專(zhuān)利名稱(chēng)：共表達(dá)陰離子配體生產(chǎn)重組陽(yáng)離子抗菌肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物基因工程領(lǐng)域，具體是一種共表達(dá)陰離子配體生產(chǎn)重組陽(yáng)離子抗
菌肽的方法。
背景技術(shù)：
陽(yáng)離子抗菌肽(英文名cationic antimicrobial p印tides， AMPs)，是一類(lèi)帶凈 正電荷的兩性小分子多肽，在動(dòng)物、植物和微生物中廣泛存在，其殺菌譜寬、免疫原性低；陽(yáng) 離子抗菌肽與細(xì)菌細(xì)胞膜作用，在膜上形成離子通道，引起細(xì)胞內(nèi)含物外滲而死亡，對(duì)于這 種獨(dú)特的殺菌機(jī)制不易產(chǎn)生耐藥菌株。而由于動(dòng)物細(xì)胞膜成分與細(xì)菌細(xì)胞膜成分在電荷等 方面存在差異，陽(yáng)離子抗菌肽對(duì)動(dòng)物細(xì)胞的毒性通常較小。在當(dāng)前耐藥性問(wèn)題日趨突出、對(duì) 新藥物的需求十分迫切的背景下，抗菌肽在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、食品、國(guó)防等領(lǐng)域顯示出誘人的應(yīng) 用前景。 陽(yáng)離子抗菌肽在生物體內(nèi)含量極微，如果利用生物化學(xué)的方法從生物體內(nèi)提取天 然抗菌肽，得率低，成本高；如果用化學(xué)合成法，目前價(jià)格昂貴，片段較長(zhǎng)更是如此。這些問(wèn) 題限制了對(duì)抗菌肽的研究和實(shí)際應(yīng)用?；蚬こ躺a(chǎn)陽(yáng)離子抗菌肽是一條有效途徑。但由 于陽(yáng)離子抗菌肽基因序列的差異、對(duì)宿主細(xì)胞的毒性和分離純化效率等問(wèn)題，還需要針對(duì) 不同抗菌肽分子研發(fā)相應(yīng)的高效重組表達(dá)技術(shù)，這是當(dāng)前國(guó)內(nèi)外重點(diǎn)研究?jī)?nèi)容之一。
在基因工程生產(chǎn)技術(shù)中，以大腸桿菌為代表的原核表達(dá)系統(tǒng)成本低，一直是首選 的表達(dá)方法。陽(yáng)離子抗菌肽對(duì)于大腸桿菌宿主細(xì)胞有毒害作用，為原核重組表達(dá)帶來(lái)特殊 的難題，若以非融合的方式直接表達(dá)，則表達(dá)產(chǎn)物損傷宿主細(xì)胞，反過(guò)來(lái)影響表達(dá)產(chǎn)量。所 以，一般通過(guò)與陰離子片段融合表達(dá)以抑制表達(dá)過(guò)程中對(duì)宿主細(xì)胞的毒性，但融合表達(dá)后 需要切除融合頭以恢復(fù)活性，才能獲得有活性的重組陽(yáng)離子抗菌肽。目前常用的切除融合 頭的方法，主要有溴化氰化學(xué)切割法以及酶切法兩種。若用溴化氰切割，要求目標(biāo)陽(yáng)離子抗 菌肽本身不含有甲硫氨酸，且溴化氰本身也為有毒物質(zhì)，還可能產(chǎn)生抗菌肽的化學(xué)修飾等 問(wèn)題；酶切法則需要昂貴的特異蛋白酶、切割后留下多余的氨基酸殘基(重組生產(chǎn)的不同 藥物可因此帶有相同的多余氨基酸殘基，重復(fù)交叉使用會(huì)引起免疫反應(yīng)影響藥效)、以及還 存在非特異性切割干擾?？傊瘜W(xué)切割法與酶切法在生產(chǎn)實(shí)際中都存在較大的限制和缺 陷，對(duì)基因工程生產(chǎn)陽(yáng)離子抗菌肽形成了較大的制約。

發(fā)明內(nèi)容
為克服當(dāng)前基因工程生產(chǎn)陽(yáng)離子抗菌肽技術(shù)存在的上述缺陷，本發(fā)明提供一種新 的方法，能夠縮短生產(chǎn)周期，簡(jiǎn)化生產(chǎn)程序，降低生產(chǎn)成本，提高表達(dá)產(chǎn)量，并省去切割融合 頭這一步驟。其特征在于在表達(dá)陽(yáng)離子抗菌肽的同時(shí)，共表達(dá)一個(gè)陰離子配體；陽(yáng)離子抗菌 肽與陰離子配體在同一個(gè)宿主細(xì)胞內(nèi)各自獨(dú)立表達(dá)，陰離子配體與目標(biāo)陽(yáng)離子抗菌肽的關(guān) 系是非融合的，是反式的。使用改進(jìn)后的技術(shù)，陰離子配體可以中和陽(yáng)離子抗菌肽對(duì)宿主細(xì) 胞的毒性，從而提高了表達(dá)產(chǎn)量；且由于陰離子配體和陽(yáng)離子抗菌肽之間沒(méi)有共價(jià)鍵連接，在表達(dá)后的分離純化中，不再需要任何切割處理，直接用陽(yáng)離子交換樹(shù)脂純化即得到純度
較高的抗菌肽，提高了純化效率和得率。 本發(fā)明的技術(shù)方案為 共表達(dá)陰離子配體生產(chǎn)重組陽(yáng)離子抗菌肽的方法，其特征在于在基因工程生產(chǎn)
陽(yáng)離子抗菌肽的過(guò)程中，同時(shí)表達(dá)一個(gè)獨(dú)立的陰離子配體，所述的陰離子配體是一段帶凈
負(fù)電荷的氨基酸序列；也就是將陽(yáng)離子抗菌肽基因與編碼陰離子配體的DNA序列克隆至質(zhì)
粒載體，在大腸桿菌宿主細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)共表達(dá)；表達(dá)得到的陰離子配體可抑制陽(yáng)離子抗菌肽
對(duì)宿主細(xì)胞的毒性；陰離子配體與陽(yáng)離子抗菌肽之間是非融合的，無(wú)共價(jià)鍵連接。 所述的方法，其特征在于陽(yáng)離子抗菌肽是指帶有凈正電荷的具有抗菌活性的多肽。 所述的方法，其特征在于所述的克隆與轉(zhuǎn)化，可以使用一個(gè)共表達(dá)質(zhì)粒載體，將 陽(yáng)離子抗菌肽基因和編碼陰離子配體DNA序列分別插入到該載體的兩個(gè)多克隆位點(diǎn)，轉(zhuǎn)化 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，誘導(dǎo)共表達(dá)；也可以使用兩個(gè)不同的表達(dá)載體，它們分別攜帶不同的 抗生素抗藥性基因，將陽(yáng)離子抗菌肽基因和編碼陰離子配體DNA序列分別克隆到這兩個(gè)載 體，共轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，用同時(shí)含兩種抗生素的培養(yǎng)基篩選和培養(yǎng)細(xì)胞，誘導(dǎo)共表 達(dá)。 所述的方法，其特征在于所述的大腸桿菌及質(zhì)粒載體可以由酵母及其相應(yīng)的質(zhì) 粒載體替代。
技術(shù)方案所依據(jù)的科學(xué)原理 陽(yáng)離子抗菌肽的正電荷對(duì)于其生物學(xué)活性是必需的，它們有助于抗菌肽分子與靶 標(biāo)例如細(xì)菌細(xì)胞膜或核酸分子的結(jié)合。共表達(dá)一個(gè)陰離子配體，可以中和陽(yáng)離子抗菌肽的 正電荷，或削弱陽(yáng)離子抗菌肽堿性氨基酸攜帶質(zhì)子的傾向，以及平衡胞內(nèi)pH值，從而抑制 誘導(dǎo)表達(dá)的陽(yáng)離子抗菌肽對(duì)宿主細(xì)胞的毒性，提高表達(dá)產(chǎn)量。而且由于陽(yáng)離子抗菌肽與陰 離子配體是獨(dú)立表達(dá)的，破碎細(xì)胞后可以直接用陽(yáng)離子交換樹(shù)脂分離純化，省卻了切割這 一步驟。 本發(fā)明的技術(shù)效果 1.提高了產(chǎn)品質(zhì)量共表達(dá)法避免了溴化氰切割過(guò)程中，溶液中尿素或溴化氰對(duì) 堿性氨基酸殘基的修飾例如甲?；揎?，而堿性氨基酸殘基對(duì)于維持抗菌活性很重要。共 表達(dá)法也避免了酶切法所產(chǎn)生的多余氨基酸殘基。
2.縮短了生產(chǎn)周期融合表達(dá)的情況下，使用化學(xué)切割及相關(guān)處理需要1-2天時(shí)
間；酶切法也需要0. 5-1天時(shí)間，這還不包括切割前、后透析處理約2-3天時(shí)間。
3.提高了生產(chǎn)效率化學(xué)切割和酶切都難以達(dá)到對(duì)底物的完全切割，酶切中還可
能有非特異性切割破壞抗菌肽，透析過(guò)程中也有損失，這些因素都降低了得率。共表達(dá)法簡(jiǎn)
化工序，提高效率。與不使用陰離子配體直接表達(dá)方法比較，產(chǎn)量提高在50%以上；與融合
表達(dá)方法比較，減少了工序及下游純化損失，且考慮到融合表達(dá)時(shí)抗菌肽的分子量占整個(gè)
融合蛋白比例較小，實(shí)際得率高于融合表達(dá)方法2-3倍以上。 4.降低成本目前高質(zhì)量的溴化氰價(jià)格并不低廉，且考慮到切割過(guò)程當(dāng)中要求的 附加設(shè)備和安全保護(hù)問(wèn)題，給生產(chǎn)成本添加不小壓力；而用昂貴的特異蛋白酶如腸激酶等 方法，只能在實(shí)驗(yàn)室使用，生產(chǎn)上大規(guī)模使用這種酶切方法成本過(guò)高。
4
5.擴(kuò)大了生產(chǎn)范圍對(duì)于帶有甲硫氨酸的抗菌肽，也可以方便的原核重組表達(dá)。
具體實(shí)施例方式共表達(dá)陰離子配體生產(chǎn)重組陽(yáng)離子抗菌肽的方法 1、基因擴(kuò)增使用PCR技術(shù)擴(kuò)增要表達(dá)的陽(yáng)離子抗菌肽基因；同時(shí)根據(jù)該抗菌肽 的序列特點(diǎn)，以一個(gè)對(duì)應(yīng)的帶凈負(fù)電荷的陰離子肽段作為配體，擴(kuò)增編碼這一陰離子配體 的DNA序列。 2、克隆與轉(zhuǎn)化選擇一個(gè)大腸桿菌的共表達(dá)質(zhì)粒載體；通過(guò)限制性?xún)?nèi)切酶切割和 連接酶連接的重組DNA技術(shù)，將陽(yáng)離子抗菌肽基因插入到該表達(dá)載體的一個(gè)多克隆位點(diǎn)， 將陰離子配體DNA序列插入到該質(zhì)粒載體的另一個(gè)多克隆位點(diǎn)，然后將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒 轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞；也可以使用兩個(gè)不同的表達(dá)質(zhì)粒載體，它們分別攜帶不同的抗 生素抗藥性基因，將抗菌肽基因和陰離子配體基因分別克隆到這兩個(gè)載體，共轉(zhuǎn)化大腸桿 菌感受態(tài)細(xì)胞，用同時(shí)含兩種抗生素的培養(yǎng)基篩選和培養(yǎng)細(xì)胞。 3、誘導(dǎo)表達(dá)振蕩培養(yǎng)基因工程菌至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，然后加入誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)2-20小 時(shí)。培養(yǎng)溫度在15-42攝氏度范圍內(nèi)。溫度越低，誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)。陽(yáng)離子抗菌肽的基因與 編碼陰離子配體DNA受各自的啟動(dòng)子和操作子調(diào)控，具有各自的核糖體結(jié)合位點(diǎn)，受誘導(dǎo) 后獨(dú)立轉(zhuǎn)錄與翻譯。 4、分離純化破碎大腸桿菌細(xì)胞。將破碎液用陽(yáng)離子交換樹(shù)脂吸附，洗脫得到陽(yáng)離
子抗菌肽。
實(shí)施例 生產(chǎn)陽(yáng)離子抗菌肽NKLF-2，其氨基酸序列為VCDKMKILRGVCKKIMRSFLRR
根據(jù)NKLF-2的氨基酸序列，人工合成陽(yáng)離子抗菌肽基因，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，克隆到載 體pACYCDuet-l的一個(gè)多克隆位點(diǎn)；同時(shí)將一個(gè)編碼陰離子配體的DNA序列克隆到該載體 另一個(gè)多克隆位點(diǎn)，帶凈負(fù)電荷陰離子配體的氫基酸序列為MGDDDDKVPMHELEIFEF。轉(zhuǎn)化大 腸桿菌細(xì)胞后，于37攝氏度下在含有氯霉素的液體培養(yǎng)基中搖菌，經(jīng)異丙基-13 -D-硫代半 乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)。與不使用陰離子配體直接表達(dá)方法比較，表達(dá)產(chǎn)量提高100%以 上；與融合表達(dá)方法比較，由于省卻了切割融合頭這一步驟，降低成本50%，縮短周期3天， 實(shí)際最終得率仍大大提高。
權(quán)利要求
共表達(dá)陰離子配體生產(chǎn)重組陽(yáng)離子抗菌肽的方法，其特征在于在基因工程生產(chǎn)陽(yáng)離子抗菌肽的過(guò)程中，同時(shí)表達(dá)一個(gè)獨(dú)立的陰離子配體，所述的陰離子配體是一段帶凈負(fù)電荷的氨基酸序列；也就是將陽(yáng)離子抗菌肽基因與編碼陰離子配體的DNA序列克隆至質(zhì)粒載體，在大腸桿菌宿主細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)共表達(dá)；表達(dá)得到的陰離子配體可抑制陽(yáng)離子抗菌肽對(duì)宿主細(xì)胞的毒性；陰離子配體與陽(yáng)離子抗菌肽之間是非融合的，無(wú)共價(jià)鍵連接。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于陽(yáng)離子抗菌肽是指帶有凈正電荷的具有 抗菌活性的多肽。
3. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于所述的克隆與轉(zhuǎn)化，可以使用一個(gè)共表達(dá) 質(zhì)粒載體，將陽(yáng)離子抗菌肽基因和編碼陰離子配體DNA序列分別插入到該載體的兩個(gè)多克 隆位點(diǎn)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，誘導(dǎo)共表達(dá)；也可以使用兩個(gè)不同的表達(dá)載體，它們分 別攜帶不同的抗生素抗藥性基因，將陽(yáng)離子抗菌肽基因和編碼陰離子配體DNA序列分別克 隆到這兩個(gè)載體，共轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，用同時(shí)含兩種抗生素的培養(yǎng)基篩選和培養(yǎng) 細(xì)胞，誘導(dǎo)共表達(dá)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的方法，其特征在于所述的大腸桿菌及質(zhì)粒載體可以 由酵母及其相應(yīng)的質(zhì)粒載體替代。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種共表達(dá)陰離子配體生產(chǎn)重組陽(yáng)離子抗菌肽的方法，是在表達(dá)陽(yáng)離子抗菌肽的同時(shí)，共表達(dá)一個(gè)獨(dú)立的帶凈負(fù)電荷的陰離子配體，即將陽(yáng)離子抗菌肽基因與編碼陰離子配體的DNA序列克隆至質(zhì)粒載體，在大腸桿菌宿主細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立非融合表達(dá)，通過(guò)陰離子配體來(lái)抑制陽(yáng)離子抗菌肽對(duì)宿主細(xì)胞的毒性，提高表達(dá)產(chǎn)量，而在后續(xù)的分離純化中，避免了切割融合頭這一耗費(fèi)人力、物力、財(cái)力的步驟，提高分離純化的效率與得率。本發(fā)明能夠顯著縮短生產(chǎn)周期至原先的三分之一或二分之一，提高產(chǎn)量，降低成本50％以上。本發(fā)明為陽(yáng)離子抗菌肽的大規(guī)模生產(chǎn)提供一條高效低成本途徑。
文檔編號(hào)C12P21/02GK101696417SQ200910185208
公開(kāi)日2010年4月21日 申請(qǐng)日期2009年11月2日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月2日
發(fā)明者周鵬, 查向東, 王作利 申請(qǐng)人:查向東;