新型抗-Fc-γ受體IIB抗體及其用圖
【專利說明】新型抗-Fc- γ受體I IB抗體及其用途
【背景技術(shù)】
[0001]作為蛋白質(zhì)的免疫球蛋白基因超級家族的成員，F(xiàn)ey RII受體是由兩個細(xì)胞外免 疫球蛋白結(jié)構(gòu)域、一個單跨膜結(jié)構(gòu)域和一個長度變化的胞漿結(jié)構(gòu)域組成的單一多肽鏈 40kDa完整膜結(jié)合的糖蛋白。Fc γ RII受體在多種造血細(xì)胞上表達(dá)，是人血小板和巨核細(xì)胞 上的唯一Fc-受體（Cassel，McKenzie, 1993)。已知人的三種Fc γ RII受體，F(xiàn)c γ RIIA、Fc γ RIIB和FcyRIIC，它們均結(jié)合IgG(例如以1-2X106M4的親和性結(jié)合IgG〇或免疫復(fù)合物（IC， 例如IgG調(diào)理的病原體）dFc γ RIIA和Fc γ RIIB主要由于胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中的差異而互不相同， 所述差異最終導(dǎo)致受體連接后的功能性異質(zhì)反應(yīng)。Fc γ RIIA觸發(fā)導(dǎo)致細(xì)胞的活化(例如吞 噬作用和呼吸爆發(fā)），而Fc γ RIIB起始抑制性信號，從而導(dǎo)致例如Β細(xì)胞活化的抑制。Fc γ RIIC與Fc γ RIIB共享胞外結(jié)構(gòu)域，與Fc γ RIIA共享胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，從而在結(jié)合IgG或1C后傳遞 活化信號。Fc γ RIIB在除T細(xì)胞和NK細(xì)胞以外的所有白細(xì)胞上表達(dá)，是在人B細(xì)胞上表達(dá)的 唯一的抑制性Fc受體。單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞共表達(dá) 活化的Fc γ RIIA，而抑制性Fc γ RIIB受體和Fc γ RIIC在自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)上表達(dá)并構(gòu) 成該類細(xì)胞上的唯一 Fey R。已知Fey RIIB的兩種在生物學(xué)功能不同的同種型。Fey RIIB-1 唯一地在B細(xì)胞上表達(dá)，而發(fā)現(xiàn)在1C結(jié)合后引起內(nèi)吞-/吞噬作用誘導(dǎo)的Fc γ RIIB-2在所有 其他？。丫1?1113表達(dá)細(xì)胞上表達(dá)(附11111161'」&1111，1^￥61:。11，2008)。
[0002] ?〇丫1?118在胞外區(qū)中與？〇丫1?114享有93%的同源性。如上所述^〇丫1?118與卩〇丫 RIIA之間的主要差異存在于胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。Fc γ RIIB包含ΙΤΙΜ(基于免疫受體酪氨酸的抑制 基序），而Fc γ RIIA包含ΙΤΑΜ(基于免疫受體酪氨酸的活化基序）。
[0003] 通過1C結(jié)合的FcyRIIA簇集引起ΙΤΑΜ基序與引發(fā)ΙΤΑΜ基序(共有序列:￥12-171-X 8-Y-X2-L/I，Isakov，1997)中酪氨酸殘基磷酸化的受體相關(guān)激酶的共定位以及隨后與激酶 Syk相互作用，所述激酶Syk通過大量下游信號傳導(dǎo)和基因活化事件來引發(fā)細(xì)胞的活化 (Ghazizadeh等，1994)。結(jié)合活性Fc γ RIIA的免疫球蛋白引起促炎性反應(yīng)，該促炎性反應(yīng)隨 后導(dǎo)致病原體的去除，但在自身抗體的情況下，還可導(dǎo)致健康組織的破壞，從而達(dá)到病理性 自體免疫疾病峰。因此，需要對抗體特異性的嚴(yán)格控制和否定性反饋系統(tǒng)來避免免疫系統(tǒng) 對機(jī)體的異常破壞。所述抑制性Fc γ RIIB受體就是該否定性反饋系統(tǒng)的一部分。
[0004] Fc γ RIIB的特征在于在胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中存在Ι??Μ基序(共有序列:V/I-X-Y-X2-V/L， Isakov，1997)，其在Ig-聚集體或1C結(jié)合和與攜帶ΙΤΑΜ的活化Fc γ受體共連接后被激酶Lyn 磷酸化。經(jīng)磷酸化的ITIM吸引多磷酸肌醇5'-磷酸酶的SH2-結(jié)構(gòu)域(SHIP)，SHIP轉(zhuǎn)而水解磷 酸肌醇信使，所述磷酸肌醇信使由于含ITAM的FeyR-介導(dǎo)的酪氨酸激酶活化而釋放，因而 阻止細(xì)胞內(nèi)Ca 2+的流入。Fc γ RIIB交聯(lián)抑制對Fc γ R連接的活化反應(yīng)，其繼而抑制B細(xì)胞活 化、增殖和抗體分泌。
[0005] Fey RIIB具有兩種抑制活性。如上所述，其一依賴于ΙΤΙΜ基序并在Fey RIIB連接 到攜帶ΙΤΑΜ的受體(例如Fey RIIA)時發(fā)生，導(dǎo)致ΙΤΑΜ觸發(fā)的鈣動員和細(xì)胞增殖的抑制。這 就意味著諸如脫粒作用、吞噬作用、ADCC、細(xì)胞因子釋放和促炎活化的鈣依賴性過程以及Β 細(xì)胞增殖都被Fc γ RIIB阻斷。Fc γ RIIB的第二種抑制活性包括Β細(xì)胞上受體的同型聚集(Fc γ RIIB簇集）。同型聚集將促細(xì)胞凋亡信號遞送到細(xì)胞質(zhì)中，這可被Fc γ RIIB與B細(xì)胞受體 (BCR)的連接所阻斷。多價-抗原結(jié)合后的BCR信號傳導(dǎo)的特征在于簇集的BCR通過Lyn(Src 家族的一種激酶)磷酸化。這種Lyn作用下的磷酸化與BCR和被稱作"脂筏"的富含鞘脂和膽 固醇的膜微結(jié)構(gòu)域的聯(lián)合一起發(fā)生。這些不溶的"脂筏"在免疫突觸的形成中起著重要作 用。已觀察到，BCR與APC(抗原提呈細(xì)胞)上的抗原的相互作用致使在所接合的B細(xì)胞和APC 的界面處形成該免疫突觸。Fey RIIB與BCR的共連接使BCR與脂筏的聯(lián)合去穩(wěn)定，隨后阻斷B 細(xì)胞的免疫突觸的形成。BCR信號傳導(dǎo)的Fc γ RIIB抑制包含受體的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的ITIM中 的酪氨酸殘基被激酶Lyn磷酸化以及隨后的肌醇磷酸酶SHIP的募集(Daeron等.，1995， Ravetch and Bolland,2001)。
[0006] 科學(xué)界接受這樣的觀點：Fey RIIB可被看作外周B細(xì)胞發(fā)育過程中較晚檢查點 (checkpoint)，并且其還直接調(diào)節(jié)漿細(xì)胞存活。因此Fey RIIB被認(rèn)為是用于治療B細(xì)胞障 礙、特別是B細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的重要靶標(biāo)。
[0007] 在小鼠和人中的研究已經(jīng)闡明Fc γ RIIB對B細(xì)胞活性和體液耐受的影響，其中Fc yRIIB表達(dá)的降低或缺少造成了明顯的自身免疫性疾病的發(fā)展或加劇。事實上，F(xiàn)ey RIIB 在諸如原發(fā)免疫性血小板減少癥、全身性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、大皰性天皰瘡、 尋常型天皰瘡和其他天皰瘡形式、B細(xì)胞驅(qū)動的多發(fā)性硬化癥的自身免疫性疾病以及其他 以病原性免疫復(fù)合物發(fā)展為特征的自身免疫性疾病的發(fā)展和過程中起到關(guān)鍵作用。在健康 個體的免疫反應(yīng)期間，已經(jīng)進(jìn)入血液循環(huán)的病原體受到針對病原體生物體的表位的抗體 (免疫球蛋白，Ig)的調(diào)理，并繼而導(dǎo)致所謂的免疫復(fù)合物的形成。這些免疫復(fù)合物隨后會被 免疫系統(tǒng)的特定細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、吞噬細(xì)胞)所吞噬，這導(dǎo)致病原體生物體從 血液循環(huán)中被清除。另外已經(jīng)證明，F(xiàn)c γ RIIB在外周耐受性方面也起著關(guān)鍵作用，因為Fc γ RIIB敲除小鼠發(fā)展自發(fā)的自身免疫性疾病。Fc γ RIIB不足導(dǎo)致對誘發(fā)的自身免疫性疾病的 易感性(Bolland和Ravetch，2000)。
[0008] 與健康人相比，在遭受自身免疫性疾病的患者中，F(xiàn)c γ RIIB在B細(xì)胞上的表達(dá)通常 會減弱或降低。然而例如幼稚Β細(xì)胞顯示出正常的Fc γ RIIB表達(dá)，來自RA患者的記憶Β細(xì)胞 和衆(zhòng)母細(xì)胞則顯示出這一受體的表達(dá)降低(Catal;in，2010) Jiang及同事也能夠表明，在來 自健康捐贈者的漿母細(xì)胞上通過表面耦合的抗-Fc γ RIIB抗體2.4G2的Fc γ RIIB交聯(lián)導(dǎo)致 細(xì)胞凋亡(Xiang等，2007)
[0009] 基于上述的Fey RIIB在自身免疫性疾病中的顯著作用，已經(jīng)開發(fā)了針對該受體的 抗體，以便治療或診斷患者。W0 2009/083009公開了針對Fc γ RIIB兩種同種型的抗體，而TO 2004/016750公開了與內(nèi)源表達(dá)于人細(xì)胞上的Fey RIIB的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合的抗 體，其親和力是與表達(dá)于人細(xì)胞上的Fc γ RIIA結(jié)合的此類抗體的親和力的至少10倍(記住 FcyRIIA和Fey RIIB的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域享有高度同一性hEP 1 709 073公開了對Fey RIIB 具有高度特異性的抗體及其用于診斷和治療自身免疫性疾病、感染病、腫瘤和其他異常病 癥的用途。
[0010] 為了這樣的目的，十分需要使用對該受體具有高特異性和親和性的抗體。特別是 高特異性降低所述抗體交叉反應(yīng)的風(fēng)險，由此降低不利副作用，而高親和性增強(qiáng)其應(yīng)用的 效力和功效。同時也需要這樣的抗體是非阻斷性的，即它們通過其可變區(qū)與Fc受體的結(jié)合 不會干擾免疫復(fù)合物（1C)或聚集的IgG與細(xì)胞的結(jié)合。而且，針對Fey RIIB的抗體的一個非 常有利的優(yōu)勢在于:其影響Fc γ RIIB抑制耦合機(jī)制以控制B細(xì)胞活化。也就是說，已知Fc γ RIIB的細(xì)胞內(nèi)部分包含所謂的Ι??Μ，并且通過攜帶Ι??Μ的受體的信號傳導(dǎo)往往在免疫系統(tǒng) 的調(diào)節(jié)中是抑制性的。如上所述，已知Fc γ RIIB在被IgG分子的Fc部分結(jié)合時具有抑制性調(diào) 節(jié)功能。因此，需要利用Fey RIIB的抑制性調(diào)節(jié)功能，以期對包含在特別是自身免疫性疾病 中的B細(xì)胞進(jìn)行控制。總而言之，盡管現(xiàn)有技術(shù)已經(jīng)公開了若干具有不同特異性和親和性的 抗Fc γ RIIB抗體，但仍然需要改善的抗Fc γ RIIB抗體用于治療、預(yù)防和診斷受試者的自身 免疫性疾病。
[0011]通過提供本文下文描述的、在權(quán)利要求中進(jìn)行表征且通過隨附的實施例和附圖進(jìn) 行說明的抗體，本申請滿足了這一需求。
[0012] 使本發(fā)明的發(fā)明人十分驚訝的是，他們觀察到本發(fā)明所提供的抗體顯著地增強(qiáng)了 ΙΤΙΜ的磷酸化。與現(xiàn)有技術(shù)中公開的也與Fc γ RIIB特異性結(jié)合的抗體相比，根據(jù)本發(fā)明所 述的抗體驚人地表現(xiàn)出意料之外的更強(qiáng)的對ΙΤΙΜ磷酸化的作用。這樣更強(qiáng)的作用是有益 的。尤其是活化-抑制耦合，即陽性信號與抑制環(huán)的配對，控制許多生物過程的量級和持續(xù) 時間。在Β淋巴細(xì)胞中，克隆型Β細(xì)胞受體(BCR)對抗原的識別誘導(dǎo)能夠指導(dǎo)克隆擴(kuò)增、分化、 細(xì)胞因子釋放并最終產(chǎn)生Ig的信號?；罨碳の锏目萁咭约鞍种菩訤c γ受體(Fc γ R) 即Fey RIIb(CD32B)的負(fù)反饋環(huán)的觸發(fā)防止不受控制的活化。后一種機(jī)制在BCR識別免疫復(fù) 合抗原時觸發(fā)，從而導(dǎo)致通過復(fù)合結(jié)合的IgG的Fc結(jié)構(gòu)域的CD32B共存接合，因而防止與被 可溶性IgG識別的那種享有相同特異性的B細(xì)胞克隆的擴(kuò)增。因此，成功的負(fù)調(diào)節(jié)策略應(yīng)形 成用于負(fù)信號傳導(dǎo)環(huán)的分子基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013] 本發(fā)明提供的抗體在CD32B的ΙΤΙΜ磷酸化方面表現(xiàn)出顯著更強(qiáng)的作用，因而預(yù)期 它們對由CD32B的ΙΤΙΜ磷酸化觸發(fā)的負(fù)信號傳導(dǎo)環(huán)具有更強(qiáng)的影響，這繼而控制特別是包 含在自身免疫性疾病中的Β細(xì)胞。
[00?4]特別地，與未經(jīng)所述抗體處理的Daudi細(xì)胞相比，本發(fā)明的抗體優(yōu)選地增強(qiáng)Daudi 細(xì)胞的？〇丫1?118的11']磷酸化。所述增強(qiáng)優(yōu)選為1.5、2、3、4、5、6、7、8、9或10倍。從與〇)328 結(jié)合的現(xiàn)有技術(shù)抗體，既無法預(yù)料也無法預(yù)見本發(fā)明所述的抗體的有利性質(zhì)，更不必說成 功提供它們的合理預(yù)期，特別是本文所表征的CDR或可變重和/或輕鏈。除了本發(fā)明抗體這 一改善的性質(zhì)，本文所述的抗體還對人Fc γ RIIB具有高特異性和/或是非阻斷性的，即它們 通過其可變區(qū)與Fc受體的結(jié)合不會干擾免疫復(fù)合物(1C)或聚集的IgG與細(xì)胞的結(jié)合。
[0015]因此，本發(fā)明提供一種抗-Fc γ RIIB抗體，優(yōu)選為IgG型的抗-Fc γ RIIB抗體，所述 抗體在其重鏈可變區(qū)中包含SEQIDN0s.29、30和31中所示的H-CDRl、H-CDR2和H-CDR3，并 且在其輕鏈可變區(qū)中包含SEQ ID NOs. 32、33和34中所示的L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3。相比 于未經(jīng)所述抗體處理的Daudi細(xì)胞，所述抗體使Daudi細(xì)胞的Fc γ RIIB的ITIM磷酸化增強(qiáng)約 4至10倍。
[0016] 從圖7中明顯可見，現(xiàn)有技術(shù)抗體GB3(見W0 2005/051999)和2B6(見W0 2004/ 016750)不能如本發(fā)明的抗體(諸如8A6,或者作為嵌合的或作為人源化的8A6抗體)那樣增 強(qiáng)Fc γ RIIB的Ι??Μ磷酸化。故而能否增強(qiáng)Fc γ RIIB的Ι??Μ磷酸化似乎取決于CDR，特別是取 決于存在于8A6中而非GB3和/或2B6中的一些關(guān)鍵殘基。因此，僅存在于8A6的⑶Rs中的處于 對應(yīng)于2B6或GB3的CDR內(nèi)各自位置的位置處的氨基酸可以被看作"關(guān)鍵殘基"。
[0017] 對2B6、GB3和8A6中的CDR關(guān)鍵殘基的視覺比較表明，本發(fā)明的抗體在H-CDR1中包 含SEQIDN0.29中所示的氨基酸序列，在H-CDR2中包含SEQIDN0.30中所示的氨基酸序 列，在H-CDR3中包含SEQIDN0.31中所示的氨基酸序列，在L-CDR1中包含SEQIDN0.32中 所示的氨基酸序列，在L-⑶R2中包含SEQ ID NO.33中所示的氨基酸序列，在L-⑶R3中包含 SEQ ID NO.34中所示的氨基酸序列。
[0018] 8A6、GB3和2B6的⑶R的氨基酸序列之間的差異還可以被表示為在使用8A6的⑶R作 為參考序列時在本發(fā)明的抗體的CDR中所允許的同一性程度（以同一性百分比表示）。因此， 本發(fā)明的抗體的H-⑶R1優(yōu)選地表征為與SEQ ID N0.20中所示的H-⑶R1具有60%或更多（諸 如70%、80%或90% )同一性。
[0019] 本發(fā)明的抗體的H-CDR2優(yōu)選地表征為與SEQ ID如.21中所示的!《^2具有36% 或更多(諸如 40%、50%、60%、70%、80% 或 90%)同一性。
[0020] 本發(fā)明的抗體的H-CDR3優(yōu)選地表征為與SEQ ID ^).22中所示的!1-〇)1?具有50% 或更多（諸如60%、70%、80%或90% )同一性。
[0021] 本發(fā)明的抗體的L-CDR1優(yōu)選地表征為與SEQ ID ^).23中所示的1^-〇?1具有64% 或更多（諸如70%、80%或90% )同一性。
[0022] 本發(fā)明的抗體的L-CDR2優(yōu)選地表征為與SEQ ID ^).24中所示的1^-〇?2具有29% 或更多（諸如 30%、40%、50%、60%、70%、80% 或 90%)同一性。
[0023] 本發(fā)明的抗體的L-CDR3優(yōu)選地表征為與SEQ ID ^).25中所示的1^-〇?3具有78% 或更多(諸如80 %或90 % )同一性。
[0024]因此，本發(fā)明提供一種抗-Fey RIIB抗體，所述抗體在其重鏈可變區(qū)中包含與SEQ IDN0.20中所示的H-CDR1序列具有60%或更多同一性的H-CDR1序列，與SEQIDN0.21中所 示的H-CDR2序列具有36%或更多同一性的H-CDR2序列，與SEQ ID勵.22中所示的!1-〇)1?序 列具有50%或更多同一性的H-CDR3序列，與SEQ ID勵.23中所示的1^-〇)1?1序列具有64%或 更多同一性的L-⑶R1序列，與SEQ ID N0.24中所示的L-⑶R2序列具有29%或更多同一性的 L-CDR2序列，和與SEQ ID如.25中所示的1^-〇)1?3序列具有78%或更多同一性的1^-〇)1?3序 列。
[0025] 優(yōu)選地，所述抗體在其重鏈和輕鏈可變區(qū)⑶R中仍然包含如SEQ ID N0s.29、30、31 (Η-CDR)和SEQ ID從^.32、33、34〇^-〇)1〇中所定義的"關(guān)鍵殘基"。
[0026] 優(yōu)選地，相比于未經(jīng)所述抗體處理的Daudi細(xì)胞，所述抗體使Daudi細(xì)胞的Fc γ RIIB的Ι??Μ磷酸化增強(qiáng)約4至10倍。
[0027] 本文所用術(shù)語"同一性百分比"是指在以如可得自www.clustal .org的ClustalW或 X技術(shù)或者等同技術(shù)所示例的最佳序列比對來比較兩個氨基酸序列時，序列內(nèi)相應(yīng)位置處 的相同氨基酸殘基的百分?jǐn)?shù)。例如，在⑶R比對的情況下，SEQ ID NOs . 20-25中所示的每個 CDR(分別來自重鏈和輕鏈可變區(qū)）都分別作為重鏈或輕鏈可變區(qū)的目標(biāo)CDR序列的參考序 列，例如SEQ ID N0.20的H-⑶R1與目標(biāo)H-⑶R1比對。因此，比對兩個序列（參考序列和目標(biāo) 序列），兩個序列之間相同的氨基酸殘基被識別，然后將相同氨基酸的總數(shù)分別除以SEQ ID 勵.20、21、22、23、24或25氨基酸的總數(shù)(氨基酸長度），具體取決于是比對!1-〇)1?1、!1-〇)1?2、 !1-〇?3、1^-〇01?1、1^-〇?2還是1^-〇)1?3。相除的結(jié)果是一個百分比值，即同一性百分比值/程 度。
[0028] SEQ ID NOs.14和20中所示的H-CDR1序列是SEQ ID勵.29中所示的!1-〇)1?1的優(yōu)選 序列種類。
[0029] SEQ ID N0s.l5和21中所示的H-CDR2序列是SEQ ID勵.30中所示的!1-〇)1?2的優(yōu)選 序列種類。
[0030] SEQ ID NOs.16和22中所示的H-CDR3序列是SEQ ID N0.31中所示的H-CDR3的優(yōu)選 序列種類。
[0031] SEQ ID NOs.17和23中所示的L-CDR1序列是SEQ ID勵.32中所示的1^-〇?1的優(yōu)選 序列種類。
[0032] SEQ ID N0s.l8和24中所示的L-CDR2序列是SEQ ID勵.33中所示的1^-〇?1的優(yōu)選 序列種類。
[0033] SEQ ID N0s.l9和25中所示的L-CDR3序列是SEQ ID勵.34中所示的1^-〇?3的優(yōu)選 序列種類。
[0034]因此，本發(fā)明提供一種抗-Fc γ RIIB抗體，優(yōu)選為IgG型的抗-Fc γ RIIB抗體，所述 抗體
[0035] (a)在其重鏈可變區(qū)中包含SEQ ID N0s.l4、15和16中所示的H-CDR1、H-CDR2和Η-CDR3,并且在其輕鏈可變區(qū)中包含SEQ ID N0s.l7、18和19中所示的L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3;或者
[