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      一種新型抗表皮生長因子受體抗體、其制備方法及用圖

      文檔序號:8933232閱讀:767來源:國知局
      一種新型抗表皮生長因子受體抗體、其制備方法及用圖
      【技術(shù)領(lǐng)域】
      [0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域,更具體地,本發(fā)明公開了一種新型全人源表皮生長因子受體EGFR的單克隆抗體、其制備方法及其在制備抗腫瘤藥物中的應用。
      【背景技術(shù)】
      [0002]癌癥是繼心臟病之后的人類第二大主要死亡因素,目前治療這種致命性疾病的新療法已取得了重大進展。正常細胞的增殖是通過各自的配體激活其生長因子受體來控制的,比如生長因子受體酪氨酸激酶。癌細胞也是在生長因子受體的激活下增殖的,但失去了正常增殖的嚴格控制。這種失控可能是由很多因素引起,比如生長因子的過度表達或生長因子受體的過度表達,以及由生長因子調(diào)控的生化途徑的自發(fā)性激活。參與致癌的受體包括表皮生長因子受體(EGFR),來源于血小板的生長因子受體(TOGFR),類胰島素生長因子受體(IGFR),神經(jīng)生長因子受體(NGFR)和成纖維生長因子受體(FGF)等。
      [0003]表皮生長因子受體(B卩EGFR)也稱作c-erbB 1/Herl,其家族成員都是生長因子受體酪氨酸激酶,它們在細胞表面與特異的生長因子或天然配體相互作用,如與EGF或TGFa相互作用,由此活化受體酪氨酸激酶。已發(fā)現(xiàn)的該家族第一個成員是表觀分子量為165KD的糖蛋白。
      [0004]EGFR在調(diào)節(jié)腫瘤細胞的生長、修復和生存、新生血管生成、侵襲和轉(zhuǎn)移中具有重要的作用,同時在相當一部分的人類腫瘤中都有表達。在很多惡性腫瘤中,EGFR的表達往往與較差的預后和較低的生存率相關(guān)。由此可知,如果有藥物能阻斷EGFR的活性,那將會抑制其磷酸化和信號傳導,從而起到多重途徑的抗腫瘤作用,同時也能增加化療和放療的抗腫瘤療效。在一些研究中,EGFR抑制劑與多種化療藥物和放療藥物聯(lián)合作用于一些腫瘤細胞株時,表現(xiàn)出累加和協(xié)同作用。
      [0005]EGFR抑制劑主要包括單克隆抗體、酪氨酸激酶抑制劑、喹唑啉pyralo-/吡咯并_/吡啶并嘧啶、配體-毒素和免疫毒素聯(lián)結(jié)物,以及反義核苷酸和EGFR/配體主導的疫苗等。
      [0006]一些體內(nèi)和體外實驗顯示抗EGFR抗體成功的抑制了表達EGFR的腫瘤細胞株的生長。在實體瘤的治療中,一些抗EGFR單克隆抗體單獨應用或與傳統(tǒng)治療方法合并應用的治療結(jié)果令人鼓舞。
      [0007]以前的技術(shù)中已經(jīng)描述了多種小鼠的抗EGFR單克隆抗體,可與EGFR高特異的結(jié)合,這些抗體大致可分為兩類,一類是可與受體結(jié)合但不抑制EGF結(jié)合的抗體,另一類是可與受體結(jié)合并且還抑制EGF結(jié)合的抗體。但是患者對鼠源抗體產(chǎn)生的免疫應答限制了這些抗體在人類治療和體內(nèi)診斷中的應用。患者會產(chǎn)生HAMA反應(人抗小鼠抗體),從而限制了抗體到達其抗原靶標的能力,使抗體的效能降低。
      [0008]一些研究人員為了減少HAMA反應,研制出了人鼠嵌合的抗體,其中小鼠可變區(qū)(V)與人恒定區(qū)(C)連接。該抗體證明在臨床上好于鼠源抗體,但是嵌合抗體的小鼠V區(qū)中仍然含有使患者產(chǎn)生免疫原性的成分,限制了其應用。
      [0009]目前已有全人源抗體Panitumumab (W09850433)被應用于治療生長因子過度表達的疾病中。Panitumumab (Ε7.6.3, ABX-EGF, AMG954,商品名:Vectibix,中文名:帕尼單抗)為全人源單克隆抗體,其結(jié)構(gòu)為IgG2K,其作用靶點為表皮生長因子受體(EGFR,ErbB-1或HERl,該抗體主要用于治療表皮生長因子受體表達的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌。Panitumumab是利用XenoMouse技術(shù)制備的全人源抗體,不良免疫應答的發(fā)生幾率很低。
      [0010]通過結(jié)合到EGFR的胞外區(qū),單克隆抗體介導了直接的效應機制,導致了封閉配體結(jié)合,受體下調(diào),細胞周期阻滯及誘導凋亡的作用,但也招募了針對癌細胞的免疫調(diào)節(jié)機制,例如ADCC效應及⑶C效應。然而并非所有的抗體都可以介導ADCC效應,IgGl比IgG2有更強的引發(fā)ADCC效應的能力。盡管EGFR是抗癌治療中一個有效的靶點,但針對EGFR的抗體也可以靶向其他正常組織,如:肝臟,皮膚和胃腸道等正常組織,這可能形成劑量限制性的副反應及不同類型的毒副作用的主要原因。
      [0011]帕尼單抗是一種全人的IgG2型單克隆抗體,可以特異性地結(jié)合EGFR,且有較高的親和力。使用帕尼單抗進行治療具有免疫原性低及超敏反應發(fā)生率低的優(yōu)勢。Vogit等的實驗結(jié)果表明了帕尼單抗在EGFR上的結(jié)合位點與西妥昔并非完全一致(Voigt Μ,Funct1nal dissect1n of the epidermal growth factor receptor epitopes targetedby panitumumab and cetuximab.Neoplasia 2012; 14:1023-31),但對西妥昔耐藥的患者對帕尼治療敏感(西妥昔耐藥??第492位絲氨酸突變?yōu)榫彼?,與上述結(jié)論相一致,這解釋了對西妥昔耐藥的患者對帕尼治療敏感的原因(Montagut C,Identificat1n of amutat1n in the extracellular domain of the Epidermal Growth Factor Receptorconferring cetuximab resistance in colorectal cancer.Nat Med 2012; 18:221-3)然而,作為一種全人的IgG2型抗體,它缺乏了巨噬細胞和NK-細胞介導的經(jīng)典的ADCC效應。最近的研究結(jié)果表明,缺乏ADCC效應可能會限制帕尼在體內(nèi)發(fā)揮功能效應。在此之前,帕尼單抗選擇了 IgG2的亞型被認為可以盡量降低潛在的因ADCC效應及CDC效應引起的皮膚毒性(Kasper S,Oncogenic RAS simultaneously protects against ant1-EGFRantibody-dependent cellular cytotoxicity and EGFR signaling blockade.0ncogene2012)。因此,考慮到增強這些效應可能增加的皮膚毒性,尚未有通過改造帕尼單抗增加其ADCC效應的報道。
      [0012]包括帕尼單抗在內(nèi)的抗-EGFR的抗體引起皮膚毒性的主要特征是紅疹,痤瘡,瘙癢及皮膚干燥。盡管由EGFR抑制劑導致的皮膚毒性的機制尚不清楚,越來越多研究都認為在角質(zhì)細胞中的EGFR信號通路對于皮膚炎癥反應的發(fā)生起到了關(guān)鍵的作用。因此,識別腫瘤特異性EGFR表位的抗體有可能消除潛在的相關(guān)副作用。
      [0013]最近的研究顯示了在臨床前研究中使用的新型probody技術(shù)能夠在一定程度上限制EGFR抗體對皮膚的毒副作用。probody技術(shù)(W02010096838)是由美國Cytomx生物公司開發(fā)的一種“抗體前藥”或稱作“基于抗體的前藥”技術(shù)。其通過對傳統(tǒng)抗體的改造使之具有在人的正常組織保持“沉默”,即減少其對正常組織表達的相應靶點的結(jié)合;而在抗體達到腫瘤部位后借助腫瘤微環(huán)境中特異性表達的蛋白酶如:uPA (尿激酶型纖溶酶原激活物)激活而成為和改造前抗體等效的治療用藥物。它在抗腫瘤治療中可以提高抗體的靶向性,減少抗體對正常組織形成的皮膚毒性等副反應,因此是一種有潛力的新型抗體藥物。

      【發(fā)明內(nèi)容】

      [0014]為了解決上述問題,本發(fā)明的研究人員經(jīng)過大量的實驗獲得一種新型全人源表皮生長因子受體EGFR單克隆抗體Pan-P,本發(fā)明所公開的一種新型全人源抗表皮生長因子受體EGFR的單克隆抗體,為IgGl型抗體,具有ADCC效應,并且本發(fā)明所述抗體其抗原結(jié)合部位含有一段具有腫瘤特異性蛋白酶酶切位點的封閉肽,該抗體為酶介導的特異性結(jié)合型抗體,對腫瘤有特異性結(jié)合,可以減少一般性抗-EGFR抗體引起的皮膚毒性,如:紅疹,痤瘡,瘙癢及皮膚干燥等。
      [0015]在本研究中,為了達到增強ADCC效應及靶向選擇性的目的,我們發(fā)展了這種新型的全人源抗EGFR的抗體,稱為Pan-P。我們在體外試驗中驗證了其增強的ADCC效應,在體內(nèi)試驗中證實了其更加有效的抗腫瘤效能。另外,在體外和體內(nèi)試
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