物經(jīng)Axygen PCR清潔試劑盒回收純化后，以限制性內(nèi)切酶Pst I酶切，與經(jīng) PstI和去磷酸化處理的線性質(zhì)粒pMK4以T4DNA連接酶連接，連接液轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5a，從大 腸桿菌中分離得到重組質(zhì)粒pMK4_comk。所述重組質(zhì)粒pMK4_comk的質(zhì)粒圖譜如圖3所示D
[0070] 3 .pGSNE-nprlR-comk 的構(gòu)建
[0071] pGSNE-nprlR-comk是在pGSNE-nprlR載體的基礎(chǔ)上連接了含有啟動(dòng)子xylA及其抑 制基因 xylR、Kan基因表達(dá)框、Comk編碼基因和兩個(gè)Iox位點(diǎn)，pGSNE-nprlR-comk是一種整合 型重組質(zhì)粒。
[0072] pGSNE-nprlR-comk的序列如SEQ NO. 2所示，具體為：
[0073] agctctcgagaagatgatagctcatcaaaaatcccgccattgccaaataaatcgtatatggcattactgcaccataa tcttttgagatttgattgggatatggcgcaagcagcaagacaagcagtccgataatcagcgtataaaataagcctag taagatcttatccgttctccaatacagcttgaaaaacactacattcaacgcaatgggaagagtgatgatgaaaaaca gaaacacgaatgcaatcggctccatcccatccgggtattccttccaatacgaaaagaaactaaaaatcatttgtacg atcggcaaactgacaacagcaaggtcgaacgtataaaacttaccctttccgccatgatcacgcggcatcagcatata gtgaaaagccgtcagcagcacatatccgtataacaaaaaatgcagcagcggcagcagttcttttccgtcctctctta agtaagcgctggtgaagtttgttgattgcacctggtgaataagttcaacagacactcccgccagcagcacaatccgc aatataacacccgccaagaacattgtgcgctgccggtttattttgggatgatgcaccaaaagatataagcccgccag aacaacaattgaccattgaatcagcagggtgctttgtctgcttaatataaaataacgttcgaaatgcaatacataat gactgaataactccaacacgaacaacaatcctttacttcttattaaggcctcattcggttagacagcggacttttca aaaagtttcaagatgaaacaaaaatatctcatcttccccttgatatgtaaaaaacataactcttgaatgaaccacca catgacacttgactcatcttgatattattcaacaaaaacaaacacaggacaatactatcaattttgtctagttatgt 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[0074]其中的kan-lox-comk片段以質(zhì)粒pMD19T-kan-comk_lacA(SEQ ID NO.4)為模板， 以Ck-npr-KpnF(SEQIDN0·9)為上游引物，以Ck-npr-NheR(SEQIDN0·10)為下游引物PCR 擴(kuò)增得到。
[0075] pMD19T-kan-comk-lacA(SEQ ID N0.4)具體為：
[0076] gcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgact ggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatg cttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgc caagcttgcatgcctgcaggtcgacgatcaggtcgcctgacaatatgtctcctgtcattatgtccttcacactctga tcaaacgtgaccagctgtttttcttccgtgaaattcatgacaaaaatataatcattgtcctgatcctgcctcgcttg tacggagacgccttttccgtgccgaaccggaaaaactggagagagagacaggtctgtgatcagaccctcatagaaat cacgctgaaattgatcctccaaacgcgcgccgataaaatacgccttgccctgctgatactcatggcttgtgaccgct ggcgtgcgcgcataaaaatcttcttgatacaccgcttccactgaagctgtctttacatcaatcacggttgcataatc cttcatttcatatatttggctgcggtagctgacagcgtttcgatccttcggatacagggtgtccgtttcaagaggct caactccaaatatagcttgaaatcgatatctctgcagtcgcgatgattaattaattcagaacgctcggttgccgccg ggcgttttttatgcagcaatggcaagaacgtcccggggagctcctaacttataggggtaacacttaaaaaagaatca ataacgatagaaaccgctcctaaagcaggtgcattttttcctaacgaagaaggcaatagttcacatttattgtctaa 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gtttatggctctcttggtcgtcagactgatgggccctattcggatattgagatgatgtgtgtcatgtcaacagagga agcagagttcagccatgaatggacaaccggtgagtggaaggtggaagtgaattttgatagcgaagagattctactag attatgcatctcaggtggaatcagattggccgcttacacatggtcaatttttctctattttgccgatttatgattca ggtggatacttagagaaagtgtatcaaactgctaaatcggtagaagcccaaacgttccacgatgcgatttgtgccct tatcgtagaagagctgtttgaatatgcaggcaaatggcgtaatattcgtgtgcaaggaccgacaacatttctaccat ccttgactgtacaggtagcaatggcaggtgccatgttgattggtctgcatcatcgcatctgttatacgacgagcgct tcggtcttaactgaagcagttaagcaatcagatcttccttcaggttatgaccatctgtgccagttcgtaatgtctgg tcaactttccgactctgagaaacttctggaatcgctagagaatttctggaatgggattcaggagtggacagaacgac acggatatatagtggatgtgtcaaaacgcataccattttgaacgatgacctctaataattgttaatcatgttggtta cgtatttattaacttctcctagtattagtaattatcatggctgtcatcccgggataacttcgtatagcatacattat acgaacggtagagctagcaaattctcgagttgccgccgggcgttttttatgcagcaatggcaagaacgttgctctag agcggccgcatcgattcacagtggcaatctcccccgtattcgtttgaaatgtgccacattaacagcgccgggtgatg tccgtatcgttctgctaataagcggttgatgtgccgtgttttttctcggtagactttagatgtgaggcagtggttgt gccttccgccgtgcagctgtttgacgcgggaggcattgacgcgcaaaacttccggataggtttgcgacagccaggcc ggacgggctccgctcggcgttgctaatatgacccggccgcctatactgtgaatccgctcaaaaatatcatccagcca ttcaaattgatatacgccctcctccggctcaagtgcgctccatgcaaaaatgccgacagaaaacgtattcgtatgag aaagcttcatcagtttgatatcgtcagetaaaatatcgggccgatccagccactgatcggggttgtagtctccccca tggagcataaattttgcttttgttacgtgcgttttttcaagctttgacatcacaccatctctagaggatccccgggt accgagctcgaattcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgcc ttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgc agcctgaatggcgaatggcgcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcatatggtg cactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagccccgacacccgccaacacccgctgacgcgccct gacgggcttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctgtgaccgtctccgggagctgcatgtgtcagaggttt tcaccgtcatcaccgaaacgcgcgagacgaaagggcctcgtgatacgcctatttttataggttaatgtcatgataat 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ctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagc attggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatc taggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccc cgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccac cgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcg cagataccaaatactgttcttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacata cctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagac gatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacc tacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggta tccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtc ctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaac gccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccc tgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcg agtcagtgagcgaggaagcggaaga 〇
[0077] Ck-npr-Kpn F(SEQ ID N0.9)具體為：cttttcctaatattacaatccggtaccgtcgcgatga ttaattaattcagaacg〇
[0078] Ck-npr-Nhe R(SEQ ID NO. 10)具體為：Gggatttattgtgggtgctagctctaccgttcgtat aatg〇
[0079] PCR反應(yīng)體系如下： 5x PS buffer (購(gòu)自 TaKaRa 公司，含 Mg 離子等） 10 pL dNTP mix(2.5 mM) 3μL Ck-npr-KpnF 丨-·.游引物（ΙΟμΜ) 3.0 μL
[0080] Ck-npr-NheR 下游引物（1()μΜ) 3.0 μΙ_. DNA 模板 1.0 liL PrimcSTAR 聚介丨姆（2.5 U/μΙ) 1.0 μL. 加水至 5? μL
[0081 ] 在Mastercycler普通PCR儀(Eppendorf)上運(yùn)行以下程序：
[0082] (1)98Γ，2π?η;(2)98Γ，158θ(：;(3)55Γ，158θ(3 ;(4)72Γ，3π?η 30sec;(5)循環(huán)從 (2)到(4)，30次；（6)72°C，10min; (7)4°C，保存。
[0083] PCR產(chǎn)物經(jīng)Axygen PCR清潔試劑盒回收純化。以限制性內(nèi)切酶Nhe I和Kpn I雙酶 切質(zhì)粒pGSNE-npr IR，酶切產(chǎn)物經(jīng)Axygen PCR清潔試劑盒回收純化。上述純化產(chǎn)物經(jīng) Infusion試劑盒(購(gòu)自TaKaRa)進(jìn)行連接，連接液轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5a，從大腸桿菌中分離得 到重組質(zhì)粒pGSNE-npr lR-comk。所述重組質(zhì)粒pGSNE-npr lR-comk的質(zhì)粒圖譜如圖2所示。 [0084]實(shí)例2枯草芽孢桿菌164S的構(gòu)建
[0085]米用質(zhì)?？赸/〇(4-(3〇1111<：463呢-即1'11?-(3〇1111<:、。]\0(4-(^6改造枯草芽抱桿菌4164(厶164 基因組序列的DDBJ/EMBL/GenBank獲取號(hào)為no.CPOlll 15)，最終得到一株易于操作的高轉(zhuǎn) 化效率的枯草芽孢桿菌164S，流程圖見(jiàn)圖4。
[0086] 具體操作如下：
[0087]首先，把pMK4-comk轉(zhuǎn)化進(jìn)入枯草芽孢桿菌A164。轉(zhuǎn)化采用高滲法電擊轉(zhuǎn)化的方 法，
[0088] a)接種枯草芽孢桿菌A164于3mL LB培養(yǎng)基中，過(guò)夜培養(yǎng)；
[0089] b)取2.6mL過(guò)夜培養(yǎng)菌液轉(zhuǎn)接到40mL(LB+0.5M山梨醇）中，37°C，200rpm培養(yǎng)至 0D600 = 0.8；
[0090] c)將菌液冰水浴IOmin，然后5000g，5min，4Γ離心收集菌體；
[0091] d)用30mL預(yù)冷的電轉(zhuǎn)培養(yǎng)基(0.5Μ山梨醇，0.5Μ甘露醇，10%葡萄糖），重新吹懸菌 體，5000g，5min，4°C離心去上清，如此漂洗3次；
[0092] e)漂洗三次后，利用未完全除去的電轉(zhuǎn)培養(yǎng)基將菌體吹懸后分裝，每EP管分裝60μ L；
[0093] f)將60yL感受態(tài)細(xì)胞中加入50ng質(zhì)粒pMK4-comk，冰上孵育2min，加入預(yù)冷的電轉(zhuǎn) 杯（Imm)中，設(shè)置電壓2kV，電擊一次；
[0094] g)電擊完畢取出杯子并立即加入lmLRM(LB+0.5M山梨醇+0.38甘露醇），37°C， 200rpm，復(fù)蘇3hr后，涂5yg/mL的氯霉素抗性板;37°C，過(guò)夜培養(yǎng)篩選得到含有pMK4-comk質(zhì) 粒的枯草芽孢桿菌A164C。
[0095] 然后，通過(guò)限制性內(nèi)切酶Nco I酶切線性化質(zhì)粒pGSNE-nprlR-comk，通過(guò)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化 的方法將線性化質(zhì)粒pGSNE-npr lR-comk轉(zhuǎn)化進(jìn)入A164C，具體方法如下：
[0096] a)把平板活化的單菌落接種到3mL LB試管中，37°C、200rpm培養(yǎng)10~12h;
[0097] b)b)然取300yL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到預(yù)熱的3mL LB試管中，加入濾膜滅菌的的木糖溶液 至木糖終濃度為1%，37°C、200rpm培養(yǎng)3h;
[0098] c)分裝到2mL Eppendorf管中，按比例100ngDNA/100yL培養(yǎng)液加入線性化的質(zhì)粒 后孵育，37 °C、200rpm培養(yǎng)1.5h;涂lOyg/mL的卡那霉素抗性板;37 °C，過(guò)夜培養(yǎng)篩選得到含 有comk整合到基因組上的含有卡納抗性片段的菌。
[0099] 然后通過(guò)在無(wú)氯霉素添加的LB培養(yǎng)基中傳代，篩選到消除質(zhì)粒pMK4-c〇mk的枯草 芽抱桿菌A164K。
[0100] 最后，采用誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化的方法把pMK4-cre轉(zhuǎn)化進(jìn)入枯草芽孢桿菌A164K，在ere酶的 作用下使兩個(gè)Iox位重組，通過(guò)印章法利用lOyg/mL的卡那霉素抗性板反向篩選，得到了丟 失兩個(gè)Iox位點(diǎn)間的kan基因。通過(guò)在無(wú)抗生素添加的LB培養(yǎng)基中傳代，最終篩選到消除質(zhì) 粒pMK4_cr e的枯草芽孢桿菌164S。
[0101 ] 亦即，本發(fā)明本質(zhì)上是用comk cassette(即xylR-PxylA-comk片段，序列參考SEQ NO. 2)替換了A164的中性蛋白酶編碼基因 nprE的部分序列。具體的，本發(fā)明的是枯草芽孢桿 菌164S將枯草芽孢桿菌A164中如SEQ NO. 11所示的序列敲除，并替換為如SEQ NO. 12所示的 序列。
[0102]亦即，被敲除的序列如SEQ ID NO.11所示，具體如下：
[0103] ttaggtaagaaattgtctgttgctgtcgctgcttcgtttatgagtttatcaatcagcctgccaggtgttcaggctgc tgaaggtcatcagcttaaagagaatcaaacaaatttcctctccaaaaacgcgattgcgcaatcagaactctctgcac caaatgacaaggctgtcaagcagtttttgaaaaagaacagcaacatttttaaaggtgacccttccaaaaggctgaag cttgttgaaagcacgactgatgcccttggatacaagcactttcgatatgcgcctgtcgttaacggagtgccaattaa agattcgcaagtgatcgttcacgtcgataaatccgataatgtctatgcggtcaatggtgaattacacaatcaatctg ctgcaaaaacagataacagccaaaaagtctcttctgaaaaagcgctggcactcgctttcaaagctatcggcaaatca ccagacgctgtttctaacggagcggccaaaaacagcaataaagccgaattaaaagcgatagaaacaaaagacggcag ctatcgtcttgcttacgacgtgacgattcgctatgtcgagcctgaacctgcaaactgggaagtcttagttgacgccg aaacaggcagcattttaaaacagcaaaataaagtagaacatgccgccgccactggaagcggaacaacgctaaagggc gcaactgttcctttgaacatctcttatgaaggcggaaaatatgttctaagagatctttcaaaaccaacaggcaccca aatcatcacatatgatttgcaaaacagacaaagccgccttccgggcacgcttgtctcaagcacaacgaaaacattta catcttcatcacagcgggcagccgttgacgcacactataacctcggtaaagtgtacgattatttttattcaaacttt aaacgaaacagctatgataacaaaggcagtaaaatcgtttcttccgttcactacggcactcaatacaataacgctgc atggacaggagaccagatgatttacggtgatggcgacggttcattcttctctccgctttccggctcattagatgtga cagcgcatgaaatgacacatggcgtcacccaagaaacagccaacttgatttatgaaaatcagccaggtgcattaaac gagtctttctctgacgtattcgggtattttaacgatacagaagactgggacatcggtgaagacattacggtcagcca gcctgctcttcgcagcctgtccaaccctacaaaatacaaccagcctgacaattacgccaattaccgaaaccttccaa acacagatgaaggcgattatggcggtgtacacacaaacagcggaattccaaacaaagccgcttacaacaccatcaca aaacttggtgtatctaaatcacagcaaatctattaccgtgcgttaacaacgtacctcacgccttcttccacgttcaa agatgccaaggcagctctcattcagtctgcccgtgacctctacggctcaactgatgccgctaaagttgaagcagcct ggaatgctgtt。
[0104] 替換為的新序列如SEQ ID NO.12所示，具體如下：
[0105] gctagctcatggcaagcatatcgtatgtaatatgcttgccatcatatgactttggatccaagagaatattttatatt tttgttcatgtaatcactccttcttaattacaaatttttagcatctaatttaacttcaattcctattatacaaaatt ttaagatactgcactatcaacacactcttaagtttgcttctaagtcttatttccataacttcttttacgtttccgcc attctttgctgtttcgatttttatgatatggtgcaagtcagcacgaacacgaaccgtcttatctcccattatatctt tttttgcactgattggtgtatcatttcgtttttcttttgtgctagaggatcaattcttgaagacgaaagggcctcgt gatacgcctatttttataggttaatgtcatgataataatggtttcttagacgtcaggtggcacttttcggggaaatg tgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataa atgcttcaataatattgaaaaaggaagagtgcggccgcccgcggctatttttctaataccgttccccgagctcacgc aaaataaaatcataaatcatcttcgtccgctcttctttcgggtacagcataaattcctgtcttttcggcacgcggtg gtcgattctgtcttggaatttggttctgagccacgctgttcggtatacctggttctcgaacgaattataagagatcg gcagctccatcgttttcccattggaaaacgtcacttccgtatcgtcgaattcagtcgctttgaattcttttacatgc acatgggaaatccagccgcattggggtcttgtcgaagaaagtgtagggaataaaaagatttggttcgaagggtccac catgatcggcggcttgtgtgaaatttttgtcacttcataagttcctgcttttcttcccgcatagcttgatccaaaaa atcggcagcttctgtcgacaatttgcagcggcttcatgtttacataaaacacgcaatctttttcaataattttggaa cagattttgccgtctatttcttctggcagcacggcaattgttgcgccgttcacttcatacgattctaaaggtgcgtc tgttttctgactcatattatggcctcctttggatcccatttccccctttgatttttagatatcactagtttggacca tttgtcatttccccctttgatttaagtgaacaagtttatccatcaactatcttaattgagttagtttgtttatccaa taaactaactttatctcatcatatacaaaataaatgtttatttcaatgttttttttagaaaatttagttataatatt agatatgatacttttaaatatctaattcaagcttcaaaaaacaccaacttagttcggtggataaacaaaggagtggt tattattcaaattgcagatcaagctttagtaaaaaaaatgaatcaaaaattaatattagatgaaattttgaagaact cccctgtctccagggcaactctctctgagattacaggattaaacaagtctactgtctcctctcaagtaaatacactg cttgaaaaagattttatttttgaaattggggcagggcaatctagaggcggcagaagacctgtaatgcttgtttttaa taagaatgcaggctactcgattggtattgatataggagtcgactatcttaacggaattctaaccgacttagaaggaa atattattctcgagaagacttctgacttgtctagttcttccgctagtgaagtaaaagagattttatttgcacttatt catggttttgtaacccatatgcctgagtccccttatggtctagtcggaataggaatttgtgttccaggccttgtaga tcgtcatcagcaaattattttcatgcctaacttaaattggaatatcaaagatttgcagtttttaattgagagtgagt ttaatgttccggtttttgttgaaaatgaagctaatgcaggagcatacggtgaaaaagtatttggtatgacaaaaaac tatgaaaacatcgtttacatcagtattaatatcggaattggaactggacttgttattaacaacgaattgtataaagg tgttcagggtttttctggggaaatgggtcatatgacgatagattttaatggacccaaatgcagctgtggaaatcgag gctgttgggaattatatgcttctgaaaaagcgttactggcttcgctctctaaagaagaaaagaatatttctcgaaaa gagattgtggaacgcgcaaataaaaatgatgtagaaatgttaaatgcacttcaaaactttggcttttatatcggaat tggattaaccaatatccttaatacatttgatatagaagctgttatcttgagaaatcatataattgaatctcatccca ttgttttaaatacgattaaaaacgaagtttcttctagagtccattctcatttagacaataaatgtgaactattgcct tcttcgttaggaaaaaatgcacctgctttaggagcggtttctatcgttattgattcttttttaagtgttacccctat aagttaggagctccccgggacgttcttgccattgctgcataaaaaacgcccggcggcaaccgagcgttctgaattaa ttaatcatcgcgacggtacc〇
[0106] 利用普通的質(zhì)粒DNA(例如pMK4、pHT01等可在苦草芽孢桿菌中自助復(fù)制的穿梭質(zhì) 粒)對(duì)枯草芽孢桿菌164S進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化效率可以達(dá)到IO 4~IO5CFUAxg DNA。
[0107] 實(shí)例3枯草芽孢桿菌164S淀粉酶基因的敲除
[0108] 采用誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化的方式，可以方便地對(duì)枯草芽孢桿菌164S進(jìn)行基因操作。利用限制 性內(nèi)切酶Kpn I切割淀粉酶敲除質(zhì)粒pDG364后，不做產(chǎn)物的清潔，直接轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌 164S：
[0109] a)把平板活化的枯草芽孢桿菌164S落接種到3mL LB試管中，37°C、200rpm培養(yǎng)10 ~12h;
[0110] b)然取300yL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到預(yù)熱的3mL LB試管中，加入濾膜滅菌的的木糖溶液至 木糖終濃度為1%，37°C、200rpm培養(yǎng)3h;
[0111] c)分裝到2mL Eppendorf管中，按比例IOOng DNA/100yL培養(yǎng)液加入線性化的質(zhì)粒 后孵育，37 °C、200rpm培養(yǎng)1.5h。涂5yg/mL的氯霉素抗性板。37 °C，過(guò)夜培養(yǎng)。
[0112]挑取單克隆轉(zhuǎn)接篩選得到的菌于含2%。(質(zhì)量分?jǐn)?shù))可溶性淀粉的LB平板上，37°C 過(guò)夜培養(yǎng)，然后用碘液檢測(cè)淀粉水解圈的方式鑒定淀粉酶敲除情況，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖5,淀粉 酶基因敲除效率大于90%。由此可見(jiàn)，本發(fā)明所得到的新的苦草芽孢具有很強(qiáng)的操作性，具 有廣泛的應(yīng)用前景。
[0113]以上所述，僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并非對(duì)本發(fā)明任何形式上和實(shí)質(zhì)上的限制， 應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還將可以做出 若干改進(jìn)和補(bǔ)充，這些改進(jìn)和補(bǔ)充也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。凡熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員， 在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，當(dāng)可利用以上所揭示的技術(shù)內(nèi)容而做出的些許更 動(dòng)、修飾與演變的等同變化，均為本發(fā)明的等效實(shí)施例；同時(shí)，凡依據(jù)本發(fā)明的實(shí)質(zhì)技術(shù)對(duì) 上述實(shí)施例所作的任何等同變化的更動(dòng)、修飾與演變，均仍屬于本發(fā)明的技術(shù)方案的范圍 內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種枯草芽孢桿菌，所述枯草芽孢桿菌基因組中含有xylR-PxylA-comk表達(dá)單元，所 述xylR-PxylA-comk表達(dá)單元的序列包括5'至3'方向依次排列的xylR基因序列、xylA啟動(dòng) 子基因序列、comk基因序列。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌，其特征在于，所述xylR-PxylA-comk表達(dá)單元 的基因序列如SEQ ID NO. 12所示。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌，其特征在于，所述枯草芽孢桿菌由枯草芽孢桿 菌A164改造獲得。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的枯草芽孢桿菌，其特征在于，所述枯草芽孢桿菌是將枯草芽孢 桿菌A164中的中性蛋白酶基因 nprE敲除并替換為xylR-PxylA-comk表達(dá)單元構(gòu)建獲得。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的枯草芽孢桿菌，其特征在于，被敲除的中性蛋白酶基因 nprE的 基因序列如SEQ ID NO. 11所示。6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的枯草芽孢桿菌，其特征在于，所述枯草芽孢桿菌除了中性蛋白 酶基因 nprE被敲除和替換之外，還可經(jīng)過(guò)其他基因改造。7. -種制備如權(quán)利要求1~6任一權(quán)利要求所述枯草芽孢桿菌的方法，包括步驟:將枯 草芽孢桿菌A164中的中性蛋白酶基因 nprE敲除并替換為xylR-PxylA-comk表達(dá)單元。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，采用基因重組介導(dǎo)的基因操作敲除和替換 中性蛋白酶基因 nprE。9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，采用Cre-LoxP重組酶系統(tǒng)介導(dǎo)的基因重組 方法敲除和替換所述中性蛋白酶基因 nprE。10. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，還包括對(duì)所述枯草芽孢桿菌進(jìn)行了單個(gè) 或者多個(gè)感興趣目標(biāo)基因的改造。11. 如權(quán)利要求1~6任一權(quán)利要求所述枯草芽孢桿菌的用途，為將所述枯草芽孢桿菌 作為表達(dá)宿主。12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的用途，其特征在于，將所述枯草芽孢桿菌作為表達(dá)宿主用于 外源基因的高效表達(dá)。13. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的用途，其特征在于，將所述枯草芽孢桿菌作為表達(dá)宿主用于 工業(yè)多肽類產(chǎn)品、蛋白類產(chǎn)品、藥劑和酶制劑的高效表達(dá)。14. 一種表達(dá)外源基因的方法，包括如下步驟： 1) 構(gòu)建含有外源基因的重組表達(dá)載體； 2) 將步驟1)獲得的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染如權(quán)利要求1~6任一權(quán)利要求所述枯草芽孢桿 菌，并在合適表達(dá)所述外源基因的條件下培養(yǎng)所述宿主。
【文檔編號(hào)】C12N15/75GK105861405SQ201610297900
【公開(kāi)日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2016年5月6日
【發(fā)明人】孫俊松, 紀(jì)明華, 史吉平, 姜標(biāo)
【申請(qǐng)人】中國(guó)科學(xué)院上海高等研究院