本發(fā)明涉及一種環(huán)丙烷衍生物及其制備方法和在醫(yī)藥上的應用，具體是一種具有EGFR靶點抑制作用的新穎環(huán)丙烷衍生物或其立體異構體、水合物、溶劑化物、代謝產物、藥學上可接受的鹽、共晶或前藥、其藥物組合物以及其在醫(yī)藥上的應用。

背景技術：

細胞表面受體中的受體酪氨酸激酶超家族通過細胞外生長因子對細胞信號的調節(jié)起重要的作用。受體酪氨酸激酶能夠催化磷酸基團從ATP轉移至底物的酪氨酸基團上。當沒有配體激活受體酪氨酸激酶時，這些激酶處于未磷酸化的單體狀態(tài)，其激酶域呈非活性的結構。當配體與受體酪氨酸激酶的胞外段結合時，受體發(fā)生寡聚化，并且自磷酸化，增加激酶的催化活性的同時形成了信號蛋白的結合位點，信號蛋白與其結合，從而激活多條信號通路。這些信號通路相互聯(lián)系，調控細胞的增殖、生存、分化、功能、遷移和凋亡。當受體酪氨酸激酶失去調控，異常激活時，細胞會發(fā)生轉化成腫瘤細胞，增殖、生長能力和耐藥能力提高，具有較強的成血管能力、侵襲力和轉移能力(Yarden和Sliwkowski,2001,Nat Rev Mol Cell Biol,2,127-137)。

ErbB家族屬于受體酪氨酸激酶，包含四個成員：表皮生長因子受體(EGFR/HER1/ErbB1)、HER2(neu/ErbB2)、HER3(ErbB3)和HER4(ErbB4)(Olayioye,Neve等,2000,EMBO J,19,3159-3167；Yarden和Sliwkowski,2001,Nat Rev Mol Cell Biol,2,127-137)。它們都含有胞外配體結合域、單跨膜域和胞內酪氨酸激酶和調節(jié)域。其功能是催化ATP的磷酸基轉移至底物蛋白的酪氨酸基團上。配體依賴的受體寡聚化導致受體調節(jié)域的自磷酸化，從而發(fā)生胞內信號轉導，最終引起細胞增殖。該信號通路與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關。在多種腫瘤中，超活化的ErbB受體，尤其是EGFR，會導致生長因子信號的失調控。EGFR的激活通常是由于過表達或突變引起的持續(xù)活化或配體的自分泌表達。因此抑制EGFR是一個備受關注的抗腫瘤策略。許多靶向EGFR的小分子抑制劑相繼被開發(fā)，其中一些已經運用于臨床治療。

第一代的EGFR激酶抑制劑如吉非替尼、厄羅替尼在臨床上能有效治療非小細胞 肺癌，尤其是那些含有EGFR激酶域發(fā)生激活突變的非小細胞肺癌(Mok,Wu等,2009,N Engl J Med,361,947-957；Rosell,Moran等,2009,N Engl J Med,361,958-967)。最常見的EGFR激活突變是L858R和delE746_A750，相對于野生型的EGFR，這些突變能夠增加受體對吉非替尼和厄羅替尼的親和力，而降低受體對ATP的親和力(Carey,Garton等,2006,Cancer Res,66,8163-8171；Yun,Boggon等,2007,Cancer Cell,11,217-227)。

第二代的EGFR激酶抑制劑普遍具有喹啉結構，是不可逆的EGFR抑制劑。不同于吉非替尼，它們含有親電子能力，能夠與EGFR中保守的半胱氨酸基團(Cys 797)發(fā)生邁克爾加成反應。這些化合物的共價性質使它們相較于可逆的抑制劑，具有更強的占據ATP位點的能力，因此，盡管T790M突變能夠增加ATP的親和力，這類抑制劑在臨床前模型中還是足以抑制EGFR T790M(Engelman,Zejnullahu等,2007,Cancer Res,67,11924-11932；Li,Ambrogio等,2008,Oncogene,27,4702-4711)。第二代的EGFR激酶抑制劑以阿法替尼(Afatinib)，Dacomitinib(PF-00299804)和來那替尼(Neratinib)為代表。三者均為EGFR和HER2的不可逆抑制劑，治療機理除競爭性地占據EGFR上ATP結合位點外，還能與EGFR結合口袋開口處附近所特有氨基酸殘基發(fā)生烷基化作用或共價鍵結合，進而實現(xiàn)對EGFR的不可逆抑制。

隨著第一代EGFR激酶抑制劑的持續(xù)使用，日益凸顯的耐藥性成為不可回避的問題。由于獲得性耐藥的出現(xiàn)，吉非替尼和厄羅替尼的運用最終受到了限制。超過50％的肺癌患者都會出現(xiàn)獲得性耐藥，其中超過90％都含有EGFR的T790M看門殘基突變(Kobayashi,Boggon等,2005,N Engl J Med,352,786-792；Pao,Miller等,2005,PLoS Med,2,e73)。T790M突變并非從空間構象上阻礙藥物的結合，而是恢復受體對ATP的親和力，與野生型相當(Yun,Mengwasser等,2008,Proc Natl Acad Sci U S A,105,2070-2075)。第二代的EGFR激酶抑制劑可通過共價結合克服上述突變帶來的問題，大幅升高藥物濃度并提供持續(xù)的封閉效應，增強對腫瘤細胞的持久抑制。另外，明顯的皮膚毒性(如痤瘡樣皮疹)也是第一代EGFR激酶抑制劑所面臨的難題。第二代EGFR激酶抑制劑(如Afatinib)在這方面有了較好的改善。為了滿足臨床需求，需要繼續(xù)研發(fā)新的能夠有效克服T790M突變的EGFR抑制劑。

目前已有多篇文獻報道了蛋白激酶抑制劑及其抗腫瘤的用途。如：

CN102731485公開了可作為EGFR抑制劑的喹唑啉衍生物及其制備方法、藥物 組合物和用途。結構如下所示：

其中R₁選自苯環(huán)或取代的苯環(huán)，R₂選自氫或N，N-二甲氨基甲基，R₃選自甲氧乙基、四氫呋喃-3-基、(S)-四氫呋喃-3-基或(R)-四氫呋喃-3-基。

WO2012159457公開了一種喹唑啉衍生物類酪氨酸激酶抑制劑及其制備方法與應用。結構如下所示：

其中R¹選自未被取代或被1-3個相同或不同的取代的以下一組基團：C_1-6烷基、C_3-6烯基、C_3-6炔基、C_3-8環(huán)烷基C_0-6烷基、6-10元并環(huán)基C₆烷基、7-10元螺環(huán)基C_0-6烷基和7-10元橋環(huán)基C_0-6烷基等；R²選自未被取代或被1～2個相同或不同的Q₂取代的以下一組基團：C_3-4環(huán)烷基C_0-6烷基、6-10元并環(huán)基C_0-6烷基、7-10元螺環(huán)基C_0-6烷基和7-10元橋環(huán)基C₆烷基，且所述環(huán)烷基、并環(huán)基、螺環(huán)基和橋環(huán)基中的碳原子可以被1-3個相同或不同的O、S(O)_m、N(H)_n和/或C(O)替換，但經替換后的環(huán)中不存在"-O-C(O)-"酯結構，而且當R²為7-10元橋環(huán)基CQ-6烷基時，R¹不為C_3-4環(huán)烷基C_0-6烷基或C_1-6烷基；Q₂選自下列一組基團：鹵素原子，羥基，氨基，羧基，氰基，硝基，三氟甲基，d.6烷基，C_1-6烷氧基，C_1-6烷基氨基，二(C_1-6烷基)氨基，C_1-6烷基羰氧基，C_1-6烷氧基羰基，C_1-6烷基酰氨基，C_1-6烷基磺?；珻_1-6烷基亞磺?；虲_1-6烷基磺酰氨基。

CN102898386公開了一種喹唑啉衍生物、其制備方法、中間體、組合物及其應用。結構如下所示：

其中R₁為取代或未取代的C₆～C₁₀芳基或取代或未取代的C₃～C₁₂雜芳基，R₂為氫、鹵素、羥基、氨基、C₁～C₆烷基或C₁～C₆鹵代烷基、C₂～C₆鏈烯基、C₂～C₆炔基、C₁～C₆烷氧基、C₁～C₆烷氧基取代的C₁～C₆烷氧基、3-8元環(huán)烷基氧基、C₂～C₆鏈烯基氧基、C₂～C₆炔基氧基、2-7個碳原子的烷氧基甲基、C₁～C₆烷硫基、C₁～C₆烷基亞磺?；?、C₁～C₆烷基磺酰基、C₁～C₆烷基亞磺酰胺基、氰基、羧基、2-7個碳原子的烷氧羰基烷基、2-7個碳原子的烷氧羰基烷氧基、C₁～C₆烷基氨基、2-12個碳原子的二烷基氨基、1-6個碳原子的N-烷基氨基甲?；?-12個碳原子的N，N-二烷基氨基甲?；?、R₅-(CH₂)_a-Y-、R₅-(CH₂)_b-Z-(CH₂)_a-Y-或Het-W-(CH₂)_a-Y-；X為鹵素原子，R₃和R₄各自獨立地為氫、C₁～C₆烷基、R₆R₇N-(CH₂)c-、R₆R₇N-(CH₂)c-Y-(CH₂)b-或Het-W-(CH₂)d-。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種新穎的具有EGFR抑制劑活性的取代環(huán)丙烷衍生物或其立體異構體、水合物、代謝產物、溶劑化物、藥學上可接受的鹽、共晶或前藥及其在制備治療癌癥相關藥物中的用途。

本發(fā)明提供一種通式(I)所示的化合物或其立體異構體、水合物、代謝產物、溶劑化物、藥學上可接受的鹽、共晶或前藥，其中：

R¹獨立選自選自F、Cl、Br、三氟甲基、甲基、乙基、乙炔基、-OCH₂-苯環(huán)、-OCH₂-噻唑或-OCH₂-吡啶，優(yōu)選F、Cl、Br、三氟甲基或乙炔基，更優(yōu)選F或Cl，所述的苯環(huán)、噻唑或吡啶任選進一步被0、1、2、3或4個選自F、Cl、Br、甲基或三氟甲基的取代基所取代；

R²選自選自H、F、Cl、Br、甲氧基、乙氧基、甲氧乙氧基或優(yōu)選H、甲氧基、乙氧基或更優(yōu)選

n選自0、1、2、3、4或5，優(yōu)選1、2或3。

本發(fā)明優(yōu)選方案，一種通式(I)所述的化合物，其中該化合物選自如下結構之一：

根據本發(fā)明的具體實施方案，本發(fā)明的化合物或其立體異構體、水合物、代謝產物、溶劑化物、藥學上可接受的鹽、共晶或前藥，其中所述的鹽選自鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽、醋酸鹽、三氟乙酸鹽、硫氰酸鹽、馬來酸鹽、羥基馬來酸鹽、戊二酸鹽、甲磺酸鹽、乙磺酸鹽、苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽、苯甲酸鹽、水楊酸鹽、苯乙酸鹽、肉桂酸鹽、乳酸鹽、丙二酸鹽、特戊酸鹽、琥珀酸鹽、富馬酸鹽、蘋果酸鹽、扁桃酸鹽、酒石酸鹽、沒食子酸鹽、葡萄糖酸鹽、月桂酸鹽、棕櫚酸鹽、果膠酸鹽、苦味酸鹽、檸檬酸鹽或者它們的組合；優(yōu)選的，所述的鹽選自鹽酸鹽、氫溴酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽、醋酸鹽、馬來酸鹽、甲磺酸鹽、苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽、苯甲酸鹽、水楊酸鹽、肉桂酸鹽、乳酸鹽、丙二酸鹽、琥珀酸鹽、富馬酸鹽、蘋果酸鹽、酒石酸鹽、檸檬酸鹽或者它們的組合。

本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，所述的組合物包括：有效劑量的本發(fā)明所述的 化合物或其立體異構體、水合物、代謝產物、溶劑化物、藥學上可接受的鹽、共晶或前藥，以及藥學上可接受的載體、稀釋劑、佐劑、媒介物或賦形劑；所述的組合物還可進一步包括一種或多種其他治療劑。

根據本發(fā)明的具體實施方案，本發(fā)明的藥物組合物中所述的其他治療劑包括：順鉑(cisplatin)、卡鉑(carboplatin)、奧沙利鉑(oxaliplatin)、達卡巴嗪(dacarbazine)、替莫唑胺(temozolomide)、丙卡巴肼(procarbazine)、甲氨蝶呤(methotrexate)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、阿糖胞苷(cytarabine)、吉西他濱(gemcitabine)、巰基嘌呤(mercaptopurine)、氟達拉濱(fludarabine)、長春堿(vinblastine)、長春新堿(vincristine)、長春瑞濱(vinorelbine)、紫杉醇(paclitaxel)、多西紫杉醇(docetaxel)、拓撲替康(topotecan)、伊立替康(irinotecan)、依托泊苷(etoposide)、曲貝替定(trabectedin)、更生霉素(dactinomycin)、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、道諾霉素(daunorubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、博來霉素(bleomycin)、絲裂霉素C(mitomycin)、伊沙匹隆(ixabepilone)、他莫昔芬(tamoxifen)、氟他胺(flutamide)、西羅莫司(sirolimus)、阿法替尼(afatinib)、alisertib、amuvatinib、阿帕替尼(apatinib)、阿西替尼(axitinib)、硼替佐米(bortezomib)、波舒替尼(bosutinib)、布立尼布(brivanib)、卡博替尼(cabozantinib)、西地尼布(cediranib)、crenolanib、克卓替尼(crizotinib)、達拉非尼(dabrafenib)、達可替尼(dacomitinib)、達魯舍替(danusertib)、達沙替尼(dasatinib)、多韋替尼(dovitinib)、厄洛替尼(erlotinib)、foretinib、ganetespib、吉非替尼(gefitinib)、依魯替尼(ibrutinib)、埃克替尼(icotinib)、伊馬替尼(imatinib)、iniparib、拉帕替尼(lapatinib)、lenvatinib、linifanib、linsitinib、馬賽替尼(masitinib)、momelotinib、莫替沙尼(motesanib)、來那替尼(neratinib)、尼羅替尼(nilotinib)、尼拉帕尼(niraparib)、oprozomib、奧拉帕尼(olaparib)、帕唑帕尼(pazopanib)、pictilisib、帕納替尼(ponatinib)、奎扎替尼(quizartinib)、瑞格非尼(regorafenib)、氯構色替(rigosertib)、rucaparib、魯索替尼(ruxolitinib)、塞卡替尼(saracatinib)、saridegib、索拉非尼(sorafenib)、舒尼替尼(sunitinib)、替拉替尼(telatinib)、tivantinib、替肟扎尼(tivozanib)、托法替尼(tofacitinib)、曲美替尼(trametinib)、凡德他尼(vandetanib)、維利帕尼(veliparib)、威羅菲尼(vemurafenib)、維莫德吉(vismodegib)、volasertib、阿侖單抗(alemtuzumab)、貝伐單抗(bevacizumab)、布妥昔單抗(brentuximab vedotin)、卡妥索單抗(catumaxomab)、西 妥昔單抗(cetuximab)、地諾單抗(denosumab)、吉妥珠單抗(gemtuzumab)、伊匹單抗(ipilimumab)、尼妥珠單抗(nimotuzumab)、奧法木單抗(ofatumumab)、帕尼單抗(panitumumab)、利妥昔單抗(rituximab)、托西莫單抗(tositumomab)、曲妥珠單抗(trastuzumab)或它們的組合。

本發(fā)明還提供了所述的化合物或其立體異構體、水合物、代謝產物、溶劑化物、藥學上可接受的鹽、共晶或前藥或者所述的藥物組合物在作為一種EGFR受體酪氨酸激酶抑制劑在制備藥物制劑的應用，特別是在用于制備用于治療和/或預防過度增殖性疾病的藥物制劑中的應用。

根據本發(fā)明的具體實施方案，本發(fā)明的化合物或其立體異構體、水合物、代謝產物、溶劑化物、藥學上可接受的鹽、共晶或前藥或者所述的藥物組合物的應用中，所述過度增殖性疾病包括腦瘤、非小細胞肺癌、表皮鱗癌、膀胱癌、胰腺癌、結腸癌、乳腺癌、卵巢癌、子宮頸癌、子宮內膜癌、結直腸癌、腎癌、食管腺癌、食管鱗狀細胞癌、實體瘤、非霍奇金淋巴瘤、肝癌、肺癌，胃癌、皮膚癌、甲狀腺癌、頭頸癌、前列腺癌、神經膠質瘤和鼻咽癌中的一種或多種；優(yōu)選非小細胞肺癌、乳腺癌、表皮鱗癌、胃癌和結腸癌的一種或多種。

具體實施方式

以下通過具體實施例詳細說明本發(fā)明的實施過程和產生的有益效果，旨在幫助閱讀者更好地理解本發(fā)明的實質和特點，不作為對本案可實施范圍的限定。

化合物的結構是通過核磁共振(NMR)或(和)質譜(MS)來確定的。NMR位移(δ)以10^-6(ppm)的單位給出。

NMR的測定是用(Bruker Avance III 400和Bruker Avance 300)核磁儀，測定溶劑為氘代二甲基亞砜(DMSO-d₆)，氘代氯仿(CDCl₃)，氘代甲醇(CD₃OD)，內標為四甲基硅烷(TMS)。

MS的測定用(Agilent 6120B(ESI)和Agilent 6120B(APCI))。

HPLC的測定使用安捷倫1260DAD高壓液相色譜儀(Zorbax SB-C18100×4.6mm)。

薄層層析硅膠板使用煙臺黃海HSGF254或青島GF254硅膠板，薄層色譜法(TLC)使用的硅膠板采用的規(guī)格是0.15mm～0.20mm，薄層層析分離純化產品采用 的規(guī)格是0.4mm～0.5mm。

柱層析一般使用煙臺黃海硅膠200～300目硅膠為載體。

本發(fā)明的已知的起始原料可以采用或按照本領域已知的方法來合成，或可購買于泰坦科技、安耐吉化學、上海德默、成都科龍化工、韶遠化學科技、百靈威科技等公司。

氮氣氛是指反應瓶連接一個約1L容積的氮氣氣球。

氫氣氛是指反應瓶連接一個約1L容積的氫氣氣球。

氫化反應通常抽真空，充入氫氣，反復操作3次。

實施例中無特殊說明，反應在氮氣氛下進行。

實施例中無特殊說明，溶液是指水溶液。

實施例中無特殊說明，反應的溫度為室溫。

室溫為最適宜的反應溫度，為20℃～30℃。

M為摩爾每升。

實施例1：N-[4-(3-氯-4-氟-苯氨基)-7-[(3S)-四氫呋喃-3-基]氧基-喹唑啉-6-基]-2-環(huán)丙基-丙-2-烯酰胺(化合物1)

N-[4-(3-chloro-4-fluoro-anilino)-7-[(3S)-tetrahydrofuran-3-yl]oxy-quinazolin-6-yl]-2-cyclopropyl-prop-2-enamide

第一步：2-(三氟甲磺酸基)丙-2-烯酸甲酯(1B)

methyl 2-(trifluoromethylsulfonyloxy)prop-2-enoate

將2-羰基丙酸甲酯(1A)(5.0g,4.9mmol)溶于二氯甲烷(50mL)中，氮氣保護。0℃加入三氟甲磺酸酐(13.8g,4.9mmol)，再加入N,N-二異丙基乙基胺(6.3g,4.9mmol)，室溫反應2小時。反應液加入水(50mL)，萃取分層。水相用二氯甲烷(50mL×1)萃取，合并有機相，無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液減壓濃縮。殘留物用硅膠柱色譜分離提純(乙酸乙酯：石油醚(v/v)＝0:1～1:99)，得到標題化合物2-(三氟甲磺酸基)丙-2-烯酸甲酯(1B)，無色油狀(4g，產率35％)。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ6.33(d,1H),5.85(d,1H),3.90(s,3H).

第二步：2-環(huán)丙基丙-2-烯酸甲酯(1C)

methyl 2-cyclopropylprop-2-enoate

將2-(三氟甲磺酸基)丙-2-烯酸甲酯(1B)(2g,8.5mmol)、環(huán)丙基硼酸(1.1g,12.8mmol)、磷酸鉀(2.72g,12.8mmol)和[1,1'-雙(二苯基膦基)二茂鐵]二氯化鈀(0.62g, 0.85mmol)加入到四氫呋喃(10mL)中，80℃微波反應2小時。反應液濃縮，加入水(20mL)，萃取分層。水相用(20mL×1)萃取，有機相用無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液減壓濃縮。殘留物用硅膠柱色譜分離提純(乙酸乙酯：石油醚(v/v)＝1:19～1:5)，得到標題化合物2-環(huán)丙基丙-2-烯酸甲酯(1C)，無色液體(0.60g，產率55.6％)。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ6.02(d,1H),5.31(t,1H),3.78(s,3H),1.75(m,1H),0.82–0.76(m,2H),0.54–0.45(m,2H).

第三步：2-環(huán)丙基丙-2-烯酸(1D)

2-cyclopropylprop-2-enoic acid

將2-環(huán)丙基丙-2-烯酸甲酯(1C)(1.0g,7.9mmol)溶于四氫呋喃(5mL)和水(5mL)中，加入氫氧化鋰一水合物(0.95g,40mmol)，60℃反應3小時。反應液加入二氯甲烷(10mL)和水(10mL)，萃取。水相用4M鹽酸調節(jié)pH至2～3，用二氯甲烷(10mL×3)萃取，合并有機相，無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液減壓濃縮，得到標題化合物2-環(huán)丙基丙-2-烯酸(1D)，無色液體(0.50g，產率56％)。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ10.50(s,1H),6.19(d,1H),5.43(s,1H),1.75(m,1H),0.86–0.77(m,2H),0.57–0.49(m,2H).

第四步：N-[4-(3-氯-4-氟-苯氨基)-7-[(3S)-四氫呋喃-3-基]氧基-喹唑啉-6-基]-2-環(huán)丙基-丙-2-烯酰胺(化合物1)

N-[4-(3-chloro-4-fluoro-anilino)-7-[(3S)-tetrahydrofuran-3-yl]oxy-quinazolin-6-yl]-2-cyclopropyl-prop-2-enamide

將2-環(huán)丙基丙-2-烯酸(1D)(0.132g,1.17mmol)溶于吡啶(8mL)中，加入N⁴-(3- 氯-4-氟-苯基)-7-[(3S)-四氫呋喃-3-基]氧基-喹唑啉-4,6–二胺(1E)(0.200g,0.534mmol)，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(0.511g,2.67mmol)，室溫反應4小時。反應液濃縮，殘留物用硅膠柱色譜分離提純(乙酸乙酯：石油醚(v/v)＝2:3～9:1)，得到標題化合物N-[4-(3-氯-4-氟-苯氨基)-7-[(3S)-四氫呋喃-3-基]氧基-喹唑啉-6-基]-2-環(huán)丙基-丙-2-烯酰胺(化合物1)，黃色固體(0.15g，產率60％)。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ9.20(s,1H),9.05(s,1H),8.58(s,1H),8.34(s,1H),7.81(d,1H),7.49(s,1H),7.16(s,1H),6.99(t,1H),6.26(s,1H),5.48(s,1H),5.16(s,1H),4.19–3.88(m,4H),2.39(dd,1H),2.30–2.17(m,1H),1.62(s,1H),1.00(d,2H),0.69(s,2H)；

¹⁹F NMR(376MHz,CDCl₃)δ-119.84；

LCMS m/z＝469.0[M+1]。

生物測試例

測試例1：測試癌細胞生長抑制

連續(xù)傳代腫瘤細胞經胰蛋白酶消化，懸于培養(yǎng)基，計數后種入96孔細胞培養(yǎng)板。非小細胞肺癌細胞NCI-H1975每孔10000個細胞，人上皮細胞癌細胞A431細胞系每孔10000個細胞，在37℃，5％CO₂孵箱中，培養(yǎng)過夜。第二天每種細胞取6個孔加入30μl 50％三氯乙酸固定；其余各孔分別加入得自實施例的化合物。待測化合物以DMSO配置成溶液，最高濃度10μM，按下述方法5倍稀釋10個待測濃度。對于NCI-H1975、A431細胞系，用含0.1％FBS的培養(yǎng)基梯度稀釋待測，并使其為終濃度2倍。將種植NCI-H1975、A431細胞的96孔細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)基換為新鮮含0.1％FBS的培養(yǎng)基(每孔100μl)，再加入100μl含2倍終濃度的待測化合物。各96孔細胞培養(yǎng)板在37℃，5％CO₂細胞培養(yǎng)箱孵育72小時。然后每孔加入50μl 50％三氯乙酸，置于4℃冰箱中固定1小時。

將各孔中的三氯乙酸棄去，用300μl雙蒸水洗5次。室溫下干燥后，每孔加入50μl0.4％SRB(Sulforhodamine-B)染料溶液(1％乙酸/0.4％SRB)，反應15min。棄去各孔的染料溶液，用1％乙酸洗6-7次，室溫干燥。各孔加入200μl 10mM Tris溶液(pH＝10.5)，振蕩溶解。用酶標儀測定各孔490nm吸光度。以待測化合物濃度為0的孔的讀數為對照，使用origin7.5計算和分析實施例化合物的半效抑制濃度(IC₅₀)。

本發(fā)明化合物的抗腫瘤細胞增殖活性通過以上的試驗進行測定，測得的IC₅₀值見 表1。

表1 抗腫瘤細胞增殖活性試驗結果

生物測試例2：藥代動力學評價

雄性SD大鼠(購自維通利華實驗動物有限公司)180-240g，禁食給水過夜，3只大鼠口服灌胃5mg/kg，3只大鼠靜脈注射1mg/kg?？诜o藥組，化合物以0.5％甲基纖維素(MC)溶液(含0.4％吐溫80)配制成0.5mg/mL的混懸液，在給藥前和在給藥后30分鐘以及1、2、4、6、8、12和24小時采血；靜脈給藥組，化合物以10％的DMA，20％Solutol HS-15(30％，w/v)和70％生理鹽水配制成0.2mg/mL的溶液，在給藥前和在給藥后5、15和30分鐘以及1、2、4、8、12和24小時采血。血液樣品5500轉/分鐘離心10分鐘，收集血漿，于-30℃保存。取各時間點大鼠血漿10μL，加入含內標的乙腈溶液500μL混合后，渦旋混合4分鐘，3700轉/分鐘離心18分鐘，取上清液70μL與70μL水混合，取混和液5μL進行LC-MS/MS分析。主要藥代動力學參數用WinNonlin 6.3軟件非房室模型分析，藥代動力學評價試驗結果見表2。

表2 藥代動力學評價試驗結果

結論：本發(fā)明化合物表現(xiàn)出明顯優(yōu)于對照藥物Afatinib的藥代動力學特征。