專利名稱：清開靈活性組分金銀花提取物在制備抗多重耐藥菌的藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及金銀花的一種新的醫(yī)藥用途，具體地說是在金銀花提取物制備抗多重耐藥菌藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
多重耐藥菌(multiple resistant bacteria)是指有多重耐藥性的病原菌,即一種微生物對三類(比如氨基糖苷類、紅霉素、B —內(nèi)酰胺類)或三類以上抗生素同時(shí)耐藥。其中最為多見的是NDM-1、MDR-TB、MDR-MRSA以及常在I⑶中出現(xiàn)的鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌。NDM_l(New Delhi metallo-β-lactamase-l,新德里金屬 β -內(nèi)酸胺酶)，又名 NDM-1 細(xì)菌，是一種耐碳青霉烯類的酶。NDM-1基因常由質(zhì)粒攜帶，但也整合在細(xì)菌的染色體上， 易于在不同的菌株間傳播和擴(kuò)散，NDM-1編碼的蛋白單體分子量為28kDa，它的序列和其他 MBL的序列相似性很低。NDM-1主要分布在腸桿菌科和鮑曼不動桿菌中，攜帶NDM-1的細(xì)菌不但包括條件致病菌，也包括致病菌，如常見的志賀氏菌、霍亂、綠膿假單胞桿菌等。它具有高度耐藥性，幾乎可以水解臨床常用的一線抗菌藥物，包括β_內(nèi)酰胺類、碳青霉烯類、氟喹諾酮類、氨基糖苷等。長期以來，抗生素藥物的濫用，是催生多重耐藥菌的重要原因。目前，多重耐藥菌感染呈現(xiàn)出增長趨勢，但抗菌藥物選擇方案卻很少，因此重耐藥菌感染已成為全球性棘手問題。
金銀花(忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.、紅腺忍冬Lonicera hypoglauca Miq.、山銀花 Lonicera confusa DC.或毛花柱忍冬 Lonicera dasystyla Rehd.的干燥花蕾或帶初開的花)為清熱解毒復(fù)方中藥清開靈注射液的主要原料藥，具有宣散風(fēng)熱、清解血毒的功效，對各種熱性病，如身熱、發(fā)疹、發(fā)斑、熱毒瘡癰、咽喉腫痛等證具有顯著治療效果。開發(fā)和研究金銀花更多更好的醫(yī) 藥功效，是許多中醫(yī)藥學(xué)領(lǐng)域的重要研究課題之一。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是要開發(fā)金銀花提取物的新醫(yī)藥用途，同時(shí)為臨床提供一種可有效拮抗多重耐藥菌的藥物。
本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)長期研究發(fā)現(xiàn)金銀花提取物對含NDM-1耐藥基因細(xì)菌具有顯著地抑制作用，且與藥物濃度成正比，從而發(fā)明了金銀花提取物的一種新的醫(yī)藥用途，即完成了金銀花提取物在制備抗多重耐藥菌藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明所述的金銀花提取物可按照常規(guī)的中藥提取方法進(jìn)行。
本發(fā)明在此提供的方法如下
(I)取金銀花適量，加水煮沸兩次，過濾，合并兩次濾液；
(2)所得濾液濃縮至原藥材I 2倍量體積，加乙醇，冷藏，過濾，濾液回收乙醇至無醇味，加水稀釋，調(diào)節(jié)PH值為至弱酸性，過濾；
(3)將所得濾液上大孔吸附樹脂，依次用水、乙醇洗脫，收集洗脫液，過濾，減壓回收乙醇至無醇味，得金銀花提取物，冷藏。
其中，步驟(I)中加水煮沸，第一次加水10倍量，煮沸I小時(shí)，第二次加水8倍量， 煮沸O. 5小時(shí)；步驟(2)中加乙醇使含醇量達(dá)80%，冷藏2 4天，加水稀釋至相對密度為1. 05 1. 2 (60°C)，所述pH值是5 ;步驟(3)中，洗脫劑水的用量是6 8倍量柱體積，乙醇是10 12倍量柱體積的20%乙醇。
本發(fā)明中所述金銀花提取物，可按照現(xiàn)有技術(shù)所述方法制備成金銀花顆粒、金銀花沖劑、金銀花注射劑、金銀花膠囊等藥物制劑。
本發(fā)明中所述的多重耐藥菌是指含有NMD-1基因的多重耐藥菌，包括乙酸鈣不動桿菌(Acinetobacter calcoaceticus)、鮑曼不動桿菌(Acinetobacter baumannii, A. baumannii)、嗜麥芽寡養(yǎng)窄食單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)或含 NDM-1 耐藥基因大腸桿菌(Escherichia coli)。
上述含NDM-1耐藥基因檢測菌 株為革蘭氏陰性菌，具有較強(qiáng)的致病性和抗生素耐藥性。其中，乙酸鈣不動桿菌和鮑曼不動桿菌可引起肺部感染、傷口及皮膚感染、泌尿生殖系統(tǒng)感染、菌血癥菌血癥、腦膜炎等，麥芽寡養(yǎng)窄食單胞菌能引起嚴(yán)重的呼吸系統(tǒng)感染等， 含NDM-1耐藥基因大腸桿菌可引發(fā)對腸道感染且對抗生素具有抗藥性。
更進(jìn)一步地，本發(fā)明還提供了金銀花提取物在制備抗乙酸鈣不動桿菌的藥物中的應(yīng)用，即金銀花提取物在制備治療和/或預(yù)防乙酸鈣不動桿菌引起的疾病的藥物中的應(yīng)用。
更進(jìn)一步地，本發(fā)明還提供了金銀花提取物在制備抗鮑曼不動桿菌的藥物中的應(yīng)用，即金銀花提取物在制備治療和/或預(yù)防鮑曼不動桿菌引起的疾病的藥物中的應(yīng)用。
更進(jìn)一步地，本發(fā)明還提供了金銀花提取物在制備抗嗜麥芽寡養(yǎng)窄食單胞菌的藥物中的應(yīng)用，即金銀花提取物在制備治療和/或預(yù)防嗜麥芽寡養(yǎng)窄食單胞菌引起的疾病的藥物中的應(yīng)用。
更進(jìn)一步地，本發(fā)明還提供了金銀花提取物在制備抗含NDM-1耐藥基因細(xì)菌的藥物中的應(yīng)用。
更進(jìn)一步地，本發(fā)明還提供了金銀花提取物在制備抗含NDM-1耐藥基因大腸桿菌的藥物中的應(yīng)用，即金銀花提取物在制備治療和/或預(yù)防含NDM-1耐藥基因大腸桿菌引起的疾病的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明所述金銀花制劑可用于治療上述由含NDM-1耐藥基因多重耐藥細(xì)菌引發(fā)的疾病，如含NDM-1耐藥基因多重耐藥細(xì)菌引發(fā)的腸道感染、呼吸系統(tǒng)感染、傷口及皮膚感染、泌尿生殖系統(tǒng)感染、菌血癥菌血癥、腦膜炎等，尤其是適用于治療由乙酸鈣不動桿菌、鮑曼不動桿菌、嗜麥芽寡養(yǎng)窄食單胞菌或含NDM-1耐藥基因大腸桿菌引發(fā)的疾病。
本發(fā)明所述藥物制劑在作為本發(fā)明的用途使用時(shí)，其具體用量時(shí)可根據(jù)臨床實(shí)驗(yàn)以及患者的具體情況確定。具體實(shí)施方案
以下通過實(shí)施例和試驗(yàn)例來進(jìn)一步闡述本發(fā)明所述藥物的有益效果。
實(shí)施例1
金銀花提取物的制備方法
(I)取金銀花適量，加水煮沸兩次，第一次加10倍量的水，煮沸I小時(shí)，第二次加8 倍量的水，煮沸O. 5小時(shí)，過濾，合并兩次濾液；(2)所得濾液濃縮至原藥材I 2倍量體積時(shí)，加乙醇使含醇量達(dá)80%，冷藏2 4天，過濾，濾液回收乙醇至無醇味，加水稀釋到相對密度為1. 05 1. 2 (60°C)，調(diào)節(jié)pH值為5，過濾；(3)將所得濾液上大孔吸附樹脂，依次用 6 8倍量柱體積的水洗脫、10 12倍量柱體積的20%乙醇洗脫，收集洗脫液，過濾，減壓回收乙醇至無醇味，得金銀花提取物，冷藏。
藥效學(xué)試驗(yàn)
試驗(yàn)例I
金銀花提取物對含NDM-1耐藥基因細(xì)菌的抑菌效果研究
本藥效學(xué)試驗(yàn)所采用的檢測菌株乙酸I丐不動桿菌(Acinetobacter calcoaceticus, A.calcoaceticus)、鮑曼不動桿菌(Acinetobacter baumannii, A.baumannii)和嗜麥芽寡養(yǎng)窄食單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia, S. maltophilia),均含有 blaNDM-Ι 耐藥基因；pGEX-4T-NDMl_DH5 α 是含 NDM-1 重組質(zhì)粒的大腸桿菌(Escherichia coli, E. coli) ；pGEX-4T-NDM-l-BL21 (在大腸桿菌 BL21 中表達(dá) NDM-1)是含NDM-1重組質(zhì)粒的大腸桿菌(Escherichia coli, E. coli)，其質(zhì)粒上帶有GST 標(biāo)簽。上述菌株均由中國人民解放軍疾病預(yù)防控制所提供。
配制LB瓊脂培養(yǎng)基，高壓冷卻至60°C時(shí)，取金銀花提取物，按1:9 (藥物L(fēng)B，V/ V)比例配制不同 濃度藥物(O. lg/ml、0. 2g/ml、0. 3g/ml)平板，瓊脂厚度3_4mm，制備藥物平板，備用。
研究金銀花對含NDM-1耐藥基因細(xì)菌講行抑菌實(shí)驗(yàn):
將4株含NDM-1基因耐藥菌株乙酸鈣不動桿菌、鮑曼不動桿菌、嗜麥芽寡養(yǎng)窄食單胞菌及大腸桿菌PGEX-4T-NDM1-DH5 α分別接種于含16 μ g/ml亞胺培南的LB液體培養(yǎng)基中，37°C、200rpm培養(yǎng)過夜，次日菌液用無菌PBS緩沖液稀釋10倍后，分別吸取2 μ I接種于藥物瓊脂平板表面或采用劃線法接種，平板置于37°C孵育24h左右，觀察各菌株生長狀況， 得金銀花提取物的抑菌性測定結(jié)果，見表I。
采用瓊脂稀釋法對金銀花提取物的最小抑菌濃度(MIC)進(jìn)行測定，將耐藥菌株接種于不同藥物濃度的瓊脂平板上，37°C孵育24h左右，觀察各菌株生長狀況，抑制菌株不能生長的最小藥物濃度(MIC值)分別為乙酸鈣不動桿菌O. 2g/ml、鮑曼不動桿菌O. 2g/ml、嗜麥芽寡養(yǎng)窄食單胞菌 O. lg/ml、pGEX-4T-NDM-l-BL21 O. 2g/mL·
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明金銀花對耐藥菌株均有抑制作用，隨著藥物濃度的增加，抑制作用明顯增強(qiáng)，說明金銀花對含NDM-1耐藥基因耐藥菌都有抑制作用，且抑菌效果明顯；藥物對不同檢測菌株的抗菌能力不同，MIC也有所差異，具有較強(qiáng)的廣譜抗含NDM-1耐藥基因耐藥菌的能力。
表I金銀花提取物濃度對菌株的影響
權(quán)利要求
1.金銀花提取物在制備抗多重耐藥菌的藥物中的應(yīng)用。
2.金銀花提取物在制備抗含NDM-1耐藥基因細(xì)菌的藥物中的應(yīng)用。
3.金銀花提取物在制備抗乙酸鈣不動桿菌的藥物中的應(yīng)用。
4.金銀花提取物在制備抗鮑曼不動桿菌的藥物中的應(yīng)用。
5.金銀花提取物在制備抗嗜麥芽寡養(yǎng)窄食單胞菌的藥物中的應(yīng)用。
6.金銀花提取物在制備抗含NDM-1耐藥基因大腸桿菌的藥物中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任意一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，所述金銀花提取物是由金銀花藥材加水煮沸兩次，過濾，合并兩次濾液，所得濾液濃縮后加乙醇使含醇量達(dá)80%，冷藏，過濾，濾液回收乙醇至無醇味，加水稀釋到相對密度為1. 05 1.2 (60°C)，調(diào)節(jié)pH值為5，過濾，將所得濾液上大孔吸附樹脂，依次用6 8倍量柱體積的水洗脫、10 12倍量柱體積的20%乙醇洗脫，收集洗脫液，過濾，減壓回收乙醇至無醇味，即得。
全文摘要
本發(fā)明涉及清開靈活性組分金銀花提取物用對乙酸鈣不動桿菌(Acinetobactercalcoaceticus)、鮑曼不動桿菌(Acinetobacterbaumannii，A.baumannii)、嗜麥芽寡養(yǎng)窄食單胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)及含NDM-1耐藥基因大腸桿菌(Escherichiacoli)具有抑制作用，因此它可用于抑制這些細(xì)菌病并用于治療和/或預(yù)防這些細(xì)菌引起的疾病。
文檔編號A61K133/00GK102988456SQ201210549678
公開日2013年3月27日 申請日期2012年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月17日
發(fā)明者劉軍鋒, 袁靜, 張狀年, 黃留玉, 李 東, 王雪松, 姜海 申請人:河北神威藥業(yè)有限公司