專利名稱：含有非天然氨基酸和多肽的組合物、涉及非天然氨基酸和多肽的方法以及非天然氨基酸 ...的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及非天然氨基酸，含有至少一個非天然氨基酸的多肽，制造這些非天然氨基酸和多肽的方法，以及這些非天然氨基酸和多肽關于診斷、環(huán)境、工業(yè)和治療用途的用途。

背景技術：
在蛋白質中并入非遺傳性編碼氨基酸(即，“非天然氨基酸”)的能力允許引入可提供天然存在的官能團的有價值替代物的化學官能團，諸如賴氨酸的ε-NH2、半胱氨酸的巰基-SH、組氨酸的亞氨基等。據文獻記載，某些化學官能團對20種常見的遺傳性編碼氨基酸中存在的官能團呈惰性，但與可結合于非天然氨基酸上的官能團完全并有效地反應以形成穩(wěn)定鍵聯。
如今可用某些方法來選擇性地引入蛋白質中不存在的化學官能團，其對20種常見的遺傳性編碼氨基酸中所存在的所有官能團都呈化學惰性并且可用于與包含某些官能團的試劑有效并且選擇性地反應以形成穩(wěn)定共價鍵。


發(fā)明內容
本發(fā)明中描述用于制造、純化、表征和使用非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和經修飾的非天然氨基酸多肽的方法、組合物、技術和策略。一方面是衍生非天然氨基酸和/或非天然氨基酸多肽的方法、組合物、技術和策略。在一個實施例中，這些方法、組合物、技術和策略涉及化學衍生，在其它實施例中涉及生物衍生，在其它實施例中涉及物理衍生，在其它實施例中涉及衍生的組合。在其它或另外的實施例中，這些衍生具有區(qū)域選擇性。在其它或另外的實施例中，這些衍生具有區(qū)域專一性。在其它或另外的實施例中，這些衍生在含有非天然氨基酸的試劑與衍生試劑中都為化學計量或接近化學計量的。在其它或另外的實施例中，這些衍生在周圍溫度下快速發(fā)生。在其它或另外的實施例中，這些衍生在水溶液中發(fā)生。在其它或另外的實施例中，這些衍生在介于約4與約10之間的pH值下發(fā)生。在其它或另外的實施例中，這些衍生在含有非天然氨基酸的試劑與衍生試劑中都為化學計量、接近化學計量或類化學計量的。在其它或另外的實施例中提供允許所需基團以化學計量、接近化學計量或類化學計量結合于非天然氨基酸多肽上的方法。在其它或另外的實施例中提供允許所需基團以化學計量、接近化學計量或類化學計量結合于非天然氨基酸多肽上的策略、反應混合物、合成條件。
一方面是基于羰基或經掩蔽羰基(包括含有至少一個酮基和/或至少一個醛基的基團)的反應性而用于肽和蛋白質的化學衍生的非天然氨基酸。其它或另外的方面是基于肼基或經掩蔽肼基的反應性而用于肽和蛋白質的化學衍生的非天然氨基酸。在其它或另外的實施例中，將至少一個前述非天然氨基酸并入多肽中，即，這些實施例是非天然氨基酸多肽。在其它或另外的實施例中，使非天然氨基酸在其側鏈上經官能化以使得其與衍生分子的反應產生含吲哚的鍵聯。在其它或另外的實施例中是可與衍生分子反應產生含吲哚鍵聯的非天然氨基酸多肽的非天然氨基酸多肽。在其它或另外的實施例中，非天然氨基酸是選自具有羰基和/或肼側鏈的氨基酸。在其它或另外的實施例中，非天然氨基酸包含經掩蔽側鏈，包括經掩蔽肼基和/或經掩蔽羰基。
在其它或另外的實施例中，非天然氨基酸包含羰基側鏈，其中羰基是選自酮或醛。在另一個實施例中是含有在用適當官能化試劑處理后能夠形成吲哚的官能團的非天然氨基酸。在一些實施例中是含有吲哚部分的非天然氨基酸。在另一個實施例中是用于治療病癥、病狀或疾病的含有吲哚部分的非天然氨基酸。在另一個或另外的實施例中，非天然氨基酸在結構上類似于天然氨基酸，但含有前述官能團中的一種。在另一個或其它的實施例中，非天然氨基酸類似于苯丙氨酸或酪氨酸(芳香族氨基酸)；而在另一個實施例中，非天然氨基酸類似于丙氨酸和亮氨酸(疏水性氨基酸)。在一個實施例中，非天然氨基酸具有與天然氨基酸的那些性質不同的性質。在一個實施例中，這些不同性質是側鏈的化學反應性；在另一個實施例中，此不同的化學反應性允許非天然氨基酸的側鏈作為多肽的單元經歷反應，即使同一多肽中的天然存在氨基酸單元的側鏈并不經歷前述反應。在另一個實施例中，非天然氨基酸的側鏈具有與天然存在氨基酸的化學性質正交的化學性質。在另一個實施例中，非天然氨基酸的側鏈包含含親電子試劑的部分；在另一個實施例中，非天然氨基酸側鏈上的含親電子試劑的部分可經歷親核攻擊以產生雜環(huán)衍生的蛋白質，包括含氮雜環(huán)衍生的蛋白質(例如，含有吲哚部分)。在這個段落中的任一前述實施例中，非天然氨基酸為獨立分子或并入任何長度的多肽中；如果是后者，那么在一些實施例中，所述多肽進一步合并其它的天然存在氨基酸或非天然氨基酸。
另一方面是基于含吲哚的雜環(huán)鍵聯制備衍生的非天然氨基酸多肽的經肼取代的分子。在另一個實施例中是通過形成含吲哚的雜環(huán)鍵聯而用于衍生含羰基的非天然氨基酸多肽的經肼取代的分子。在其它實施例中，前述含羰基的非天然氨基酸多肽是含酮的非天然氨基酸多肽。在其它或另外的實施例中，含羰基的非天然氨基酸包含側鏈，其中所述羰基是選自酮或醛。在其它或另外的實施例中，經肼取代的分子包含所需官能團。在其它或另外的實施例中，經肼取代的分子是經肼取代的聚乙二醇(PEG)分子。在另一個實施例中，非天然氨基酸的側鏈具有與天然存在氨基酸的化學性質正交的化學性質，此允許非天然氨基酸與經肼取代的分子選擇性地反應。在另一個實施例中，非天然氨基酸的側鏈包含含親電子試劑的部分，其與含肼的分子選擇性地反應；在另一個實施例中，非天然氨基酸側鏈上的含親電子試劑的部分可經歷親核攻擊以產生雜環(huán)衍生的蛋白質，包括含氮雜環(huán)衍生的蛋白質。與這個段落中所述的實施例有關的另一個方面是由衍生分子與非天然氨基酸多肽的反應產生的經修飾的非天然氨基酸多肽。其它實施例包括已經修飾的非天然氨基酸多肽的任何進一步修飾。
另一方面是基于包括含氮雜環(huán)(例如，吲哚或含有吲哚部分的多環(huán)結構)的雜環(huán)鍵聯制備衍生的非天然氨基酸多肽的經羰基取代的分子。在另一個實施例中是通過形成含吲哚的雜環(huán)鍵聯而用于衍生含肼的非天然氨基酸多肽的經羰基取代的分子。在另一個實施例中是可在介于約1與約6之間的pH值范圍內與含肼的非天然氨基酸多肽形成此雜環(huán)的經羰基取代的分子。在另一個實施例中是通過在衍生分子與含肼的非天然氨基酸多肽之間形成含吲哚的雜環(huán)鍵聯而用于衍生含肼的非天然氨基酸多肽的經羰基取代的分子。在另一個實施例中，經羰基取代的分子是經酮取代的分子，在其它方面是經醛取代的分子。在其它實施例中，經羰基取代的分子包含所需官能團。在其它或另外的實施例中，經醛取代的分子是經醛取代的聚乙二醇(PEG)分子。在另一個實施例中，非天然氨基酸的側鏈具有與天然存在氨基酸的化學性質正交的化學性質，此允許非天然氨基酸與經羰基取代的分子選擇性地反應。在另一個實施例中，非天然氨基酸的側鏈包含與含羰基的分子選擇性地反應的部分(例如，肼基)；在另一個實施例中，非天然氨基酸側鏈上的親核部分可經歷親電子攻擊以產生雜環(huán)衍生的蛋白質，包括含氮雜環(huán)衍生的蛋白質。與這個段落中所述的實施例有關的另一個方面是由衍生分子與非天然氨基酸多肽的反應產生的經修飾的非天然氨基酸多肽。其它實施例包括已經修飾的非天然氨基酸多肽的任何進一步修飾。
另一方面是基于含吲哚的雜環(huán)鍵聯而產生衍生的非天然氨基酸多肽的單官能、雙官能和多官能連接子。在一個實施例中是可用于連接含羰基的非天然氨基酸多肽與其它分子的分子連接子(雙官能和多官能)。在另一個實施例中是可用于連接含肼的非天然氨基酸多肽與其它分子的分子連接子(雙官能和多官能)。在另一個實施例中，含羰基的非天然氨基酸多肽包含酮或醛。在利用含肼的非天然氨基酸多肽的一個實施例中，分子連接子在其一個末端處含有羰基；在其它實施例中，羰基是選自醛基或酮基。在其它或另外的實施例中，經肼取代的連接分子是經肼取代的聚乙二醇(PEG)連接分子。在其它或另外的實施例中，經羰基取代的連接分子是經羰基取代的聚乙二醇(PEG)連接分子。在其它實施例中，短語“其它分子”包括(僅舉例來說)蛋白質、其它聚合物和小分子。在其它或另外的實施例中，含肼的分子連接子在所有末端處都包含相同或等效的基團，以使得在與含羰基的非天然氨基酸多肽反應后，所得產物是含羰基的非天然氨基酸多肽的均多聚物(homo-multimerization)。在其它實施例中，均多聚物是均二聚物。在其它或另外的實施例中，含羰基的分子連接子在所有末端處都包含相同或等效的基團，以使得在與含肼的非天然氨基酸多肽反應后，所得產物是含肼的非天然氨基酸多肽的均多聚物。在其它實施例中，均多聚物是均二聚物。在另一個實施例中，非天然氨基酸的側鏈具有與天然存在氨基酸的化學性質正交的化學性質，此允許非天然氨基酸與經肼取代的連接分子選擇性地反應。在另一個實施例中，非天然氨基酸的側鏈具有與天然存在氨基酸的化學性質正交的化學性質，此允許非天然氨基酸與經羰基取代的連接分子選擇性地反應。在另一個實施例中，非天然氨基酸的側鏈包含與含肼的連接分子選擇性地反應的含親電子試劑的部分；在另一個實施例中，非天然氨基酸側鏈上的含親電子試劑的部分可經歷由含肼的連接分子進行的親核攻擊以產生雜環(huán)衍生的蛋白質，包括含氮雜環(huán)衍生的蛋白質。與這個段落中所述的實施例有關的另一個方面是由連接分子與非天然氨基酸多肽的反應產生的經鍵聯(經修飾)的非天然氨基酸多肽。其它實施例包括已經鍵聯(經修飾)的非天然氨基酸多肽的任何進一步修飾。
一方面是通過羰基與肼反應物的反應衍生蛋白質以產生雜環(huán)衍生的蛋白質(包括含氮雜環(huán)衍生的蛋白質)的方法。這一方面包括基于含羰基的反應物與含肼的反應物的縮合來衍生蛋白質以產生雜環(huán)衍生的蛋白質加合物(包括含氮雜環(huán)衍生的蛋白質加合物)的方法。在另外或其它的實施例中是用肼官能化聚乙二醇(PEG)分子衍生含酮蛋白質或含醛蛋白質的方法。在另外或其它方面，經肼取代的分子可包括蛋白質、其它聚合物和小分子。
另一方面是化學合成用于衍生經羰基取代的蛋白質的經肼取代的分子的方法。在一個實施例中，經肼取代的分子可包含肽、其它聚合物(非支化和支化)和小分子。在一個實施例中是制備適于衍生含羰基的非天然氨基酸多肽(僅舉例來說，包括含酮或含醛的非天然氨基酸多肽)的經肼取代的分子的方法。在另一個或另外的實施例中，非天然氨基酸是在蛋白質的活體內翻譯期間位點特異性地并入。在另一個或另外的實施例中，經肼取代的分子允許通過各羰基的親核攻擊以位點特異性方式進行含羰基的非天然氨基酸的位點特異性衍生以形成雜環(huán)衍生的多肽(包括含氮雜環(huán)衍生的多肽)。在另一個或另外的實施例中，制備經肼取代的分子的方法提供獲得多種位點特異性衍生多肽的可能。在另一個或另外的實施例中是合成肼官能化聚乙二醇(PEG)分子的方法。
另一方面是化學合成用于衍生經肼取代的非天然氨基酸多肽的經羰基取代的分子的方法。在一個實施例中，經羰基取代的分子是經酮和/或經醛取代的分子。在另一個實施例中，經羰基取代的分子包括蛋白質、聚合物(非支化和支化)和小分子。在另一個或另外的實施例中，這些方法補充使得能夠在蛋白質的活體內翻譯期間位點特異性并入非天然氨基酸的技術。在另一個或另外的實施例中是制備適于與含肼的非天然氨基酸多肽反應以提供位點特異性衍生的非天然氨基酸多肽的經羰基取代的分子的一般方法。在另一個或另外的實施例中是合成經羰基取代的聚乙二醇(PEG)分子的方法。
另一方面是使用含肼的雙官能連接子化學衍生經羰基取代的非天然氨基酸多肽的方法。在一個實施例中是通過縮合反應產生雜環(huán)(包括含氮雜環(huán))鍵聯，從而連接經肼取代的連接子與經羰基取代的蛋白質的方法。在其它或另外的實施例中，經羰基取代的非天然氨基酸是經酮和/或經醛取代的非天然氨基酸。在其它或另外的實施例中，非天然氨基酸多肽是使用含肼的雙官能連接子位點特異性地和/或在三維結構的精確控制下衍生。在一個實施例中，使用這些方法來連接分子連接子(單官能、雙官能和多官能)與含羰基(例如包括含酮和/或含醛)的非天然氨基酸多肽，其中連接子的至少一個末端含有肼基，其可通過雜環(huán)(包括含氮雜環(huán))鍵聯與含羰基的非天然氨基酸多肽鍵聯。在另一個或另外的實施例中，使用這些連接子來連接含羰基的非天然氨基酸多肽與其它分子(例如包括蛋白質、其它聚合物(支化和非支化)和小分子)。
在一些實施例中，非天然氨基酸多肽是與水溶性聚合物鍵聯。在一些實施例中，水溶性聚合物包含聚乙二醇部分。在一些實施例中，聚乙二醇分子是雙官能聚合物。在一些實施例中，雙官能聚合物是與第二多肽鍵聯。在一些實施例中，第二多肽與第一多肽相同，在其它實施例中，第二多肽是不同的多肽。在一些實施例中，非天然氨基酸多肽包含至少兩個與包含聚乙二醇部分的水溶性聚合物鍵聯的氨基酸。
在一些實施例中，非天然氨基酸多肽包含增加非天然氨基酸多肽對受體的親和力的取代、添加或缺失。在一些實施例中，非天然氨基酸多肽包含增加非天然氨基酸多肽的穩(wěn)定性的取代、添加或缺失。在一些實施例中，非天然氨基酸多肽包含增加非天然氨基酸多肽的水溶性的取代、添加或缺失。在一些實施例中，非天然氨基酸多肽包含增加宿主細胞中所產生的非天然氨基酸多肽的溶解性的取代、添加或缺失。在一些實施例中，相對于不具有取代、添加或缺失的氨基酸多肽，非天然氨基酸多肽包含調節(jié)蛋白酶抗性、血清半衰期、免疫原性和/或表達的取代、添加或缺失。
在一些實施例中，非天然氨基酸多肽是激動劑、部分激動劑、拮抗劑、部分拮抗劑或反向激動劑。在一些實施例中，激動劑、部分激動劑、拮抗劑、部分拮抗劑或反向激動劑包含與水溶性聚合物鍵聯的非天然氨基酸。在一些實施例中，水溶性聚合物包含聚乙二醇部分。在一些實施例中，包含與水溶性聚合物鍵聯的非天然氨基酸的多肽防止相應受體的二聚化。在一些實施例中，包含與水溶性聚合物鍵聯的非天然氨基酸的多肽調節(jié)多肽與結合搭配物、配體或受體的結合。在一些實施例中，包含與水溶性聚合物鍵聯的非天然氨基酸的多肽調節(jié)多肽的一種或一種以上的性質或活性。
在一些實施例中，選擇密碼子是選自由琥珀密碼子(amber codon)、赭石密碼子(ochre codon)、蛋白石密碼子(opal codon)、獨特密碼子(unique codon)、稀有密碼子(rare codon)、非天然密碼子(unnatural codon)、五堿基密碼子(five-basecodon)和四堿基密碼子(four-base codon)組成的群組。
本發(fā)明中也描述制備與水溶性聚合物鍵聯的非天然氨基酸多肽的方法。在一些實施例中，所述方法包含使包含非天然氨基酸的經分離多肽與包含與非天然氨基酸反應的部分的水溶性聚合物接觸。在一些實施例中，所并入的非天然氨基酸對與20種常見氨基酸中的任一種都不具有反應性的水溶性聚合物具有反應性。在一些實施例中，水溶性聚合物包含聚乙二醇部分。聚合物的分子量視情況在所需聚合物的分子量范圍內。
本發(fā)明中也描述包含包括至少一個本發(fā)明中所述的非天然氨基酸的多肽和醫(yī)藥學上可接受的載劑的組合物。在一些實施例中，非天然氨基酸是與水溶性聚合物鍵聯。本發(fā)明中也描述包含醫(yī)藥學上可接受的載劑和多肽的醫(yī)藥組合物，其中至少一個氨基酸經非天然氨基酸取代。在一些實施例中，非天然氨基酸包含糖部分。在一些實施例中，水溶性聚合物是通過糖部分與多肽鍵聯。本發(fā)明中也描述非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和經修飾的非天然氨基酸多肽的前藥；本發(fā)明中進一步描述包含這些前藥和醫(yī)藥學上可接受的載劑的組合物。本發(fā)明中也描述非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和經修飾的非天然氨基酸多肽的代謝物；在一些實施例中，這些代謝物具有補充或協同加強非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和經修飾的非天然氨基酸多肽的活性的所需活性。本發(fā)明中也描述本發(fā)明中所述的非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和經修飾的非天然氨基酸多肽向生物體(包括需要所需代謝物的患者)提供所需代謝物的用途。
本發(fā)明中也描述包含編碼包含選擇密碼子的多肽的多核苷酸的細胞。在一些實施例中，細胞包含用于將非天然氨基酸代入多肽中的正交RNA合成酶和/或正交tRNA。在一些實施例中，細胞是在細胞培養(yǎng)物中，而在其它實施例中是多細胞生物(包括兩棲動物、爬行動物、鳥類和哺乳動物)的部分的細胞。在任一個細胞實施例中，其它實施例包括產生非天然氨基酸多肽的多核苷酸的表達。在其它實施例中是可利用本發(fā)明中所述的非天然氨基酸產生非天然氨基酸多肽(包括經修飾的非天然氨基酸多肽)的生物體。在其它實施例中是含有本發(fā)明中所述的非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和/或經修飾的非天然氨基酸多肽的生物體。這些生物體包括單細胞生物和多細胞生物，其包括兩棲動物、爬行動物、鳥類和哺乳動物。在一些實施例中，非天然氨基酸多肽是在活體外產生。在一些實施例中，非天然氨基酸多肽是在細胞溶解產物中產生。在一些實施例中，非天然氨基酸多肽是通過核糖體翻譯產生。
本發(fā)明中也描述制備包含非天然氨基酸的多肽的方法。在一些實施例中，所述方法包含在允許多肽表達的條件下培養(yǎng)包含一種或一種以上編碼多肽、正交RNA合成酶和/或正交tRNA的多核苷酸的細胞；以及從細胞和/或培養(yǎng)基中純化多肽。
本發(fā)明中也描述本發(fā)明中所述的非天然氨基酸的庫或本發(fā)明中所述的非天然氨基酸多肽的庫，或本發(fā)明中所述的經修飾的非天然氨基酸多肽的庫，或其組合庫。本發(fā)明中也描述含有至少一個非天然氨基酸、至少一個非天然氨基酸多肽和/或至少一個經修飾的非天然氨基酸的陣列。本發(fā)明中也描述含有至少一個編碼包含選擇密碼子的多肽的多核苷酸的陣列。例如，使用本發(fā)明中所述的陣列來篩檢生物體中非天然氨基酸多肽的產生(通過檢測編碼多肽的多核苷酸的轉錄或通過檢測多肽的翻譯)。
本發(fā)明中也描述篩檢本發(fā)明中所述的庫的所需活性的方法，或使用本發(fā)明中所述的陣列來篩檢本發(fā)明中所述的庫或其它化合物和/或多肽和/或多核苷酸的庫的所需活性的方法。本發(fā)明中也描述來自庫篩檢的此活性數據用于開發(fā)和發(fā)現新的治療劑的用途，以及治療劑本身。
本發(fā)明中也描述增加多肽的治療半衰期、血清半衰期或循環(huán)時間的方法。在一些實施例中，所述方法包含用至少一個非天然氨基酸取代天然存在多肽中的任一個或一個以上氨基酸和/或使多肽與水溶性聚合物偶合。
本發(fā)明中也描述用有效量的醫(yī)藥組合物治療需要此治療的患者的方法，所述醫(yī)藥組合物包含包括非天然氨基酸的多肽和醫(yī)藥學上可接受的載劑。在一些實施例中，非天然氨基酸與水溶性聚合物偶合。
在其它或替代實施例中是治療病癥、病狀或疾病的方法，所述方法包含投與治療有效量的包含至少一個非天然氨基酸的非天然氨基酸多肽，所述非天然氨基酸是選自由含吲哚的非天然氨基酸、含羰基的非天然氨基酸和含肼的非天然氨基酸組成的群組。在其它實施例中，這些非天然氨基酸已通過合成并入如本發(fā)明中所述的多肽中。在其它或替代實施例中，這種非天然氨基酸多肽包含至少一個選自式I-XV的氨基酸的非天然氨基酸。在另一個實施例中，這種非天然氨基酸多肽包含至少一個選自化合物1-4的氨基酸的天然氨基酸。
在其它或替代實施例中是治療病癥、病狀或疾病的方法，所述方法包含投與治療有效量的非天然氨基酸多肽，所述非天然氨基酸多肽包含至少一個具有以下化合物結構的非天然氨基酸
其中 A是可選的，并且當存在時為低碳亞烷基、經取代低碳亞烷基、低碳亞環(huán)烷基、經取代低碳亞環(huán)烷基、低碳亞烯基、經取代低碳亞烯基、亞炔基、經取代亞炔基、低碳亞雜烷基、經取代亞雜烷基、低碳亞雜環(huán)烷基、經取代低碳亞雜環(huán)烷基、亞芳基、經取代亞芳基、亞雜芳基、經取代亞雜芳基、亞烷芳基、經取代亞烷芳基、亞芳烷基或經取代亞芳烷基； B是可選的，并且當存在時為一端與含吲哚的部分鍵聯的連接子，所述連接子選自由以下各基團組成的群組低碳亞烷基、經取代低碳亞烷基、低碳亞烯基、經取代低碳亞烯基、低碳亞雜烷基、經取代低碳亞雜烷基、-亞芳基、經取代亞芳基、亞雜芳基、經取代亞雜芳基、-O-、-O-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-S-、-S-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-S(O)k-(其中k為1、2或3)、-S(O)k(亞烷基或經取代亞烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、-C(O)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-N(R′)CO-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)C(NCN)N(R′)-、-N(R′)C(NNO2)N(R′)-、-N(R′)C(NCOOR′)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)2-N＝N-和-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，并且R′各自獨立地為H、烷基或經取代烷基； R1為H、氨基保護基、樹脂、至少一個氨基酸、多肽或多核苷酸；并且 R2為OH、酯保護基、樹脂、至少一個氨基酸、多肽或多核苷酸； n為0、1、2或3，并且m為0、1、2或3，條件是n或m中的至少一個不為0； 其中，具有相締合Ra基團的結構1、2、3和4中的各環(huán)可含有0、1或2個Ra基團，并且Ra是各自獨立地選自由H、鹵素、烷基、經取代烷基、-N(R″)2、-C(O)R″、-C(O)N(R″)2、-OR″和-S(O)kR″(其中k為1、2或3)組成的群組，其中各R″獨立地為H、烷基或經取代烷基；或當存在一個以上Ra基團時，兩個Ra視情況形成芳基、環(huán)烷基或雜環(huán)烷基； R3與R4各自獨立地為H、鹵素、低碳烷基或經取代低碳烷基，或R3與R4或兩個R3基團視情況形成環(huán)烷基或雜環(huán)烷基； R5各自獨立地為H、鹵素、烷基、經取代烷基、烯基、經取代烯基、炔基、經取代炔基、烷氧基、經取代烷氧基、烷基烷氧基、經取代烷基烷氧基、聚氧化烯、經取代聚氧化烯、芳基、經取代芳基、雜芳基、經取代雜芳基、烷芳基、經取代烷芳基、芳烷基、經取代芳烷基、-(亞烷基或經取代亞烷基)-ON(R″)2、OH、NH2、CN、NO2、-(亞烷基或經取代亞烷基)-C(O)SR″、-(亞烷基或經取代亞烷基)-S-S-(芳基或經取代芳基)、-C(O)R″、-C(O)2R″或-C(O)N(R″)2，其中R″各自獨立地為氫、烷基、經取代烷基、烯基、經取代烯基、烷氧基、經取代烷氧基、芳基、經取代芳基、雜芳基、烷芳基、經取代烷芳基、芳烷基、經取代芳烷基，或當存在一個以上R″基團時，兩個R″視情況形成雜環(huán)烷基； 或R5為L-X，其中，X是選自由以下各物組成的群組標記；染料；聚合物；水溶性聚合物；聚乙二醇的衍生物；光交聯劑；細胞毒性化合物；藥物；親和性標記；光親和性標記；反應性化合物；樹脂；第二蛋白質或多肽或多肽類似物；抗體或抗體片段；金屬螯合劑；輔因子；脂肪酸；碳水化合物；多核苷酸；DNA；RNA；反義多核苷酸；糖類、水溶性樹枝狀聚合物、環(huán)糊精、生物材料；納米粒子；自旋標記；熒光團、含金屬的部分；放射性部分；新穎官能團；與其它分子共價或非共價相互作用的基團；光籠化部分；光化輻射可激發(fā)的部分；配體；可光致異構化部分；生物素；生物素類似物；結合有重原子的部分；可化學裂解的基團；可光裂解的基團；延長的側鏈；碳鍵聯的糖；氧化還原活性劑；氨基硫代酸；毒性部分；經同位素標記的部分；生物物理探針；磷光基團；化學發(fā)光基團；電子致密基團；磁性基團；插入基團；發(fā)色團；能量轉移劑；生物活性劑；可檢測標記；小分子；抑制性核糖核酸；放射性核苷酸；中子俘獲劑；生物素的衍生物；量子點；納米傳遞素；放射性傳遞素；抗體酶、活化復合激活劑、病毒、佐劑、糖苷配基、過敏原、血管抑素、抗激素、抗氧化劑、適體、向導RNA、皂角苷、穿梭載體(shuttle vector)、大分子、擬抗原決定基(mimotope)、受體、反膠束(reverse micelle)和其任何組合；并且L是可選的，并且當存在時為選自由以下各基團組成的群組的連接子亞烷基、經取代亞烷基、亞烯基、經取代亞烯基、-O-、-O-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-S-、-S-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-S(O)k-(其中k為1、2或3)、-S(O)k(亞烷基或經取代亞烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-N(R′)CO-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-N(R′)C(O)O-、-(亞烷基或經取代亞烷基)-O-N＝CR′-、-(亞烷基或經取代亞烷基)-C(O)NR′-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-(亞烷基或經取代亞烷基)-S(O)k-(亞烷基或經取代亞烷基)-S-、-(亞烷基或經取代亞烷基)-S-S-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、-N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-和-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自獨立地為H、烷基或經取代烷基； 當存在一個以上R5基團時，兩個鄰位R5基團可視情況形成雜環(huán)烷基或芳香族雜環(huán)烷基； 或含-B-吲哚的部分合起來形成包含至少一個吲哚部分的雙環(huán)或三環(huán)環(huán)烷基或雜環(huán)烷基； 或其活性代謝物、鹽或醫(yī)藥學上可接受的前藥或溶劑化物。
在一個實施例中，X是選自水溶性聚合物；聚氧化烯；聚乙二醇；聚乙二醇的衍生物；光交聯劑；至少一個氨基酸；至少一個糖基；至少一個核苷酸；至少一個核苷；配體；生物素；生物素類似物；可檢測標記；和其任何組合。
在一個實施例中，A與B都是鍵，各R3為H并且R4為H。在另一個實施例中，R1與R2各自為至少一個氨基酸。在另一個實施例中，R1與R2各自為至少兩個氨基酸。在另一個實施例中，R1與R2各自為至少三個氨基酸。在另一個實施例中，R1與R2各自為至少四個氨基酸。在另一個實施例中，R1與R2各自為至少五個氨基酸。在另一個實施例中，R1與R2各自為至少六個氨基酸。
在另一個實施例中是治療病癥、病狀或疾病的方法，所述方法包含投與治療有效量的非天然氨基酸多肽與醫(yī)藥學上可接受的載劑。在另一個實施例中是治療病癥、病狀或疾病的方法，其中X是水溶性聚合物。在另一個實施例中是治療病癥、病狀或疾病的方法，其中X是聚乙二醇的衍生物。在另一個實施例中是治療病癥、病狀或疾病的方法，其中X是細胞毒性化合物。在另一個實施例中是治療病癥、病狀或疾病的方法，其中X是藥物。
在一些實施例中是治療病癥、病狀或疾病的方法，其中X是第二多肽。在另一個實施例中是治療病癥、病狀或疾病的方法，其中第二多肽是含有非天然氨基酸多肽的肽。在另一個實施例中是治療病癥、病狀或疾病的方法，其中第二多肽具有與具有結構1-4的化合物的非天然氨基酸多肽相同的氨基酸結構。在另一個實施例中是治療病癥、病狀或疾病的方法，其中X是可檢測標記。在另一個實施例中是治療病癥、病狀或疾病的方法，其中在多肽內的特定位點處并入化合物1-4的至少一個非天然氨基酸。在另一個實施例中是治療病癥、病狀或疾病的方法，其中使用翻譯系統并入化合物1-4的非天然氨基酸。
在另一個實施例中是治療病癥、病狀或疾病的方法，其包含投與治療有效量的包含至少一個非天然氨基酸的多肽，所述非天然氨基酸選自由以下各物組成的群組
其中 A是可選的，并且當存在時為低碳亞烷基、經取代低碳亞烷基、低碳亞環(huán)烷基、經取代低碳亞環(huán)烷基、低碳亞烯基、經取代低碳亞烯基、亞炔基、經取代亞炔基、低碳亞雜烷基、經取代亞雜烷基、低碳亞雜環(huán)烷基、經取代低碳亞雜環(huán)烷基、亞芳基、經取代亞芳基、亞雜芳基、經取代亞雜芳基、亞烷芳基、經取代亞烷芳基、亞芳烷基或經取代亞芳烷基； B是可選的，并且當存在時為一端與含吲哚的部分鍵聯的連接子，所述連接子選自由以下各基團組成的群組低碳亞烷基、經取代低碳亞烷基、低碳亞烯基、經取代低碳亞烯基、低碳亞雜烷基、經取代低碳亞雜烷基、-亞芳基、經取代亞芳基、亞雜芳基、經取代亞雜芳基、-O-、-O-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-S-、-S-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-S(O)k-(其中k為1、2或3)、-S(O)k(亞烷基或經取代亞烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、-C(O)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-N(R′)CO-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)C(NCN)N(R′)-、-N(R′)C(NNO2)N(R′)-、-N(R′)C(NCOOR′)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)2-N＝N-和-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，并且R′各自獨立地為H、烷基或經取代烷基； R1為H、氨基保護基、樹脂、至少一個氨基酸、多肽或多核苷酸；并且 R2為OH、酯保護基、樹脂、至少一個氨基酸、多肽或多核苷酸； n為0、1、2或3，并且m為0、1、2或3，條件是n或m中的至少一個不為0； 其中，具有相締合Ra基團的結構1、2、3和4中的各環(huán)可含有0、1或2個Ra基團，并且Ra是各自獨立地選自由H、鹵素、烷基、經取代烷基、-N(R″)2、-C(O)R″、-C(O)N(R″)2、-OR″和-S(O)kR″(其中k為1、2或3)組成的群組，其中各R″獨立地為H、烷基或經取代烷基；或當存在一個以上Ra基團時，兩個Ra視情況形成芳基、環(huán)烷基或雜環(huán)烷基； R3與R4各自獨立地為H、鹵素、低碳烷基或經取代低碳烷基，或R3與R4或兩個R3基團視情況形成環(huán)烷基或雜環(huán)烷基； R5各自獨立地為H、鹵素、烷基、經取代烷基、烯基、經取代烯基、炔基、經取代炔基、烷氧基、經取代烷氧基、烷基烷氧基、經取代烷基烷氧基、聚氧化烯、經取代聚氧化烯、芳基、經取代芳基、雜芳基、經取代雜芳基、烷芳基、經取代烷芳基、芳烷基、經取代芳烷基、-(亞烷基或經取代亞烷基)-ON(R″)2、OH、NH2、CN、NO2、-(亞烷基或經取代亞烷基)-C(O)SR″、-(亞烷基或經取代亞烷基)-S-S-(芳基或經取代芳基)、-C(O)R″、-C(O)2R″或-C(O)N(R″)2，其中R″各自獨立地為氫、烷基、經取代烷基、烯基、經取代烯基、烷氧基、經取代烷氧基、芳基、經取代芳基、雜芳基、烷芳基、經取代烷芳基、芳烷基、經取代芳烷基，或當存在一個以上R″基團時，兩個R″視情況形成雜環(huán)烷基； 或R5為L-X，其中，X是選自由以下各物組成的群組標記；染料；聚合物；水溶性聚合物；聚乙二醇的衍生物；光交聯劑；細胞毒性化合物；藥物；親和性標記；光親和性標記；反應性化合物；樹脂；第二蛋白質或多肽或多肽類似物；抗體或抗體片段；金屬螯合劑；輔因子；脂肪酸；碳水化合物；多核苷酸；DNA；RNA；反義多核苷酸；糖類、水溶性樹枝狀聚合物、環(huán)糊精、生物材料；納米粒子；自旋標記；熒光團、含金屬的部分；放射性部分；新穎官能團；與其它分子共價或非共價相互作用的基團；光籠化部分；光化輻射可激發(fā)的部分；配體；可光致異構化部分；生物素；生物素類似物；結合有重原子的部分；可化學裂解的基團；可光裂解的基團；延長的側鏈；碳鍵聯的糖；氧化還原活性劑；氨基硫代酸；毒性部分；經同位素標記的部分；生物物理探針；磷光基團；化學發(fā)光基團；電子致密基團；磁性基團；插入基團；發(fā)色團；能量轉移劑；生物活性劑；可檢測標記；小分子；抑制性核糖核酸；放射性核苷酸；中子俘獲劑；生物素的衍生物；量子點；納米傳遞素；放射性傳遞素；抗體酶、活化復合激活劑、病毒、佐劑、糖苷配基、過敏原、血管抑素、抗激素、抗氧化劑、適體、向導RNA、皂角苷、穿梭載體、大分子、擬抗原決定基、受體、反膠束和其任何組合；并且L是可選的，并且當存在時為選自由以下各基團組成的群組的連接子亞烷基、經取代亞烷基、亞烯基、經取代亞烯基、-O-、-O-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-S-、-S-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-S(O)k-(其中k為1、2或3)、-S(O)k(亞烷基或經取代亞烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-N(R′)CO-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-N(R′)C(O)O-、-(亞烷基或經取代亞烷基)-O-N＝CR′-、-(亞烷基或經取代亞烷基)-C(O)NR′-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-(亞烷基或經取代亞烷基)-S(O)k-(亞烷基或經取代亞烷基)-S-、-(亞烷基或經取代亞烷基)-S-S-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、-N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-和-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自獨立地為H、烷基或經取代烷基； 當存在一個以上R5基團時，兩個鄰位R5基團可視情況形成雜環(huán)烷基或芳香族雜環(huán)烷基； 或含-B-吲哚的部分合起來形成包含至少一個吲哚部分的雙環(huán)或三環(huán)環(huán)烷基或雜環(huán)烷基； 或其活性代謝物、鹽或醫(yī)藥學上可接受的前藥或溶劑化物。
在一個實施例中，X是選自水溶性聚合物；聚氧化烯；聚乙二醇；聚乙二醇的衍生物；光交聯劑；至少一個氨基酸；至少一個糖基；至少一個核苷酸；至少一個核苷；配體；生物素；生物素類似物；可檢測標記；和其任何組合。
在一個實施例中，A與B都是鍵，各R3為H并且R4為H。在另一個實施例中，R1與R2各自為至少一個氨基酸。在另一個實施例中，R1與R2各自為至少兩個氨基酸。在另一個實施例中，R1與R2各自為至少三個氨基酸。在另一個實施例中，R1與R2各自為至少四個氨基酸。在另一個實施例中，R1與R2各自為至少五個氨基酸。在另一個實施例中，R1與R2各自為至少六個氨基酸。
在另一個實施例中是治療病癥、病狀或疾病的方法，其進一步包含投與醫(yī)藥學上可接受的載劑與治療有效量的具有結構5-8的化合物的多肽。在另一個實施例中是治療病癥、病狀或疾病的方法，其中R1與R2都是多肽。在另一個實施例中是治療病癥、病狀或疾病的方法，其中X是水溶性聚合物。在另一個實施例中是治療病癥、病狀或疾病的方法，其中X是聚乙二醇的衍生物。在另一個實施例中是治療病癥、病狀或疾病的方法，其中X是細胞毒性化合物。在另一個實施例中是治療病癥、病狀或疾病的方法，其中X是藥物。在另一個實施例中是治療病癥、病狀或疾病的方法，其中X是第二多肽。在另一個實施例中是治療病癥、病狀或疾病的方法，其中第二多肽是含有非天然氨基酸多肽的肽。
在其它或替代實施例中是治療病癥、病狀或疾病的方法，所述方法包含投與治療有效量的包含至少一個具有化合物1-4的結構的非天然氨基酸的非天然氨基酸多肽，其中所述多肽是與選自由以下各物組成的群組的治療蛋白同源的蛋白質α-1抗胰蛋白酶、血管抑素、抗溶血因子、抗體、抗體片段、載脂蛋白(apolipoprotein)、脫輔基蛋白(apoprotein)、心房利鈉因子、心房利鈉多肽、心房肽、C-X-C趨化因子、T39765、NAP-2、ENA-78、gro-a、gro-b、gro-c、IP-10、GCP-2、NAP-4、SDF-1、PF4、MIG、降血鈣素(calcitonin)、c-kit配體、細胞因子、CC趨化因子、單核細胞趨化蛋白-1、單核細胞趨化蛋白-2、單核細胞趨化蛋白-3、單核細胞炎性蛋白-1α、單核細胞炎性蛋白-iβ、RANTES、1309、R83915、R91733、HCC1、T58847、D31065、T64262、CD40、CD40配體、c-kit配體、膠原蛋白、菌落刺激因子(CSF)、補體因子5a、補體抑制劑、補體受體1、細胞因子、上皮中性粒細胞激活肽-78、MIP-16、MCP-1、表皮生長因子(EGF)、上皮中性粒細胞激活肽、紅細胞生成素(EPO)、剝脫性毒素(exfoliating toxin)、因子IX、因子VII、因子VIII、因子X、成纖維細胞生長因子(FGF)、纖維蛋白原、纖維粘連蛋白、四螺旋束蛋白、G-CSF、glp-1、GM-CSF、葡糖腦苷脂酶、促性腺激素、生長因子、生長因子受體、grf、刺猬蛋白(hedgehog protein)、血紅蛋白、肝細胞生長因子(hGF)、水蛭素、人類生長激素(hGH)、人類血清白蛋白、ICAM-1、ICAM-1受體、LFA-1、LFA-1受體、胰島素、類胰島素生長因子(IGF)、IGF-I、IGF-II、干擾素(IFN)、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、白細胞介素(IL)、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、角質細胞生長因子(KGF)、乳鐵蛋白、白血病抑制因子、熒光素酶、神經素(neurturin)、中性粒細胞抑制因子(NIF)、抑瘤素M、成骨蛋白、癌基因產物、paracitonin、甲狀旁腺激素、PD-ECSF、PDGF、肽激素、多效營養(yǎng)因子(pleiotropin)、蛋白質A、蛋白質G、pth、致熱外毒素A、致熱外毒素B、致熱外毒素C、pyy、松弛素、腎素、SCF、小生物合成蛋白、可溶性補體受體I、可溶性I-CAM1、可溶性白細胞介素受體、可溶性TNF受體、生長調節(jié)素、生長抑素、生長激素(somatotropin)、鏈激酶、超抗原、葡萄球菌腸毒素、SEA、SEB、SEC1、SEC2、SEC3、SED、SEE、類固醇激素受體、超氧化物歧化酶、中毒性休克綜合癥毒素、胸腺素α1、組織型纖溶酶原激活劑、腫瘤生長因子(TGF)、腫瘤壞死因子、腫瘤壞死因子α、腫瘤壞死因子β、腫瘤壞死因子受體(TNFR)、尾加壓素(urotensin)、VLA-4蛋白、VCAM-1蛋白、血管內皮生長因子(VEGF)、尿激酶、mos、ras、raf、met、p53、tat、fos、myc、jun、myb、rel、雌激素受體、孕酮受體、睪丸激素受體、醛固酮受體、LDL受體和皮質酮受體。
在另一個實施例中是治療病癥、病狀或疾病的方法，所述方法包含投與具有結構5-8的化合物，其中在多肽內的特定位點處并入至少一個非天然氨基酸。在另一個實施例中是治療病癥、病狀或疾病的方法，所述方法包含投與具有結構5-8的化合物，其中使用翻譯系統并入非天然氨基酸。在另一個實施例中是治療病癥、病狀或疾病的方法，所述方法包含投與具有結構5-8的化合物，其中使用翻譯系統和翻譯后修飾系統將非天然氨基酸并入多肽中。在另一個實施例中是治療病癥、病狀或疾病的方法，所述方法包含投與具有結構5-8的化合物，其中包含至少一個非天然氨基酸的多肽可穩(wěn)定至少一個月。在另一個實施例中是治療病癥、病狀或疾病的方法，所述方法包含投與具有結構5-8的化合物，其中包含至少一個非天然氨基酸的多肽可穩(wěn)定至少兩個月。
在其它或替代實施例中是治療病癥、病狀或疾病的方法，所述方法包含投與治療有效量的包含至少一個含吲哚的非天然氨基酸的非天然氨基酸多肽，并且所得含吲哚的非天然氨基酸多肽相對于同源天然存在氨基酸多肽來說增加多肽的生物可用性。
在其它或替代實施例中是治療病癥、病狀或疾病的方法，所述方法包含投與治療有效量的包含至少一個含吲哚的非天然氨基酸的非天然氨基酸多肽，并且所得含吲哚的非天然氨基酸多肽相對于同源天然存在氨基酸多肽來說增加多肽的安全性概況。
在其它或替代實施例中是治療病癥、病狀或疾病的方法，所述方法包含投與治療有效量的包含至少一個含吲哚的非天然氨基酸的非天然氨基酸多肽，并且所得含吲哚的非天然氨基酸多肽相對于同源天然存在氨基酸多肽來說增加多肽的水溶性。
在其它或替代實施例中是治療病癥、病狀或疾病的方法，所述方法包含投與治療有效量的包含至少一個含吲哚的非天然氨基酸的非天然氨基酸多肽，并且所得含吲哚的非天然氨基酸多肽相對于同源天然存在氨基酸多肽來說增加多肽的治療半衰期。
在其它或替代實施例中是治療病癥、病狀或疾病的方法，所述方法包含投與治療有效量的包含至少一個含吲哚的非天然氨基酸的非天然氨基酸多肽，并且所得含吲哚的非天然氨基酸多肽相對于同源天然存在氨基酸多肽來說增加多肽的血清半衰期。
在其它或替代實施例中是治療病癥、病狀或疾病的方法，所述方法包含投與治療有效量的包含至少一個含吲哚的非天然氨基酸的非天然氨基酸多肽，并且所得含吲哚的非天然氨基酸多肽相對于同源天然存在氨基酸多肽來說延長多肽的循環(huán)時間。
在其它或替代實施例中是治療病癥、病狀或疾病的方法，所述方法包含投與治療有效量的包含至少一個含吲哚的非天然氨基酸的非天然氨基酸多肽，并且所得含吲哚的非天然氨基酸多肽相對于同源天然存在氨基酸多肽來說調節(jié)多肽的生物活性。
在其它或替代實施例中是治療病癥、病狀或疾病的方法，所述方法包含投與治療有效量的包含至少一個含吲哚的非天然氨基酸的非天然氨基酸多肽，并且所得含吲哚的非天然氨基酸多肽相對于同源天然存在氨基酸多肽來說調節(jié)多肽的免疫原性。
應了解，本發(fā)明中所述的方法和組合物并不限于本發(fā)明中所述的特定方法、方案、細胞系、構筑體和試劑，并且同樣視情況改變。也應了解，本發(fā)明中使用的術語只是為了達成描述特定實施例的目的，并且不打算限制本發(fā)明中所述的方法和組合物的范圍，所述范圍應僅由隨附權利要求加以限制。
除非上下文另外明確指出，否則如本發(fā)明中和隨附權利要求中所使用，單數形式“一”和“所述”包括多個指示物。
除非另外定義，否則本發(fā)明中使用的所有科技術語都具有與本發(fā)明中所述的發(fā)明所屬領域的技術人員通常所了解的含義相同的含義。雖然可將與本發(fā)明中所述的方法、裝置和材料類似或等效的任何方法、裝置和材料用于本發(fā)明的實踐或測試中，但現僅對優(yōu)選方法、裝置和材料加以描述。
本發(fā)明中所討論的公開案僅提供本申請案的申請日期之前的揭示內容。本發(fā)明決不應解釋為承認本發(fā)明所述的發(fā)明者無權由于先前發(fā)明或任何其它原因而使所述揭示案的日期提前。
如本發(fā)明中所使用的術語“親和性標記”是指可逆或不可逆地與另一分子結合以對其進行修飾、將其破壞或與其形成化合物的標記。舉例來說，親和性標記包括酶和其底物，或抗體和其抗原。
術語“烷氧基”、“烷基氨基”和“烷硫基”(或硫代烷氧基)是指分別通過氧原子、氨基或硫原子鍵聯到分子上的烷基。
除非另外指出，否則術語“烷基”(自身或作為另一分子的部分)表示直鏈或支鏈或環(huán)狀烴基，或其組合，其視情況為完全飽和、單不飽和或多不飽和的并且可包括具有指定碳原子數目(即C1-C10表示1到10個碳)的二價基團和多價基團。飽和烴基的實施例包括(但不限于)以下基團，諸如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、叔丁基、異丁基、仲丁基、環(huán)己基、(環(huán)己基)甲基、環(huán)丙基甲基；(例如)正戊基、正己基、正庚基、正辛基等基團的同系物和異構體。不飽和烷基是具有一個或一個以上雙鍵或三鍵的烷基。不飽和烷基的實施例包括(但不限于)乙烯基、2-丙烯基、巴豆基、2-異戊烯基、2-(丁二烯基)、2，4-戊二烯基、3-(1，4-戊二烯基)、乙炔基、1-丙炔基和3-丙炔基、3-丁炔基以及高級同系物和異構體。除非另外指出，否則術語“烷基”還打算包括本發(fā)明中更詳細定義的烷基的衍生物，諸如“雜烷基”、“鹵烷基”和“同系烷基(homoalkyl)”。
術語“亞烷基”(自身或作為另一分子的部分)表示由烷烴衍生的二價基團，如由(-CH2-)n例示，其中n為1到約24。僅舉例來說，這些基團包括(但不限于)具有10個或更少碳原子的基團，諸如結構-CH2CH2-和-CH2CH2CH2CH2-。“低碳烷基”或“低碳亞烷基”是通常具有8個或更少碳原子的較短鏈烷基或亞烷基。除非另外指出，否則術語“亞烷基”也打算包括本發(fā)明中描述為“亞雜烷基”的那些基團。
術語“氨基酸”是指天然存在氨基酸和非天然氨基酸，以及以類似于天然存在氨基酸的方式起作用的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然編碼氨基酸為20種常見氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸和纈氨酸)以及吡咯賴氨酸(pyrolysine)和硒代半胱氨酸。氨基酸類似物是指具有與天然存在氨基酸相同的基本化學結構(僅舉例來說，與氫、羧基、氨基和R基團結合的α-碳)的化合物。這些類似物視情況具有經修飾的R基團(舉例來說，正亮氨酸)或視情況經修飾的肽主鏈，而仍保留與天然存在氨基酸相同的基本化學結構。氨基酸類似物的非限制性實施例包括高絲氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亞砜、蛋氨酸甲基锍。
氨基酸在本發(fā)明中可由其名稱、其三字母符號或由IUPAC-IUB生物化學命名委員會(IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission)推薦的單字母符號來指代。另外，核苷酸可由其公認的單字母代碼來指代。
“抗體片段”表示除全長形式之外的抗體的任何形式。在本發(fā)明中，抗體片段包括為存在于全長抗體內的較小組分的抗體，以及經工程化的抗體?？贵w片段包括(但不限于)Fv、Fc、Fab以及(Fab′)2、單鏈Fv(scFv)、雙鏈抗體、三鏈抗體、四鏈抗體、雙功能雜交抗體、CDR1、CDR2、CDR3、CDR的組合、可變區(qū)、構架區(qū)、恒定區(qū)、重鏈、輕鏈和可變區(qū)，以及替代性骨架非抗體分子、雙特異性抗體等(Maynard和Georgiou，2000，Annu.Rev.Biomed.Eng.2339-76；Hudson，1998，Curr.Opin.Biotechnol.9395-402)。另一功能性子結構為單鏈Fv(scFv)，其包含由肽連接子共價連接的免疫球蛋白重鏈和輕鏈的可變區(qū)(S-z Hu等人，1996，Cancer Research，56，3055-3061)。這些小(Mr 25,000)蛋白質通常保持對單一多肽中的抗原的特異性和親和性并且可為較大的抗原特異性分子提供適宜構建單元。除非另外特定指出，否則使用術語“抗體”的陳述和權利要求明確包括“抗體片段”。
如本發(fā)明中所使用，術語“芳香族”或“芳基”是指具有至少一個具有共軛π電子系統的環(huán)的閉環(huán)結構，并包括碳環(huán)芳基與雜環(huán)芳基(或“雜芳基”或“雜芳香族基團”)。碳環(huán)或雜環(huán)芳香族基團視情況含有5到20個環(huán)原子。所述術語包括共價鍵聯的單環(huán)或稠環(huán)多環(huán)(即，共用相鄰碳原子對的環(huán))基團。芳香族基團可能未經取代或經取代。“芳香族基團”或“芳基”的非限制性實施例包括苯基、1-萘基、2-萘基、4-聯苯基、蒽基和菲基。上述芳基和雜芳基環(huán)系統中的每一個的取代基是選自本發(fā)明中描述的可接受的取代基的群組。
為了簡便起見，當與其它術語組合使用(包括(但不限于)芳氧基、芳基硫氧基、芳烷基)時，術語“芳香族”或“芳基”包括如上文所定義的芳基環(huán)與雜芳基環(huán)兩者。因此，術語“芳烷基”或“烷芳基”打算包括其中芳基連接至烷基上的那些基團(包括(但不限于)芐基、苯乙基、吡啶基甲基等)，其中所述烷基包括碳原子(包括(但不限于)亞甲基)已經雜原子(僅舉例來說，氧原子)置換的那些烷基。這些芳基的實施例包括(但不限于)苯氧基甲基、2-吡啶基氧基甲基、3-(1-萘基氧基)丙基等。
如本發(fā)明中所使用，術語“亞芳基”是指二價芳基。“亞芳基”的非限制性實施例包括亞苯基、亞吡啶基、亞嘧啶基和亞噻吩基。亞芳基的取代基是選自本發(fā)明中描述的可接受的取代基的群組。
術語“至少一個氨基酸”是指單一氨基酸、多重氨基酸、寡肽、氨基酸二聚物、氨基酸三聚物、氨基酸四聚物、多肽、蛋白質、抗體或氨基酸的任何其它連接鏈。
“雙官能聚合物”(也稱作“雙官能連接子”)是指包含兩個能夠與其它部分特異性反應以形成共價鍵或非共價鍵的官能團的聚合物。這些部分包括(但不限于)天然氨基酸或非天然氨基酸或含有這些天然氨基酸或非天然氨基酸的肽上的側基。僅舉例來說，雙官能連接子具有與第一肽上的基團具有反應性的官能團，以及與第二肽上的基團具有反應性的另一官能團，借此形成包括第一肽、雙官能連接子和第二肽的接合物。用于將多種化合物與肽連接的程序和連接分子包括(例如)歐洲專利申請案第188,256號；美國專利第4,671,958號、第4,659,839號、第4,414,148號、第4,699,784號；第4,680,338號；和第4,569,789號。“多官能聚合物”也被稱作“多官能連接子”，其是指包含兩個或兩個以上能夠與其它部分反應的官能團的聚合物。這些部分包括(但不限于)天然氨基酸或非天然氨基酸或含有這些天然氨基酸或非天然氨基酸的肽上的側基(包括(但不限于)氨基酸側基)以形成共價鍵或非共價鍵。雙官能聚合物或多官能聚合物視情況具有任何所需長度或分子量，并且視情況經選擇以在與特定化合物鍵聯的一個或一個以上分子與其所結合的分子或所述化合物之間提供特定所需間隔或構象。
如本發(fā)明中所使用，術語“生物可用性”是指物質或其活性部分從醫(yī)藥劑型傳遞并且在作用部位處或在一般循環(huán)中變得可用的速率以及程度。生物可用性的增加是指增加物質或其活性部分從醫(yī)藥劑型傳遞并且在作用部位處或在一般循環(huán)中變得可用的速率以及程度。舉例來說，生物可用性的增加是指示為與其它物質或活性部分相比時血液中物質或其活性部分的濃度的增加。這種方法視情況用于評估任何多肽的生物可用性。
當在本發(fā)明中使用時，術語“生物活性分子”、“生物活性部分”或“生物活性劑”表示可影響生物系統、途徑、分子的任何物理或生物化學性質或與生物體相關的相互作用的任何物質，所述生物體包括(但不限于)病毒、細菌、噬菌體、轉位子、朊病毒、昆蟲、真菌、植物、動物和人類。具體來說，如本發(fā)明中所使用，生物活性分子包括(但不限于)打算用于診斷、治愈、緩解、治療或預防人類或其它動物的疾病，或以其它方式增強人類或動物的身體或精神健康狀況的任何物質。生物活性分子的實施例包括(但不限于)肽、蛋白質、酶、小分子藥物、硬性毒品、軟性毒品、碳水化合物、無機原子或分子、染料、脂質、核苷、放射性核素、寡核苷酸、毒素、細胞、病毒、脂質體、微粒和膠束。適于與本發(fā)明中所述的方法和組合物一起使用的生物活性劑的種類包括(但不限于)藥物、前藥、放射性核素、顯象劑、聚合物、抗生素、殺真菌劑、抗病毒劑、消炎劑、抗腫瘤劑、心血管劑、抗焦慮劑、激素、生長因子、類固醇劑、微生物來源的毒素等。
“調節(jié)生物活性”表示增加或降低多肽的反應性，改變多肽的選擇性，增強或降低多肽的底物選擇性。可通過比較非天然多肽的生物活性與天然多肽的生物活性來進行生物活性改變的分析。
如本發(fā)明中所使用，術語“生物材料”是指生物來源的材料，其包括(但不限于)從生物反應器和/或由重組方法和技術獲得的材料。
如本發(fā)明中所使用，術語“生物物理探針”是指可檢測或監(jiān)測分子的結構變化的探針。這些分子包括(但不限于)蛋白質，并且“生物物理探針”視情況用于檢測或監(jiān)測蛋白質與其它大分子的相互作用。生物物理探針的實施例包括(但不限于)自旋標記、熒光團和可光活化基團。
如本發(fā)明中所使用，術語“生物合成”是指利用翻譯系統(細胞或非細胞)的任何方法，其包括使用以下組分中的至少一個多核苷酸、密碼子、tRNA和核糖體。舉例來說，使用部分VIII“包含非天然氨基酸的多肽的活體內產生”中所述的方法和技術將非天然氨基酸“通過生物合成并入”非天然氨基酸多肽中。
如本發(fā)明中所使用，術語“生物素類似物”(或也稱作“生物素模擬物”)是除生物素之外以高親和力與抗生物素蛋白和/或抗生物素蛋白鏈菌素結合的任何分子。
如本發(fā)明中所使用，術語“羰基”是指在選自由-C(O)-、-S(O)-、-S(O)2-和-C(S)-組成的群組的部分處所含的基團，其包括(但不限于)含有至少一個酮基和/或至少一個醛基和/或至少一個酯基和/或至少一個羧酸基團和/或至少一個硫酯基的基團。這些羰基包括酮、醛、羧酸、酯和硫酯。另外，這些基團視情況為線性、分枝或環(huán)狀分子的部分。
如本發(fā)明中所使用，術語“可化學裂解的基團”(也稱作“化學上不穩(wěn)定”)是指在暴露于酸、堿、氧化劑、還原劑、化學引發(fā)劑或自由基引發(fā)劑后分解或裂解的基團。
如本發(fā)明中所使用，術語“化學發(fā)光基團”是指在不加熱的情況下由于化學反應而發(fā)光的基團。僅舉例來說，在堿和金屬催化劑的存在下，魯米諾(luminol)(5-氨基-2，3-二氫-1，4-酞嗪二酮)與氧化劑(如過氧化氫(H2O2))反應產生激發(fā)態(tài)產物(3-氨基鄰苯二甲酸鹽，3-APA)。
如本發(fā)明中所使用，術語“發(fā)色團”是指吸收可見光波長、紫外線波長或紅外線波長的光的分子。
如本發(fā)明中所使用，術語“輔因子”是指大分子的作用所必需的原子或分子。輔因子包括(但不限于)無機離子、輔酶、蛋白質或酶的活性所必需的一些其它因子。實施例包括血紅蛋白中的血紅素、葉綠素中的鎂，以及用于蛋白質的金屬離子。
如本發(fā)明中所使用，“比較窗口”是指在將特定序列與具有相同數目的鄰接位置的參考序列最佳比對后用于對這兩個序列進行比較的任一鄰接位置的區(qū)段。這些鄰接位置包括(但不限于)由約20個到約600個連續(xù)單元組成的群組，其包括約50個到約200個連續(xù)單元，以及約100個到約150個連續(xù)單元。僅舉例來說，這些序列包括多肽和含有非天然氨基酸的多肽，其中連續(xù)單元包括(但不限于)天然氨基酸和非天然氨基酸。另外，僅舉例來說，這些序列包括多核苷酸，其中核苷酸為相應連續(xù)單元。用于比較的序列比對方法包括(但不限于)Smith和Waterman(1970)Adv.Appl.Math.2482c的局部同源性算法；Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48443的同源性比對算法；Pearson和Lipman(1988)Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 852444的相似性搜索方法；這些算法的計算機實施(WisconsinGenetics Software Package，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WI中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)；或手工比對和目測檢查(例如參見Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology(1995增刊))。
舉例來說，用于測定序列一致性百分比和序列相似性的算法為BLAST和BLAST 2.0算法，其分別描述于Altschul等人，(1997)Nuc.Acids Res.253389-3402，和Altschul等人，(1990)J.Mol.Biol.215403-410中。進行BLAST分析的軟件可通過美國國家生物科技信息中心(National Center for BiotechnologyInformation)公開獲得。BLAST算法參數W、T和X將決定比對的靈敏度和速度。BLASTN程序(對于核苷酸序列)使用字長(W)為11、期望值(E)為10、M＝5、N＝-4以及兩條鏈的比較作為默認值。對于氨基酸序列，BLASTP程序使用字長為3以及期望值(E)為10以及BLOSUM62計分矩陣(參見Henikoff和Henikoff(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8910915)比對(B)為50、期望值(E)為10、M＝5、N＝-4以及兩條鏈的比較作為默認值。在進行BLAST算法時通常關閉“低復雜度”過濾。
BLAST算法也進行兩個序列之間相似性的統計分析(例如參見Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905873-5787)。由BLAST算法提供的一種相似性量度是最小和概率(P(N))，其提供兩個核苷酸或氨基酸序列之間偶然會發(fā)生匹配的概率的指示。舉例來說，如果在測試核酸與參考核酸的比較中，最小和概率小于約0.2，或小于約0.01，或小于約0.001，那么就認為核酸與參考序列相似。
術語“保守性修飾變異體”適用于天然和非天然氨基酸序列與天然和非天然核酸序列，和其組合。對于特定核酸序列來說，“保守性修飾變異體”是指編碼一致或基本上一致的天然和非天然氨基酸序列的天然和非天然核酸，或當天然和非天然核酸不編碼天然和非天然氨基酸序列時是指基本上一致的序列。舉例來說，由于遺傳密碼的簡并性，大量功能相同的核酸編碼任何給定蛋白質。舉例來說，密碼子GCA、GCC、GCG和GCU都編碼氨基酸丙氨酸。因此，在丙氨酸由密碼子指定的每一位置處，密碼子可改變?yōu)槿我粋€所述的相應密碼子而不改變所編碼的多肽。這些核酸變異為“沉默變異(silent variation)”，其為保守性修飾變異中的一種。因此，例如編碼天然或非天然多肽的本發(fā)明中的每一天然或非天然核酸序列也描述天然或非天然核酸的每一種可能的沉默變異。天然或非天然核酸中的每一密碼子(除AUG和TGG之外，其中AUG通常僅為蛋氨酸的密碼子，TGG通常僅為色氨酸的密碼子)可經修飾以產生功能相同的分子。因此，編碼天然和非天然多肽的天然和非天然核酸的每一沉默變異隱含在每一所述序列中。
關于氨基酸序列，對改變、添加或缺失編碼序列中的單一天然和非天然氨基酸或少量天然和非天然氨基酸的核酸、肽、多肽或蛋白質序列的個別取代、缺失或添加為“保守性修飾變異體”，其中所述改變將導致氨基酸的缺失、氨基酸的添加，或天然和非天然氨基酸經化學上類似的氨基酸取代?？茖W文獻中可獲得的保守性取代表提供功能類似的天然氨基酸。這些保守性修飾變異體除為多態(tài)變異體之外(并且不排除這些變異體)，還為種間同系物以及本發(fā)明中所述方法和組合物的等位基因。
以下八組各自含有彼此為保守性取代的氨基酸 1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)； 2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)； 3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)； 4)精氨酸(R)、賴氨酸(K)； 5)異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、纈氨酸(V)； 6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)； 7)絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)；和 8)半胱氨酸(C)、蛋氨酸(M) (例如參見Creighton，ProteinsStructures and Molecular Properties(W HFreeman & Co.；第2版(1993年12月))。
除非另外指出，否則術語“環(huán)烷基”和“雜環(huán)烷基”(自身或與其它術語組合)分別表示“烷基”和“雜烷基”的環(huán)狀形式。因此，環(huán)烷基或雜環(huán)烷基包括飽和、部分不飽和和完全不飽和的環(huán)鍵聯。另外，對于雜環(huán)烷基，雜原子可占據雜環(huán)與分子的其余部分相連接的位置。雜原子包括(但不限于)氧、氮或硫。環(huán)烷基的實施例包括(但不限于)環(huán)戊基、環(huán)己基、1-環(huán)己烯基、3-環(huán)己烯基、環(huán)庚基等。雜環(huán)烷基的實施例包括(但不限于)1-(1，2，5，6-四氫吡啶基)、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-嗎啉基、3-嗎啉基、四氫呋喃-2-基、四氫呋喃-3-基、四氫噻吩-2-基、四氫噻吩-3-基、1-哌嗪基、2-哌嗪基等。另外，所述術語還涵蓋多環(huán)結構，其包括(但不限于)雙環(huán)結構和三環(huán)結構。類似地，術語“亞雜環(huán)烷基”(自身或作為另一分子的部分)表示衍生自雜環(huán)烷基的二價基團，并且術語“亞環(huán)烷基”(自身或作為另一分子的部分)表示衍生自環(huán)烷基的二價基團。
如本發(fā)明中所使用，術語“環(huán)糊精”是指在成環(huán)時由至少6到8個葡萄糖分子組成的環(huán)狀碳水化合物。環(huán)的外部含有水溶性基團；在環(huán)的中心是能夠容納小分子的相對非極性空穴。
如本發(fā)明中所使用，術語“細胞毒性”是指傷害細胞的化合物。
如本發(fā)明中所使用，術語“所需官能團”是指以下群組中的任一個標記；染料；聚合物；水溶性聚合物；聚乙二醇的衍生物；光交聯劑；細胞毒性化合物；藥物；親和性標記；光親和性標記；反應性化合物；樹脂；第二蛋白質或多肽或多肽類似物；抗體或抗體片段；金屬螯合劑；輔因子；脂肪酸；碳水化合物；多核苷酸；DNA；RNA；反義多核苷酸；糖類、水溶性樹枝狀聚合物、環(huán)糊精、生物材料；納米粒子；自旋標記；熒光團；含金屬的部分；放射性部分；新穎官能團；與其它分子共價或非共價相互作用的基團；光籠化部分；光化輻射可激發(fā)的部分；配體；可光致異構化部分；生物素；生物素類似物；結合有重原子的部分；可化學裂解的基團；可光裂解的基團；延長的側鏈；碳鍵聯的糖；氧化還原活性劑；氨基硫代酸；毒性部分；經同位素標記的部分；生物物理探針；磷光基團；化學發(fā)光基團；電子致密基團；磁性基團；插入基團；發(fā)色團；能量轉移劑；生物活性劑(在這種情況下，生物活性劑可包括具有治療活性的藥劑，并且非天然氨基酸多肽或經修飾的非天然氨基酸可與附屬治療劑一起充當共治療劑或充當向生物體內的所需位點傳遞治療劑的工具)；可檢測標記；小分子；抑制性核糖核酸；放射性核苷酸；中子俘獲劑；生物素的衍生物；量子點；納米傳遞素；放射性傳遞素；抗體酶、活化復合激活劑、病毒、佐劑、糖苷配基、過敏原、血管抑素、抗激素、抗氧化劑、適體、向導RNA、皂角苷、穿梭載體、大分子、擬抗原決定基、受體、反膠束和其任何組合。
如本發(fā)明中所使用，術語“肼”是指包含至少一個肼官能團的基團/分子。
如本發(fā)明中所使用，術語“可檢測標記”是指可視情況使用分析技術觀測到的標記，這些分析技術包括(但不限于)熒光、化學發(fā)光、電子自旋共振、紫外/可見吸收光譜、質譜、核磁共振、磁共振和電化學方法。
如本發(fā)明中所使用，術語“羰基”是指含有至少一個醛或一個酮的基團/分子。
如本發(fā)明中所使用，術語“藥物”是指在疾病或病狀的預防、診斷、緩解、治療或治愈中使用的任何物質。
如本發(fā)明中所使用，術語“染料”是指含有發(fā)色團的可溶性染色物質。
如本發(fā)明中所使用，術語“有效量”是指會在一定程度上減輕所治療疾病或病狀的一種或一種以上癥狀的所投與的藥劑或化合物的足夠量。結果可為疾病的癥候、癥狀或病因的減少和/或緩解，或生物系統的任何其它所需改變。舉例來說，所投與的藥劑或化合物包括(但不限于)天然氨基酸多肽、非天然氨基酸多肽、經修飾的天然氨基酸多肽，或經修飾的非天然氨基酸多肽。可投與含有這些天然氨基酸多肽、非天然氨基酸多肽、經修飾的天然氨基酸多肽或經修飾的非天然氨基酸多肽的組合物來進行預防性、增強性和/或治療性治療。視情況使用諸如劑量遞增研究等技術來確定在任何個別情況下的適當“有效”量。
如本發(fā)明中所使用，術語“電子致密基團”是指當用電子束照射時散射電子的基團。這些基團包括(但不限于)鉬酸銨、堿式硝酸鉍、碘化鎘(99％)、碳酰肼、六水合氯化鐵、六亞甲基四胺(98.5％)、無水三氯化銦、硝酸鑭、三水合乙酸鉛、三水合檸檬酸鉛、硝酸鉛、高碘酸、磷鉬酸、磷鎢酸、鐵氰化鉀、亞鐵氰化鉀、釕紅、硝酸銀、蛋白銀(Ag檢定8.0-8.5％)“強”、四苯基卟吩銀(S-TPPS)、氯金酸鈉、鎢酸鈉、硝酸鉈、氨基硫脲(TSC)、乙酸鈾酰、硝酸鈾酰和硫酸氧釩。
如本發(fā)明中所使用，術語“能量轉移劑”是指可貢獻或接受來自另一分子的能量的分子。僅舉例來說，熒光共振能量轉移(FRET)是偶極-偶極耦合過程，熒光供體分子的激發(fā)態(tài)能量通過這個過程非輻射性地轉移到未激發(fā)受體分子上，所述未激發(fā)受體分子隨后以較長波長熒光發(fā)射獲贈的能量。
術語“增強”表示增加或延長所需作用的效力或持續(xù)時間。舉例來說，“增強”治療劑的作用是指在治療疾病、病癥或病狀期間在效力或持續(xù)時間方面增加或延長治療劑作用的能力。如本發(fā)明中所使用，“增強有效量”是指在治療疾病、病癥或病狀期間足以增強治療劑作用的量。當用于患者中時，有效用于此用途的量應取決于疾病、病癥或病狀的嚴重性和過程、先前治療、患者的健康狀態(tài)和對藥物的反應，以及主治醫(yī)師的判斷。
如本發(fā)明中所使用，術語“真核生物”是指屬于系統發(fā)育域(phylogeneticdomain)真核域(Eucarya)的生物體，包括(但不限于)動物(包括(但不限于)哺乳動物、昆蟲、爬行動物、鳥類等)、纖毛蟲、植物(包括(但不限于)單子葉植物、雙子葉植物和藻類)、真菌、酵母、鞭毛蟲、微孢子蟲和原生生物。
如本發(fā)明中所使用，術語“脂肪酸”是指具有約C6或更長烴側鏈的羧酸。
如本發(fā)明中所使用，術語“熒光團”是指經激發(fā)后發(fā)射光子并且進而發(fā)熒光的分子。
如本發(fā)明中所使用，術語“官能團”、“活性部分”、“活化基團”、“離去基團”、“反應性位點”、“化學反應性基團”以及“化學反應性部分”是指發(fā)生化學反應的分子的部分或單元。這些術語在化學領域中在一定程度上同義，并且在本發(fā)明中用于指示執(zhí)行某些功能或活性并與其它分子具有反應性的分子的部分。
術語“鹵素”包括氟、氯、碘和溴。
如本發(fā)明中所使用，術語“鹵?；笔侵负宣u素部分的酰基，其包括(但不限于)-C(O)CH3、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3等。
如本發(fā)明中所使用，術語“鹵烷基”是指含有鹵素部分的烷基，其包括(但不限于)-CF3和-CH2CF3等。
如本發(fā)明中所使用，術語“雜烷基”是指直鏈或支鏈或環(huán)狀烴基，或其組合，其由烷基和至少一個選自由O、N、Si和S組成的群組的雜原子組成，并且其中氮原子和硫原子視情況經氧化，并且氮雜原子視情況經季銨化。雜原子O、N和S以及Si視情況位于雜烷基的任何內部位置處或位于烷基與分子的其余部分相連接的位置處。實施例包括(但不限于)-CH2-CH2-O-CH3、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-CH2-N(CH3)-CH3、-CH2-S-CH2-CH3、-CH2-CH2、-S(O)-CH3、-CH2-CH2-S(O)2-CH3、-CH＝CH-O-CH3、-Si(CH3)3、-CH2-CH＝N-OCH3和-CH＝CH-N(CH3)-CH3。另外，至多兩個雜原子視情況為連續(xù)的，諸如，僅舉例來說，-CH2-NH-OCH3和-CH2-O-Si(CH3)3。
術語“基于雜環(huán)的鍵聯”或“雜環(huán)鍵聯”是指由羰基與肼基的反應形成的部分。所得反應產物是雜環(huán)，包括雜芳基或雜環(huán)烷基。所得雜環(huán)基團充當非天然氨基酸或非天然氨基酸多肽與另一官能團之間的化學鍵聯。在一個實施例中，雜環(huán)鍵聯包括含氮雜環(huán)鍵聯，包括(僅舉例來說)吡咯鍵聯、吲哚鍵聯、苯并二氮呼鍵聯和吡唑酮(pyrazalone)鍵聯。
類似地，術語“亞雜烷基”是指由雜烷基衍生的二價基團，如由-CH2-CH2-S-CH2CH2-和-CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-所例示(但并非限制)。對于亞雜烷基來說，相同或不同的雜原子也可占據鏈的一端或兩端(包括(但不限于)亞烷基氧基、亞烷基二氧基、亞烷基氨基、亞烷基二氨基、氨基氧基亞烷基等)。更進一步地，對于亞烷基和亞雜烷基鍵聯基團來說，鍵聯基團的化學式所書寫的方向并不表示鍵聯基團的定向。舉例來說，式-C(O)2R′-表示-C(O)2R′-與-R′C(O)2-兩者。
如本發(fā)明中所使用，術語“雜芳基”或“雜芳香族”是指含有至少一個選自N、O和S的雜原子的芳基；其中氮原子和硫原子視情況經氧化，并且氮原子視情況經季銨化。雜芳基視情況經取代或未經取代。雜芳基視情況通過雜原子連接到分子的其余部分上。雜芳基的非限制性實施例包括1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-噁唑基、4-噁唑基、2-苯基-4-噁唑基、5-噁唑基、3-異噁唑基、4-異噁唑基、5-異噁唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-異喹啉基、5-異喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基和6-喹啉基。
如本發(fā)明中所使用，術語“同系烷基”是指作為烴基的烷基。
如本發(fā)明中所使用，術語“一致”是指相同的兩個或兩個以上序列或子序列。另外，如本發(fā)明中所使用，術語“實質上一致”是指當經由比較窗口或如使用比較算法或通過手工比對和目測檢查所測量的指定區(qū)域比較和比對最大對應性時，具有一定百分比的相同連續(xù)單元的兩個或兩個以上序列。僅舉例來說，如果在指定區(qū)域上連續(xù)單元為約60％一致、約65％一致、約70％一致、約75％一致、約80％一致、約85％一致、約90％一致或約95％一致，那么兩個或兩個以上序列為“實質上一致的”。這些百分比描述兩個或兩個以上序列的“一致性百分比”。序列的一致性可存在于長度為至少約75-100個連續(xù)單元的區(qū)域上、長度為約50個連續(xù)單元的區(qū)域上，或(如果未指定)整個序列上。這個定義也涉及測試序列的互補序列。僅舉例來說，當氨基酸殘基相同時，兩個或兩個以上的多肽序列為一致的，而如果氨基酸殘基在指定區(qū)域上為約60％一致、約65％一致、約70％一致、約75％一致、約80％一致、約85％一致、約90％一致或約95％一致，那么兩個或兩個以上的多肽序列為“實質上一致的”。一致性可存在于長度為至少約75-100個氨基酸的區(qū)域上、長度為約50個氨基酸的區(qū)域上，或(如果未指定)多肽序列的整個序列上。另外，僅舉例來說，當核酸殘基相同時，兩個或兩個以上的多核苷酸序列為一致的，而如果核酸殘基在指定區(qū)域上為約60％一致、約65％一致、約70％一致、約75％一致、約80％一致、約85％一致、約90％一致或約95％一致，那么兩個或兩個以上的多核苷酸序列為“實質上一致的”。一致性可存在于長度為至少約75-100個核酸的區(qū)域上、長度為約50個核酸的區(qū)域上，或(如果未指定)多核苷酸序列的整個序列上。
關于序列比較，通常一個序列充當與測試序列進行比較的參考序列。當使用序列比較算法時，將測試序列和參考序列輸入計算機中，指定子序列坐標，(必要時)并指定序列算法程序參數。可使用默認程序參數，或可指定替代參數。隨后，序列比較算法基于程序參數計算測試序列相對于參考序列的序列一致性百分比。
如本發(fā)明中所使用，術語“免疫原性”是指對投與治療藥物作出反應的抗體?？墒褂糜糜跈z測生物流體中的抗非天然氨基酸多肽抗體的定量和定性檢定來獲得針對治療性非天然氨基酸多肽的免疫原性。這些檢定包括(但不限于)放射性免疫測定(RIA)、酶聯免疫吸附檢定(ELISA)、發(fā)光免疫檢定(LIA)和熒光免疫檢定(FIA)。針對治療性非天然氨基酸多肽的免疫原性的分析包括比較投與治療性非天然氨基酸多肽后的抗體反應和投與治療性天然氨基酸多肽后的抗體反應。
如本發(fā)明中所使用，術語“插入劑”(也稱作“插入基團”)是指可插入分子的分子內空間或分子之間的分子間空間中的化學品。僅舉例來說，插入劑或插入基團是插入DNA雙螺旋的堆積堿基中的分子。
如本發(fā)明中所使用，術語“分離”是指從非關注組分中分離并移出所關注的組分。經分離的物質可為干燥或半干燥狀態(tài)，或為溶液形式，其包括(但不限于)水溶液。經分離的組分可為均質狀態(tài)，或經分離的組分可為包含其它醫(yī)藥學上可接受的載劑和/或賦形劑的醫(yī)藥組合物的部分。使用分析化學技術來測定純度和均質性，所述技術包括(但不限于)聚丙烯酰胺凝膠電泳或高效液相色譜。另外，當所關注的組分經分離并且是制劑中存在的主要物質時，本發(fā)明中將所述組分描述為實質上經純化。如本發(fā)明中所使用，術語“純化”是指所關注的組分為至少85％純、至少90％純、至少95％純、至少99％或更純。僅舉例來說，當核酸或蛋白質不含至少一些在天然狀態(tài)下與其締合的細胞組分，或所述核酸或蛋白質已經濃縮到比其在活體內或活體外產生的濃度高的水平時，這些核酸或蛋白質為“經分離的”。同樣，舉例來說，當基因從側接所述基因并且編碼除所關注的基因以外的蛋白質的開放閱讀框分離時，所述基因為經分離的。
如本發(fā)明中所使用，術語“標記”是指并入化合物中并且易于檢測的物質，借此視情況檢測和/或監(jiān)測其物理分布。
如本發(fā)明中所使用，術語“鍵聯”是指由連接子的官能團與另一分子之間的化學反應形成的鍵或化學部分。這些鍵包括(但不限于)共價鍵和非共價鍵，而這些化學部分包括(但不限于)酯、碳酸酯、亞胺、磷酸酯、腙、縮醛、原酸酯、肽鍵和寡核苷酸鍵。水解穩(wěn)定的鍵聯表示所述鍵聯在水中實質上穩(wěn)定并且在適用的pH值下(包括(但不限于)在生理條件下)長期(或許甚至無限期地)不與水反應。水解不穩(wěn)定或可降解的鍵聯表示所述鍵聯可在水或水溶液(例如包括血液)中降解。酶促不穩(wěn)定或可降解的鍵聯表示所述鍵聯可由一種或一種以上酶降解。僅舉例來說，PEG和相關聚合物包括在聚合物主鏈中或在聚合物主鏈與聚合物分子的一個或一個以上末端官能團之間的連接子基團中的可降解鍵聯。這些可降解的鍵聯包括(但不限于)由PEG羧酸或活化PEG羧酸與生物活性劑上的醇基反應形成的酯鍵，其中這些酯基通常在生理條件下水解以釋放生物活性劑。其它水解可降解的鍵聯包括(但不限于)碳酸酯鍵；由胺與醛反應形成的亞胺鍵；由醇與磷酸酯基反應形成的磷酸酯鍵；作為酰肼與醛的反應產物的腙鍵；作為醛與醇的反應產物的縮醛鍵；作為甲酸鹽與醇的反應產物的原酸酯鍵；由胺基(包括(但不限于)在諸如PEG的聚合物的末端上)與肽的羧基形成的肽鍵；以及由亞磷酰胺基(包括(但不限于)在聚合物的末端上)與寡核苷酸的5′羥基形成的寡核苷酸鍵。
如本發(fā)明中所使用，術語“培養(yǎng)基”是指用于生長和收集細胞和/或由這些細胞表達和/或分泌的產物的任何培養(yǎng)基。這些“培養(yǎng)基”包括(但不限于)溶液、固體、半固體或支撐或含有任何宿主細胞的剛性支撐物，所述宿主細胞包括(例如)細菌宿主細胞、酵母宿主細胞、昆蟲宿主細胞、植物宿主細胞、真核宿主細胞、哺乳動物宿主細胞、CHO細胞、原核宿主細胞、大腸桿菌(E.coli)或假單胞菌(Pseudomonas)宿主細胞，以及細胞內含物。這些“培養(yǎng)基”包括(但不限于)已生長宿主細胞的培養(yǎng)基、已分泌多肽的培養(yǎng)基，包括在增殖步驟之前或之后的培養(yǎng)基。這些“培養(yǎng)基”也包括(但不限于)含有宿主細胞溶解產物的緩沖劑或試劑，所述溶解產物例如在細胞內產生的多肽，并且宿主細胞已溶解或受到破壞以釋放所述多肽。
如本發(fā)明中所使用，術語“代謝物”是指化合物(例如天然氨基酸多肽、非天然氨基酸多肽、經修飾的天然氨基酸多肽或經修飾的非天然氨基酸多肽)的衍生物，其是在化合物(例如天然氨基酸多肽、非天然氨基酸多肽、經修飾的天然氨基酸多肽或經修飾的非天然氨基酸多肽)代謝時形成的。術語“醫(yī)藥活性代謝物”或“活性代謝物”是指化合物(例如天然氨基酸多肽、非天然氨基酸多肽、經修飾的天然氨基酸多肽或經修飾的非天然氨基酸多肽)的生物活性衍生物，其是在此化合物(例如天然氨基酸多肽、非天然氨基酸多肽、經修飾的天然氨基酸多肽或經修飾的非天然氨基酸多肽)代謝時形成的。
如本發(fā)明中所使用，術語“代謝”是指由生物體改變特定物質的過程的和。這些過程包括(但不限于)水解反應和由酶催化的反應。關于代謝的其它信息是獲自The Pharmacological Basis of Therapeutics，第9版，McGraw-Hill(1996)。僅舉例來說，天然氨基酸多肽、非天然氨基酸多肽、經修飾的天然氨基酸多肽或經修飾的非天然氨基酸多肽的代謝物是通過將天然氨基酸多肽、非天然氨基酸多肽、經修飾的天然氨基酸多肽或經修飾的非天然氨基酸多肽投與宿主并分析來自宿主的組織樣本來鑒別，或通過將天然氨基酸多肽、非天然氨基酸多肽、經修飾的天然氨基酸多肽或經修飾的非天然氨基酸多肽與肝細胞一起活體外培育并且分析所得化合物來鑒別。
如本發(fā)明中所使用，術語“金屬螯合劑”是指與金屬離子形成金屬絡合物的分子。舉例來說，這些分子與中心金屬離子形成兩個或兩個以上的配位鍵并且形成環(huán)結構。
如本發(fā)明中所使用，術語“含金屬的部分”是指含有金屬離子、原子或粒子的基團。這些部分包括(但不限于)順鉑(cisplatin)、螯合金屬離子(諸如鎳、鐵和鉑)，以及金屬納米粒子(諸如鎳、鐵和鉑)。
如本發(fā)明中所使用，術語“結合有重原子的部分”是指結合有通常比碳重的原子的離子的基團。這些離子或原子包括(但不限于)硅、鎢、金、鉛和鈾。
如本發(fā)明中所使用，術語“經修飾”是指存在對天然氨基酸、非天然氨基酸、天然氨基酸多肽或非天然氨基酸多肽的改變。這些改變或修飾是視情況通過天然氨基酸、非天然氨基酸、天然氨基酸多肽或非天然氨基酸多肽的合成后修飾，或通過天然氨基酸、非天然氨基酸、天然氨基酸多肽或非天然氨基酸多肽的共翻譯修飾或翻譯后修飾而獲得。形式“經修飾或未經修飾”表示所討論的天然氨基酸、非天然氨基酸、天然氨基酸多肽或非天然氨基酸多肽視情況經修飾，即所討論的天然氨基酸、非天然氨基酸、天然氨基酸多肽或非天然氨基酸多肽可能經修飾或未經修飾。
如本發(fā)明中所使用，術語“經調節(jié)的血清半衰期”是指經修飾的生物活性分子的循環(huán)半衰期相對于其未經修飾形式的正變化或負變化。舉例來說，經修飾的生物活性分子包括(但不限于)天然氨基酸、非天然氨基酸、天然氨基酸多肽或非天然氨基酸多肽。舉例來說，血清半衰期是通過在投與生物活性分子或經修飾的生物活性分子后的多個時間點取血液樣本且測定每一樣本中所述分子的濃度而加以測量。血清濃度與時間的相關性使得可以計算血清半衰期。舉例來說，經調節(jié)的血清半衰期為增加的血清半衰期，其使得給藥方案能夠得到改良或避免毒性作用。此血清增加為至少約兩倍、至少約三倍、至少約五倍，或至少約十倍。這種方法視情況用于評估任何多肽的血清半衰期。
如本發(fā)明中所使用，術語“經調節(jié)的治療半衰期”是指治療有效量的經修飾的生物活性分子的半衰期相對于其未經修飾形式的正變化或負變化。舉例來說，經修飾的生物活性分子包括(但不限于)天然氨基酸、非天然氨基酸、天然氨基酸多肽或非天然氨基酸多肽。舉例來說，治療半衰期是通過在投藥后的多個時間點測量分子的藥物動力學和/或藥效學性質而加以測量。增加的治療半衰期視情況使得能夠得到特定有益給藥方案、特定有益總劑量，或避免不良作用。舉例來說，增加的治療半衰期是由增加的效力、經修飾分子與其標靶的結合增加或減少、未經修飾分子的另一參數或作用機制的增大或減小，或由酶(僅舉例來說，蛋白酶)實現的分子分解的增加或減少而產生的。這種方法用于評估任何多肽的治療半衰期。
如本發(fā)明中所使用，術語“納米粒子”是指具有約500nm到約1nm之間的粒度的粒子。
如本發(fā)明中所使用，術語“接近化學計量”是指參與化學反應的化合物的摩爾比為約0.75到約1.5。
如本發(fā)明中所使用，術語“非真核生物”是指非真核生物體。舉例來說，非真核生物體屬于真細菌(Eubacteria)(其包括(但不限于)大腸桿菌(Escherichiacoli)、嗜熱棲熱菌(Thermus thermophilus)或嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)、熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida))系統發(fā)育域，或古生菌(Archaea)(其包括(但不限于)詹氏甲烷球菌(Methanococcusjannaschii)、熱自養(yǎng)甲烷桿菌(Methanobacterium thermoautotrophicum)、超嗜熱古菌(Archaeoglobus fulgidus)、強烈熾熱球菌(Pyrococcus furiosus)、極端嗜熱古菌(Pyrococcus horikoshii)、嗜熱泉生古細菌(Aeuropyrum pernix)，或諸如沃氏嗜鹽富饒菌(Haloferax volcanii)和嗜鹽菌種NRC-1等嗜鹽菌(Halobacterium))系統發(fā)育域。
“非天然氨基酸”是指不為20種常見氨基酸或吡咯賴氨酸或硒代半胱氨酸中的一種的氨基酸。其它同義術語為“非天然編碼氨基酸”、“非天然存在氨基酸”，以及其各種帶有連字符和不帶連字符的形式。術語“非天然氨基酸”包括(但不限于)通過修飾天然編碼氨基酸(包括(但不限于)20種常見氨基酸或吡咯賴氨酸和硒代半胱氨酸)而天然存在、但本身無法通過翻譯復合物而并入正在生長的多肽鏈中的氨基酸。非天然編碼的天然存在氨基酸的實施例包括(但不限于)N-乙酰葡糖胺基-L-絲氨酸、N-乙酰葡糖胺基-L-蘇氨酸以及O-磷酸酪氨酸。另外，術語“非天然氨基酸”包括(但不限于)并非天然存在并且是通過合成而獲得或通過修飾非天然氨基酸而獲得的氨基酸。
如本發(fā)明中所使用，術語“核酸”是指脫氧核糖核苷酸、脫氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸以及其單鏈或雙鏈形式的聚合物。僅舉例來說，這些核酸和核酸聚合物包括(但不限于)(i)天然核苷酸的類似物，其具有與參考核酸類似的結合性質且以類似于天然存在核苷酸的方式代謝；(ii)寡核苷酸類似物，其包括(但不限于)PNA(肽基核酸)、反義技術中所使用的DNA的類似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酯等)；(iii)其保守性修飾變異體(包括(但不限于)簡并密碼子取代)以及互補序列和明確指出的序列。舉例來說，簡并密碼子取代是通過產生其中一個或一個以上所選(或全部)密碼子的第三位置經混合堿基和/或脫氧肌苷殘基取代的序列來實現(Batzer等人，Nucleic Acid Res.195081(1991)；Ohtsuka等人，J.Biol.Chem.2602605-2608(1985)；和Rossolini等人，Mol.Cell.Probes891-98(1994))。
如本發(fā)明中所使用，術語“氧化劑”是指從被氧化的化合物移除電子的化合物或物質。舉例來說，氧化劑包括(但不限于)氧化型谷胱甘肽、胱氨酸、胱胺、氧化型二硫蘇糖醇、氧化型赤蘚糖醇(oxidized erythreitol)，以及氧。多種氧化劑適用于本發(fā)明中描述的方法和組合物中。
如本發(fā)明中所使用，術語“醫(yī)藥學上可接受”是指包括(但不限于)鹽、載劑或稀釋劑的物質，其不會消除化合物的生物活性或性質，并且相對無毒，即，所述物質經投與到個體而不會造成不良生物作用或以有害方式與含有所述物質的組合物的任一組分相互作用。
如本發(fā)明中所使用，術語“光親和性標記”是指具有特定基團的標記，所述基團在曝露于光之后與對標記具有親和性的分子形成鍵聯。僅舉例來說，此鍵聯可為共價或非共價鍵聯。
如本發(fā)明中所使用，術語“光籠化部分”是指在特定波長下照射后與其它離子或分子共價或非共價地結合的基團。
如本發(fā)明中所使用，術語“可光裂解的基團”是指在曝露于光之后斷裂的基團。
如本發(fā)明中所使用，術語“光交聯劑”是指包含兩個或兩個以上在曝露于光之后可與兩個或兩個以上單體分子或聚合物分子反應并形成共價或非共價鍵聯的官能團的化合物。
如本發(fā)明中所使用，術語“可光致異構化部分”是指經光照射后從一種異構形式變?yōu)榱硪环N異構形式的基團。
如本發(fā)明中所使用，術語“聚烷二醇”是指線性或分枝聚合聚醚多元醇。這些聚烷二醇包括(但不限于)聚乙二醇、聚丙二醇、聚丁二醇和其衍生物。其它例示性實施例是列于(例如)商業(yè)供應商目錄中，諸如Shearwater Corporation的目錄“聚乙二醇和用于生物醫(yī)學應用的衍生物”(“Polyethylene Glycol andDerivatives for Biomedical Applications”)(2001)。僅舉例來說，這些聚合聚醚多元醇具有在所需聚合物分子量范圍內的平均分子量。
如本發(fā)明中所使用，術語“在所需聚合物分子量范圍內”表示介于約0.1kDa與約100kDa之間。舉例來說，介于約100Da與約100,000Da或100,000Da以上之間。聚合物的分子量介于(例如)約100Da與約100,000Da之間，其包括(但不限于)100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da、1,000Da、900Da、800Da、700Da、600Da、500Da、400Da、300Da、200Da和100Da。在一些實施例中，聚合物的分子量介于約100Da與約50,000Da之間。在一些實施例中，聚合物的分子量介于約100Da與約40,000Da之間。在一些實施例中，聚合物的分子量介于約1,000Da與約40,000Da之間。在一些實施例中，聚合物的分子量介于約5,000Da與約40,000Da之間。在一些實施例中，聚合物的分子量介于約10,000Da與約40,000Da之間。在一些實施例中，聚合物分子是支化聚合物。支鏈聚合物的分子量介于(例如)約1,000Da與約100,000Da之間，其包括(但不限于)100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da和1,000Da。在一些實施例中，支鏈聚合物的分子量介于約1,000Da與約50,000Da之間。在一些實施例中，支鏈聚合物的分子量介于約1,000Da與約40,000Da之間。在一些實施例中，支鏈聚合物的分子量介于約5,000Da與約40,000Da之間。在一些實施例中，支鏈聚合物的分子量介于約5,000Da與約20,000Da之間。
如本發(fā)明中所使用，術語“聚合物”是指由重復子單元構成的分子。這些分子包括(但不限于)多肽、多核苷酸或多糖或聚烷二醇。
術語“多肽”、“肽”和“蛋白質”在本發(fā)明中可互換使用來指代氨基酸殘基的聚合物。即，針對多肽的描述同樣適用于對肽的描述以及對蛋白質的描述，且反之亦然。這些術語適用于天然存在氨基酸聚合物以及其中一個或一個以上的氨基酸殘基為非天然氨基酸的氨基酸聚合物。另外，這些“多肽”、“肽”和“蛋白質”包括任何長度的氨基酸鏈，其包括全長蛋白質，其中氨基酸殘基是通過共價肽鍵鍵聯。
術語“翻譯后修飾”是指在天然或非天然氨基酸已通過翻譯并入多肽鏈中之后發(fā)生的所述氨基酸的任何修飾。這些修飾包括(但不限于)共翻譯活體內修飾、共翻譯活體外修飾(諸如在無細胞翻譯系統中)、翻譯后活體內修飾和翻譯后活體外修飾。
如本發(fā)明中所使用，術語“前藥”或“醫(yī)藥學上可接受的前藥”是指在活體內或活體外轉化為母體藥物的藥劑，其中所述物質不會消除藥物的生物活性或性質，并且相對無毒，即，所述物質經投與到個體而不會造成不良生物作用或以有害方式與含有所述物質的組合物的任一組分相互作用。前藥通常為藥物前驅物，在投與個體且隨后吸收后，其通過某些過程(諸如通過代謝途徑轉化)轉化為具有活性或具有更高活性的物質。一些前藥上所存在的化學基團使得前藥的活性較小和/或賦予藥物溶解性或一些其它性質。一旦化學基團已經裂解和/或經修飾，就由前藥產生活性藥物。前藥通過酶促反應或非酶促反應在體內轉化為活性藥物。舉例來說，前藥提供改良的生理化學性質，諸如更好的溶解性、增強的傳遞特性(諸如特異性靶向特定細胞、組織、器官或配體)以及改良的藥物治療價值。這些前藥的益處包括(但不限于)(i)與母體藥物相比，易于投藥；(ii)前藥可通過口服生物利用，而母體藥物不可以；以及(iii)與母體藥物相比，前藥在醫(yī)藥組合物中具有改良的溶解性。前藥包括活性藥物的藥理學非活性或活性降低的衍生物。前藥經設計以用于(例如)調節(jié)藥物或生物活性分子的量，其通過操縱藥物的性質(諸如生理化學性質、生物醫(yī)藥性質或藥物動力學性質)而到達所需作用部位。前藥的實施例(不加限制地)可為以酯(“前藥”)形式投與以利于穿過水溶性對遷移有害的細胞膜傳送的非天然氨基酸多肽，但一旦其處于水溶性有益的細胞內部，前藥就隨后代謝水解為羧酸(活性實體)。前藥也經設計為(例如)可逆藥物衍生物，以用作改性劑以增強向位點特異性組織的藥物傳送。
如本發(fā)明中所使用，術語“預防有效量”是指預防性地應用于患者中的含有至少一種非天然氨基酸多肽或至少一種經修飾的非天然氨基酸多肽的組合物的量，其會在一定程度上減輕所治療的疾病、病狀或病癥的一種或一種以上癥狀。在這些預防性應用中，所述量取決于(例如)患者的健康狀況、體重等因素。
如本發(fā)明中所使用，術語“經保護”是指存在防止化學反應性官能團在某些反應條件下發(fā)生反應的“保護基”或部分。保護基將根據所保護的化學反應性基團的類型而改變。僅舉例來說，(i)如果化學反應性基團為胺或酰肼，那么保護基是選自叔丁氧羰基(t-Boc)和9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)；(ii)如果化學反應性基團為硫醇，那么保護基為鄰吡啶基二硫化物；并且(iii)如果化學反應性基團為羧酸(諸如丁酸或丙酸)或羥基，那么保護基為芐基或諸如甲基、乙基或叔丁基等烷基。
僅舉例來說，封端/保護基是選自

烯丙基 Bn Cbz alloc Me


Et 叔丁基 TBDMS Teoc

(C8H5)3C-

Boc pMBn 三苯甲基乙?；? Fmoc。
另外，保護基包括(但不限于)以下基團，包括諸如Nvoc和MeNvoc等對光不穩(wěn)定的基團以及諸如Greene和Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，第3版，John Wiley & Sons，New York，NY，1999中所述的其它保護基。
如本發(fā)明中所使用，術語“放射性部分”是指核自發(fā)發(fā)出核輻射(諸如α粒子、β粒子或γ粒子)的基團；其中，α粒子為氦核，β粒子為電子，且γ粒子為高能光子。
如本發(fā)明中所使用，術語“反應性化合物”是指在適當條件下對另一原子、分子或化合物具有反應性的化合物。
術語“重組宿主細胞”(也稱作“宿主細胞”)是指包括外源多核苷酸的細胞，其中用于將外源多核苷酸插入細胞中的方法包括(但不限于)直接攝取、轉導或f-配對以產生重組宿主細胞。僅舉例來說，所述外源多核苷酸為非整合載體(包括(但不限于)質粒)，或可整合到宿主基因組中。
如本發(fā)明中所使用，術語“氧化還原活性劑”是指氧化或還原另一分子的分子，借此氧化還原活性劑被還原或氧化。氧化還原活性劑的實施例包括(但不限于)二茂鐵、醌、Ru2+/3+絡合物、Co2+/3+絡合物和Os2+/3+絡合物。
如本發(fā)明中所使用，術語“還原劑”是指能夠向所還原的化合物追加電子的化合物或物質。舉例來說，還原劑包括(但不限于)二硫蘇糖醇(DTT)、2-巰基乙醇、二硫赤蘚糖醇、半胱氨酸、半胱胺(2-氨基乙硫醇)和還原型谷胱甘肽。僅舉例來說，使用這些還原劑來使巰基保持還原狀態(tài)且減少分子內或分子間二硫鍵。
如本發(fā)明中所使用，術語“樹脂”是指高分子量的不溶性聚合物珠粒。僅舉例來說，這些珠粒是用作用于固相肽合成的支撐物，或在純化之前用于附著分子的位點。
如本發(fā)明中所使用，術語“糖類”是指一系列碳水化合物，其包括(但不限于)糖、單糖、寡糖和多糖。
如本發(fā)明中所使用，術語“安全性”或“安全性概況”是指相對于已投與藥物的次數來說與藥物投與相關的副作用。舉例來說，將已投與多次且只產生溫和副作用或無副作用的藥物稱為具有優(yōu)良的安全性概況。這種方法用于(例如)評估任何多肽的安全性概況。
如本發(fā)明中所使用，術語“自旋標記”是指可通過電子自旋共振光譜加以檢測并且可連接到另一分子上的含有展現未成對電子自旋的原子或一組原子(即，穩(wěn)定順磁基團)的分子。這些自旋標記分子包括(但不限于)硝?；拖趸?，并且為單一自旋標記或雙重自旋標記。
如本發(fā)明中所使用，術語“化學計量”是指參與化學反應的化合物的摩爾比為約0.9到約1.1。
如本發(fā)明中所使用，術語“類化學計量”是指在反應條件改變后或在添加劑存在下變?yōu)榛瘜W計量或接近化學計量的化學反應。這些反應條件的改變包括(但不限于)溫度升高或pH值改變。這些添加劑包括(但不限于)加速劑。
如本發(fā)明中所使用，術語“個體”是指作為治療、觀察或實驗對象的動物。僅舉例來說，個體為(但不限于)哺乳動物，其包括(但不限于)人類。
如本發(fā)明中所使用，術語“實質上經純化”是指所關注的組分實質上或基本上不含在純化之前通常伴隨所關注的組分或與所關注的組分相互作用的其它組分。僅舉例來說，當所關注的組分的制劑含有小于約30％、小于約25％、小于約20％、小于約15％、小于約10％、小于約5％、小于約4％、小于約3％、小于約2％或小于約1％(以干重計)的污染組分時，所關注的組分為“實質上經純化”的。因此，“實質上經純化”的所關注的組分具有約70％、約75％、約80％、約85％、約90％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％或更高的純度水平。僅舉例來說，在重組產生的天然氨基酸多肽或非天然氨基酸多肽的情況下，天然氨基酸多肽或非天然氨基酸多肽是從天然細胞或宿主細胞中純化的。舉例來說，當天然氨基酸多肽或非天然氨基酸多肽的制劑含有小于約30％、小于約25％、小于約20％、小于約15％、小于約10％、小于約5％、小于約4％、小于約3％、小于約2％或小于約1％(以干重計)的污染物質時，所述制劑為“實質上經純化”的。舉例來說，當天然氨基酸多肽或非天然氨基酸多肽是由宿主細胞重組產生時，天然氨基酸多肽或非天然氨基酸多肽以細胞干重的約30％、約25％、約20％、約15％、約10％、約5％、約4％、約3％、約2％或約1％或1％以下存在。舉例來說，當天然氨基酸多肽或非天然氨基酸多肽是由宿主細胞重組產生時，天然氨基酸多肽或非天然氨基酸多肽以細胞干重的約5g/L、約4g/L、約3g/L、約2g/L、約1g/L、約750mg/L、約500mg/L、約250mg/L、約100mg/L、約50mg/L、約10mg/L或約1mg/L或1mg/L以下存在于培養(yǎng)基中。舉例來說，“實質上經純化”的天然氨基酸多肽或非天然氨基酸多肽具有如根據適當方法(包括(但不限于)SDS/PAGE分析、RP-HPLC、SEC和毛細管電泳)所測定的約30％、約35％、約40％、約45％、約50％、約55％、約60％、約65％、約70％、約75％、約80％、約85％、約90％、約95％、約99％或更高的純度水平。
術語“取代基”(也稱作“非干擾取代基”)是指用于置換分子上的另一基團的基團。這些基團包括(但不限于)鹵基、C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基、C1-C10烷氧基、C5-C12芳烷基、C3-C12環(huán)烷基、C4-C12環(huán)烯基、苯基、經取代苯基、甲苯基、二甲苯基、聯苯基、C2-C12烷氧基烷基、C5-C12烷氧基芳基、C5-C12芳氧基烷基、C7-C12氧基芳基、C1-C6烷基亞磺?；1-C10烷基磺?；?、-(CH2)m-O-(C1-C10烷基)(其中m為1到8)、芳基、經取代芳基、經取代烷氧基、氟烷基、雜環(huán)基、經取代雜環(huán)基、硝基烷基、-NO2、-CN、-NRC(O)-(C1-C10烷基)、-C(O)-(C1-C10烷基)、C2-C10烷硫基烷基、-C(O)O-(C1-C10烷基)、-OH、-SO2、＝S、-COOH、-NR2、羰基、-C(O)-(C1-C10烷基)-CF3、-C(O)-CF3、-C(O)NR2、-(C1-C10芳基)-S-(C6-C10芳基)、-C(O)-(C6-C10芳基)、-(CH2)m-O-(CH2)m-O-(C1-C10烷基)(其中m各自為1到8)、-C(O)NR2、-C(S)NR2、-SO2NR2、-NRC(O)NR2、-NRC(S)NR2、其鹽等。前述列表中的各R基團包括(但不限于)H、烷基或經取代烷基、芳基或經取代芳基，或烷芳基。當取代基是由其從左向右書寫的常規(guī)化學式指定時，其同樣涵蓋由于從右向左書寫結構而產生的化學上相同的取代基；舉例來說，-CH2O-等于-OCH2-。
僅舉例來說，烷基和雜烷基(包括稱作亞烷基、烯基、亞雜烷基、雜烯基、炔基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、環(huán)烯基和雜環(huán)烯基的那些基團)的取代基包括(但不限于)-OR、＝O、＝NR、＝N-OR、-NR2、-SR、-鹵素、-SiR3、-OC(O)R、-C(O)R、-CO2R、-CONR2、-OC(O)NR2、-NRC(O)R、-NRC(O)NR2、-NR(O)2R、-NR-C(NR2)＝NR、-S(O)R、-S(O)2R、-S(O)2NR2、-NRSO2R、-CN和-NO2。前述列表中的各R基團包括(但不限于)氫、經取代或未經取代的雜烷基、經取代或未經取代的芳基(包括(但不限于)經1或2個鹵素取代的芳基)、經取代或未經取代的烷基、烷氧基或硫代烷氧基或芳烷基。當兩個R基團與同一個氮原子連接時，其可與所述氮原子組合以形成5元環(huán)、6元環(huán)或7元環(huán)。舉例來說，-NR2打算包括(但不限于)1-吡咯烷基和4-嗎啉基。
舉例來說，芳基和雜芳基的取代基包括(但不限于)-OR、＝O、＝NR、＝N-OR、-NR2、-SR、-鹵素、-SiR3、-OC(O)R、-C(O)R、-CO2R、-CONR2、-OC(O)NR2、-NRC(O)R、-NRC(O)NR2、-NR(O)2R、-NR-C(NR2)＝NR、-S(O)R、-S(O)2R、-S(O)2NR2、-NRSO2R、-CN、-NO2、-R、-N3、-CH(Ph)2、氟(C1-C4)烷氧基和氟(C1-C4)烷基，其數目在零到芳香環(huán)系統上的開放價態(tài)的總數的范圍內；并且其中前述列表中的各R基團包括(但不限于)氫、烷基、雜烷基、芳基和雜芳基。
如本發(fā)明中所使用，術語“治療蛋白”是指以下多肽/蛋白質中的任一種或全部α-1抗胰蛋白酶、血管抑素、抗溶血因子、抗體、抗體片段、載脂蛋白、脫輔基蛋白、心房利鈉因子、心房利鈉多肽、心房肽、C-X-C趨化因子、T39765、NAP-2、ENA-78、gro-a、gro-b、gro-c、IP-10、GCP-2、NAP-4、SDF-1、PF4、MIG、降血鈣素、c-kit配體、細胞因子、CC趨化因子、單核細胞趨化蛋白-1、單核細胞趨化蛋白-2、單核細胞趨化蛋白-3、單核細胞炎性蛋白-1α、單核細胞炎性蛋白-iβ、RANTES、1309、R83915、R91733、HCC1、T58847、D31065、T64262、CD40、CD40配體、c-kit配體、膠原蛋白、菌落刺激因子(CSF)、補體因子5a、補體抑制劑、補體受體1、細胞因子、上皮中性粒細胞激活肽-78、MIP-16、MCP-1、表皮生長因子(EGF)、上皮中性粒細胞激活肽、紅細胞生成素(EPO)、剝脫性毒素、因子IX、因子VII、因子VIII、因子X、成纖維細胞生長因子(FGF)、纖維蛋白原、纖維粘連蛋白、四螺旋束蛋白、G-CSF、glp-1、GM-CSF、葡糖腦苷脂酶、促性腺激素、生長因子、生長因子受體、grf、刺猬蛋白、血紅蛋白、肝細胞生長因子(hGF)、水蛭素、人類生長激素(hGH)、人類血清白蛋白、ICAM-1、ICAM-1受體、LFA-1、LFA-1受體、胰島素、類胰島素生長因子(IGF)、IGF-I、IGF-II、干擾素(IFN)、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IFN家族的任何類干擾素分子或成員、白細胞介素(IL)、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、角質細胞生長因子(KGF)、乳鐵蛋白、白血病抑制因子、熒光素酶、神經素、中性粒細胞抑制因子(NIF)、抑瘤素M、成骨蛋白、癌基因產物、paracitonin、甲狀旁腺激素、PD-ECSF、PDGF、肽激素、多效營養(yǎng)因子、蛋白質A、蛋白質G、pth、致熱外毒素A、致熱外毒素B、致熱外毒素C、pyy、松弛素、腎素、SCF、小生物合成蛋白、可溶性補體受體I、可溶性I-CAM1、可溶性白細胞介素受體、可溶性TNF受體、生長調節(jié)素、生長抑素、生長激素、鏈激酶、超抗原、葡萄球菌腸毒素、SEA、SEB、SEC1、SEC2、SEC3、SED、SEE、類固醇激素受體、超氧化物歧化酶、中毒性休克綜合癥毒素、胸腺素α1、組織型纖溶酶原激活劑、腫瘤生長因子(TGF)、腫瘤壞死因子、腫瘤壞死因子α、腫瘤壞死因子β、腫瘤壞死因子受體(TNFR)、VLA-4蛋白、VCAM-1蛋白、血管內皮生長因子(VEGF)、尿激酶、mos、ras、raf、met、p53、tat、fos、myc、jun、myb、rel、雌激素受體、孕酮受體、睪丸激素受體、醛固酮受體、LDL受體和皮質酮。
如本發(fā)明中所使用，術語“治療有效量”是指投與到已罹患疾病、病狀或病癥的患者、足以治愈或至少部分阻止或在一定程度上減輕所治療的疾病、病癥或病狀的一種或一種以上癥狀的含有至少一種非天然氨基酸多肽和/或至少一種經修飾的非天然氨基酸多肽的組合物的量。這些組合物的功效視以下條件而定，所述條件包括(但不限于)疾病、病癥或病狀的嚴重性和過程、先前治療、患者的健康狀態(tài)和對藥物的反應，以及主治醫(yī)師的判斷。僅舉例來說，治療有效量是通過包括(但不限于)劑量遞增臨床試驗的方法來確定。
如本發(fā)明中所使用，術語“硫代烷氧基”是指通過氧原子與分子鍵聯的含硫烷基。
術語“熱熔點”或Tm是在平衡狀態(tài)下50％的與標靶互補的探針與標靶序列雜交的溫度(在確定離子濃度、pH值和核酸濃度下)。
如本發(fā)明中所使用，術語“毒性部分”是指可造成傷害或死亡的化合物。
如本發(fā)明中所使用，術語“治療”包括緩解、緩和或改善疾病或病狀癥狀，預防其它癥狀，改善或預防癥狀的潛在代謝病因，抑制疾病或病狀，例如，阻止疾病或病狀的發(fā)展，減輕疾病或病狀，使得疾病或病狀衰退，減輕由疾病或病狀造成的病狀，或終止疾病或病狀的癥狀。術語“治療”包括(但不限于)預防性和/或治療性治療。
如本發(fā)明中所使用，術語“水溶性聚合物”是指可溶于水性溶劑中的任何聚合物。這些水溶性聚合物包括(但不限于)聚乙二醇、聚乙二醇丙醛、其單C1-C10烷氧基或芳氧基衍生物(描述于揭示這些水溶性聚合物的美國專利第5,252,714號中，所述專利是以引用的方式并入本發(fā)明中)、單甲氧基-聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚氨基酸、二乙烯基醚馬來酸酐、N-(2-羥丙基)-甲基丙烯酰胺、葡聚糖、葡聚糖衍生物(包括硫酸葡聚糖)、聚丙二醇、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙烯化多元醇、肝素、肝素片段、多糖、寡糖、聚糖、纖維素以及纖維素衍生物(包括(但不限于)甲基纖維素和羧甲基纖維素)、血清白蛋白、淀粉以及淀粉衍生物、多肽、聚烷二醇和其衍生物、聚烷二醇和其衍生物的共聚物、聚乙烯基乙醚和α-β-聚[(2-羥乙基)-DL-天冬酰胺]等，或其混合物。僅舉例來說，這些水溶性聚合物與天然氨基酸多肽或非天然氨基酸多肽的偶合可產生改變，所述改變包括(但不限于)水溶性增加、血清半衰期增加或受到調節(jié)、治療半衰期增加或受到調節(jié)(相對于未經修飾的形式)、生物可用性增加、生物活性受到調節(jié)、循環(huán)時間延長、免疫原性受到調節(jié)、物理締合特性受到調節(jié)(包括(但不限于)聚集和多聚物形成、受體結合改變、與一種或一種以上結合搭配物的結合改變，以及受體二聚化或多聚化作用改變)。另外，這些水溶性聚合物視情況具有其自身的生物活性。
除非另外指示，否則使用質譜、NMR、HPLC、蛋白質化學、生物化學、重組DNA技術以及藥理學的常規(guī)方法。
本發(fā)明中呈示的化合物(包括(但不限于)非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽、經修飾的非天然氨基酸多肽，和用于制備前述化合物的試劑)包括經同位素標記的化合物，其與以本發(fā)明中呈示的各式和結構所敘述的那些化合物相同，但一個或一個以上原子經原子質量或質量數與自然界中通常發(fā)現的原子質量或質量數不同的原子置換?？刹⑷氡景l(fā)明化合物中的同位素的實施例包括氫、碳、氮、氧、氟以及氯的同位素，分別為諸如2H、3H、13C、14C、15N、18O、17O、35S、18F、36Cl。本發(fā)明中描述的某些經同位素標記的化合物(例如，其中并入諸如3H和14C等放射性同位素的化合物)適用于藥物和/或底物組織分布檢定。此外，用諸如氘(即2H)等同位素進行取代可提供某些由較高代謝穩(wěn)定性產生的治療優(yōu)點，例如活體內半衰期增加或劑量需求減少。
本發(fā)明中的一些化合物(包括(但不限于)非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和經修飾的非天然氨基酸多肽，以及用于制備前述化合物的試劑)具有不對稱碳原子，并且因此可以對映異構體或非對映異構體形式存在?？赏ㄟ^文獻所記載的方法(例如，通過色譜和/或分級結晶)，基于物理化學差異將非對映異構混合物分離為其個別非對映異構體。通過使對映異構混合物與適當光學活性化合物(例如，醇)反應而將其轉化為非對映異構混合物，分離非對映異構體并且使個別非對映異構體轉化(例如，水解)為相應純對映異構體，從而可分離對映異構體。包括非對映異構體、對映異構體和其混合物的所有這些異構體都被視為本發(fā)明中所描述的組合物的部分。
在另外或其它的實施例中，本發(fā)明中描述的化合物(包括(但不限于)非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和經修飾的非天然氨基酸多肽，以及用于制備前述化合物的試劑)是以前藥的形式使用。在另外或其它的實施例中，本發(fā)明中描述的化合物(包括(但不限于)非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和經修飾的非天然氨基酸多肽，以及用于制備前述化合物的試劑)在投與到需要產生代謝物的生物體中之后代謝，所述代謝物隨后用于產生所需作用，其包括所需治療作用。在其它或另外的實施例中是非天然氨基酸和“經修飾或未經修飾的”非天然氨基酸多肽的活性代謝物。
本發(fā)明中描述的方法和調配物包括使用非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和經修飾的非天然氨基酸多肽的N-氧化物、結晶形式(也稱作多晶型物)或醫(yī)藥學上可接受的鹽。另外，本發(fā)明中描述的非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和經修飾的非天然氨基酸多肽可以非溶劑化形式以及與醫(yī)藥學上可接受的溶劑(諸如水、乙醇等)形成的溶劑化形式存在。本發(fā)明中呈示的非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和經修飾的非天然氨基酸多肽的溶劑化形式也被視為揭示于本發(fā)明中。
本發(fā)明中的一些化合物(包括(但不限于)非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和經修飾的非天然氨基酸多肽，以及用于制備前述化合物的試劑)可以若干互變異構形式存在。所有這些互變異構形式都被視為本發(fā)明中所描述的組合物的部分。同樣，例如本發(fā)明中的任何化合物(包括(但不限于)非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和經修飾的非天然氨基酸多肽，以及用于制備前述化合物的試劑)的所有烯醇-酮形式都被視為本發(fā)明中所描述的組合物的部分。
本發(fā)明中的一些化合物(包括(但不限于)非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和經修飾的非天然氨基酸多肽，以及用于制備前述任一化合物的試劑)呈酸性且與醫(yī)藥學上可接受的陽離子形成鹽。本發(fā)明中的一些化合物(包括(但不限于)非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和經修飾的非天然氨基酸多肽，以及用于制備前述化合物的試劑)呈堿性且因此與醫(yī)藥學上可接受的陰離子形成鹽。包括二鹽的所有這些鹽都在本發(fā)明中所描述的組合物的范圍內，并且是通過文獻所記載的方法來制備。舉例來說，視情況通過在水性、非水性或部分水性介質中使酸性實體與堿性實體接觸來制備鹽。通過使用以下技術中的至少一種來回收鹽過濾；以非溶劑沉淀，接著過濾；蒸發(fā)溶劑；或(在水溶液的情況下)凍干。
當母體非天然氨基酸多肽中存在的酸性質子經金屬離子(例如堿金屬離子、堿土金屬離子或鋁離子)置換或與有機堿配位時，視情況形成本發(fā)明中所揭示的非天然氨基酸多肽的醫(yī)藥學上可接受的鹽。另外，視情況使用起始物質或中間物的鹽來制備所揭示的非天然氨基酸多肽的鹽形式。視情況通過使本發(fā)明中所描述的非天然氨基酸多肽的游離堿形式與醫(yī)藥學上可接受的無機酸或有機酸反應來制備呈醫(yī)藥學上可接受的酸加成鹽(其為醫(yī)藥學上可接受的鹽的類型)形式的本發(fā)明中所描述的非天然氨基酸多肽。或者，通過使本發(fā)明中所描述的非天然氨基酸多肽的游離酸形式與醫(yī)藥學上可接受的無機堿或有機堿反應來制備呈醫(yī)藥學上可接受的堿加成鹽(其為醫(yī)藥學上可接受的鹽的類型)形式的本發(fā)明中所描述的非天然氨基酸多肽。
醫(yī)藥學上可接受的鹽的類型包括(但不限于)(1)與無機酸形成的酸加成鹽，所述無機酸為諸如鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等；或與有機酸形成的酸加成鹽，所述有機酸為諸如乙酸、丙酸、己酸、環(huán)戊烷丙酸、乙醇酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、丁二酸、蘋果酸、馬來酸、富馬酸、酒石酸、檸檬酸、苯甲酸、3-(4-羥基苯甲?；?苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、1，2-乙二磺酸、2-羥基乙磺酸、苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲基雙環(huán)-[2.2.2]辛-2-烯-1-甲酸、葡庚糖酸、4，4′-亞甲基雙-(3-羥基-2-烯-1-甲酸)、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、叔丁基乙酸、月桂基硫酸、葡萄糖酸、谷氨酸、羥基萘甲酸、水楊酸、硬脂酸、粘康酸等；(2)當母體化合物中存在的酸性質子經金屬離子(例如堿金屬離子、堿土金屬離子或鋁離子)置換或與有機堿配位時所形成的鹽?？山邮艿挠袡C堿包括乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、緩血酸胺、N-甲基葡糖胺等?？山邮艿臒o機堿包括氫氧化鋁、氫氧化鈣、氫氧化鉀、碳酸鈉、氫氧化鈉等。
使用多種方法來分析和鑒別非天然氨基酸多肽醫(yī)藥學上可接受的鹽的相應抗衡離子，所述方法包括(但不限于)離子交換色譜、離子色譜、毛細管電泳、感應耦合等離子體、原子吸收光譜、質譜或其任何組合。另外，使用實施例9-17中所描述的技術和方法來測試這些非天然氨基酸多肽醫(yī)藥學上可接受的鹽的治療活性。
應了解，對鹽的提及包括其溶劑加成形式或晶體形式，尤其溶劑化物或多晶型物。溶劑化物含有化學計量或非化學計量的量的溶劑，并且通常在結晶過程中由醫(yī)藥學上可接受的溶劑(諸如水、乙醇等)形成。當溶劑為水時形成水合物，或當溶劑為醇時形成醇化物。多晶型物包括相同元素組成的化合物的不同晶體堆積排列。多晶型物通常具有不同的X射線衍射圖、紅外光譜、熔點、密度、硬度、晶體形狀、光學性質和電學性質、穩(wěn)定性和溶解性。預期諸如再結晶溶劑、結晶速率和存儲溫度等各種因素使得單一晶體形式占優(yōu)勢。
使用多種技術來實現非天然氨基酸多肽醫(yī)藥學上可接受的鹽的多晶型物和/或溶劑化物的篩檢和表征，所述技術包括(但不限于)熱分析、X射線衍射、光譜學、蒸氣吸附和顯微術。熱分析方法專注于熱化學降解或熱物理過程(包括(但不限于)多晶型轉變)，并且這些方法用于分析多晶型形式之間的關系，測定重量損失以測得玻璃化轉變溫度或用于賦形劑相容性研究。這些方法包括(但不限于)差示掃描量熱法(DSC)、調制式差示掃描量熱法(MDSC)、熱重分析(TGA)，以及熱重和紅外分析(TG/IR)。X射線衍射方法包括(但不限于)單晶和粉末衍射計以及同步加速輻射源。所使用的各種光譜技術包括(但不限于)拉曼光譜、FTIR、UVIS和NMR(液態(tài)和固態(tài))。各種顯微術技術包括(但不限于)偏振光顯微術、伴隨能量分散型X射線分析(EDX)的掃描電子顯微術(SEM)、伴隨EDX的環(huán)境掃描電子顯微術(在氣體或水蒸氣氣氛中)、IR顯微術，以及拉曼顯微術。



通過參考闡明說明性實施例的具體實施方式
可獲得對本發(fā)明方法和組合物的特征和優(yōu)點的更好理解，所述實施例中利用本發(fā)明方法、組合物、裝置和設備的原理，并且附隨圖式為 圖1為本發(fā)明中描述的方法、組合物、策略和技術的某些方面的關系的非限制性圖示。
圖2為費歇爾(Fischer)吲哚合成的非限制性圖示。
圖3為用于制備本發(fā)明中描述的非天然氨基酸的合成方法的說明性非限制性實施例。
圖4為用于制備本發(fā)明中描述的非天然氨基酸的合成方法的說明性非限制性實施例。
圖5為用于制備本發(fā)明中描述的非天然氨基酸的合成方法的說明性非限制性實施例。
圖6為用于制備本發(fā)明中描述的非天然氨基酸的合成方法的說明性非限制性實施例。
圖7為用于制備本發(fā)明中描述的非天然氨基酸的合成方法的說明性非限制性實施例。
圖8為用于制備本發(fā)明中描述的非天然氨基酸的合成方法的說明性非限制性實施例。
圖9為用于制備本發(fā)明中描述的非天然氨基酸的合成方法的說明性非限制性實施例。
圖10為用于制備本發(fā)明中描述的非天然氨基酸的合成方法的說明性非限制性實施例。
圖11為用于制備本發(fā)明中描述的非天然氨基酸的合成方法的說明性非限制性實施例。
圖12為金屬離子對費歇爾吲哚合成的影響的說明性非限制性實施例。
圖13為鎳金屬離子對用于制備本發(fā)明中描述的非天然氨基酸的合成方法的加速作用的說明性非限制性實施例。
圖14為溶劑對用于制備本發(fā)明中描述的非天然氨基酸的合成方法的作用的說明性非限制性實施例。
圖15為在本發(fā)明中描述的含吲哚的非氨基酸的合成中所用的含肼的非天然氨基酸試劑的說明性非限制性實施例。
圖16為在本發(fā)明中描述的含吲哚的非天然氨基酸的合成中所用的含羰基的非天然氨基酸試劑與含經掩蔽羰基的非天然氨基酸試劑的說明性非限制性實施例。
圖17為在本發(fā)明中描述的含吲哚的非天然氨基酸的合成中所用的含羰基的非天然氨基酸試劑與含經掩蔽羰基的非天然氨基酸試劑的說明性非限制性實施例。
圖18為在本發(fā)明中描述的含吲哚的非天然氨基酸的合成中所用的含羰基的非天然氨基酸試劑的說明性非限制性實施例。
圖19為用含肼的試劑對含羰基的非天然氨基酸多肽進行翻譯后修飾以形成經修飾的含吲哚的非天然氨基酸多肽的說明性非限制性實施例。
圖20為用含羰基的試劑對含肼的非天然氨基酸多肽進行翻譯后修飾以形成經修飾的含吲哚的非天然氨基酸多肽的說明性非限制性實施例。
圖21為用含肼的試劑對含羰基的蛋白質與含經掩蔽羰基的蛋白質進行標記或修飾以形成含吲哚的非天然氨基酸蛋白質的說明性非限制性實施例。
圖22為用含羰基的試劑對含肼的蛋白質進行標記或修飾以形成含吲哚的非天然氨基酸蛋白質的說明性非限制性實施例。
圖23為(A)通過化學轉化為含羰基的非天然氨基酸多肽對非天然氨基酸多肽進行修飾和(B)通過化學轉化為含肼的非天然氨基酸多肽對非天然氨基酸多肽進行修飾的說明性非限制性實施例。這些非天然氨基酸多肽是用于或并入用于制備、純化、表征和使用本發(fā)明中描述的非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和經修飾的非天然氨基酸多肽的任何方法、組合物、技術和策略中。
圖24A為對含有肼和羰基非天然氨基酸的多肽或蛋白質進行修飾以引入所需官能團的說明性非限制性實施例。這些非天然氨基酸多肽是用于或并入用于制備、純化、表征和使用本發(fā)明中描述的非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和經修飾的非天然氨基酸多肽的任何方法、組合物、技術和策略中。
圖24B為含有官能團的多肽或蛋白質與PEG衍生物的反應的說明性非限制性實施例。這些非天然氨基酸多肽是用于或并入用于制備、純化、表征和使用本發(fā)明中描述的非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和經修飾的非天然氨基酸多肽的任何方法、組合物、技術和策略中。
圖25為使用雙官能連接子基團通過形成吲哚來鍵聯含非天然氨基酸的蛋白質或多肽與PEG衍生物的說明性非限制性代表圖。
圖26為合成兩端都含有肼的雙官能連接子基團的說明性非限制性實施例。
圖27為使用雙官能連接子來形成兩個非天然氨基酸多肽的同型二聚物的說明性非限制性實施例。
圖28為含支化PEG的試劑與含羰基非天然氨基酸的多肽反應形成經吲哚修飾的多肽的說明性非限制性實施例。這些非天然氨基酸多肽是用于或并入用于制備、純化、表征和使用本發(fā)明中描述的非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和經修飾的非天然氨基酸多肽的任何方法、組合物、技術和策略中。
圖29為含支化PEG的試劑與含肼非天然氨基酸的多肽反應形成經吲哚修飾的多肽的說明性非限制性實施例。這些非天然氨基酸多肽是用于或并入用于制備、純化、表征和使用本發(fā)明中描述的非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和經修飾的非天然氨基酸多肽的任何方法、組合物、技術和策略中。
圖30為含有肼和羰基的PEG衍生物的說明性非限制性實施例。

具體實施例方式 I.引言 近年來，已報導蛋白質科學中的全新技術，其克服眾多與蛋白質的位點特異性修飾相關的限制。具體來說，已將新的組分添加到原核生物大腸桿菌(Escherichia coli；E.coli)(例如，L.Wang等人，(2001)，Science 292498-500)以及真核生物釀酒酵母(Sacchromyces cerevisiae；S.cerevisiae)(例如，J.Chin等人，Science 301964-7(2003))的蛋白質生物合成機制中，其使得能夠在活體內將非天然氨基酸并入蛋白質中。使用此方法，已回應琥珀密碼子TAG而將具有新穎化學、物理或生物性質的許多新穎氨基酸(包括光親和性標記和可光致異構化氨基酸、酮氨基酸和糖基化氨基酸)有效且高保真地并入大腸桿菌以及酵母中的蛋白質中。例如，參見J.W.Chin等人，(2002)，Journal of the American ChemicalSociety 1249026-9027(以全文引用的方式并入)；J.W.Chin和P.G.Schultz，(2002)，ChemBioChem 3(11)1135-1137(以全文引用的方式并入)；J.W.Chin等人，(2002)，PNAS United States of America 99(71)11020-11024(以全文引用的方式并入)；以及L.Wang和P.G.Schultz，(2002)，Chem.Comm.，1-11(以全文引用的方式并入)。這些研究已證實有可能選擇性地引入蛋白質中不存在的化學官能團，所述官能團對20種常見的遺傳性編碼氨基酸中存在的所有官能團都呈化學惰性且可用于有效且選擇性地反應以形成穩(wěn)定共價鍵。
II.概述 圖1是本發(fā)明中描述的組合物、方法、技術和策略的非限制性實施例。某種程度上，本發(fā)明中描述制造和使用包含至少一個非天然氨基酸或具有羰基、肼基或雜環(huán)(包括含氮雜環(huán))基團的經修飾非天然氨基酸的多肽的工具(方法、組合物、技術)。羰基包括(但不限于)酮或醛。這些非天然氨基酸視情況含有其它官能團，包括(但不限于)所需官能團。應注意，各種前述官能團并不打算暗示一種官能團的成員不可歸類為另一種官能團的成員。當然，其會根據特定情況而重疊。僅舉例來說，水溶性聚合物與聚乙二醇的衍生物在范圍上重疊，但重疊并不完全并且因此，兩種官能團都在上文中被引用。
如圖1中所示，一方面是使用本發(fā)明中描述的方法、組合物和技術來選擇和設計欲修飾的多肽的方法。視情況重新設計新穎多肽，其包括(僅舉例來說)作為高通量篩檢方法(在這種情況下，設計、合成、表征和/或測試多種多肽)的部分或根據研究人員的興趣來設計?；蛘撸暻闆r根據已知或部分表征的多肽的結構來設計新穎多肽。僅舉例來說，生長激素基因超家族(Growth Hormone GeneSuperfamily)(見下文)已成為科學團體廣泛研究的對象；在一個實施例中，根據這個基因超家族的一個或一個以上成員的結構來設計新穎多肽。選擇哪個或哪些氨基酸來進行取代和/或修飾的原則單獨描述于本發(fā)明中。使用哪種修飾的選擇也描述于本發(fā)明中，并用于滿足實驗人員或最終用戶的需求。這些需求包括(但不限于)操縱多肽的治療功效；改良多肽的安全性概況；調節(jié)多肽的藥物動力學、藥理學和/或藥效學，僅舉例來說，增加水溶性、生物可用性，增加血清半衰期，增加治療半衰期，調節(jié)免疫原性，調節(jié)生物活性或延長循環(huán)時間。另外，這些修飾包括(僅舉例來說)向多肽提供其它官能團；向多肽中并入標簽、標記或可檢測信號；易化多肽的分離性質；以及前述修飾的任何組合。
本發(fā)明中也描述已經修飾或視情況經修飾以含有肼基、羰基或雜環(huán)(包括含氮雜環(huán))基團的非天然氨基酸。羰基包括(但不限于)酮和醛。這個方面包括用于制備、純化、表征和使用這些非天然氨基酸的方法。本發(fā)明中描述的另一方面是將至少一個所述非天然氨基酸并入多肽中的方法、策略和技術。這個方面也包括用于制備、純化、表征和使用含有至少一個所述非天然氨基酸的這些多肽的方法。這個方面同樣包括用于制備、純化、表征和使用可用于制備(至少部分地)含有至少一個非天然氨基酸的多肽的寡核苷酸(包括DNA和RNA)的組合物和方法。這個方面同樣包括用于制備、純化、表征和使用可表達可用于制造(至少部分地)含有至少一個非天然氨基酸的多肽的這些寡核苷酸的細胞的組合物和方法。
因此，本發(fā)明中提供和描述包含至少一個非天然氨基酸或具有肼基、羰基或雜環(huán)(包括含氮雜環(huán))基團的經修飾的非天然氨基酸的多肽。經羰基修飾的非天然氨基酸包括(但不限于)酮和醛。在某些實施例中，具有至少一個非天然氨基酸或具有肼基、羰基或雜環(huán)(包括含氮雜環(huán))基團的經修飾的非天然氨基酸的多肽在所述多肽上的一些位置處包括至少一次共翻譯或翻譯后修飾。在這些實施例中，經羰基修飾的非天然氨基酸進一步包括(但不限于)酮和醛。在一些實施例中，共翻譯或翻譯后修飾通過細胞機制(例如，糖基化、乙?；?、?；?、脂質修飾、棕櫚?；?、棕櫚酸鹽加成、磷酸化、糖脂鍵修飾等)發(fā)生，在許多情況下，這些基于細胞機制的共翻譯或翻譯后修飾發(fā)生在多肽上的天然存在氨基酸位點處，然而，在某些實施例中，基于細胞機制的共翻譯或翻譯后修飾發(fā)生在多肽上的非天然氨基酸位點上。
在其它實施例中，翻譯后修飾并不利用細胞機制，而是通過利用本發(fā)明中描述的化學方法或適用于特定反應性基團的其它方法將包含第二反應性基團的分子(包括(但不限于)所需官能團)連接到至少一個包含第一反應性基團的非天然氨基酸(包括(但不限于)含有酮、醛、肼或雜環(huán)(包括含氮雜環(huán))官能團的非天然氨基酸)上來提供官能團。在某些實施例中，共翻譯或翻譯后修飾是在真核細胞或非真核細胞中活體內進行。在某些實施例中，翻譯后修飾是不利用細胞機制在活體外進行。這個方面同樣包括用于制備、純化、表征和使用含有至少一個所述經翻譯后修飾的非天然氨基酸的這些多肽的方法。
本發(fā)明中描述的方法、組合物、策略和技術的范圍內也包括能夠與作為多肽的部分的非天然氨基酸(含有羰基、酮、酮醛、肼或其經保護形式)反應以產生前述任一翻譯后修飾的試劑。一般來說，所得經翻譯后修飾的非天然氨基酸應產生至少一種吲哚衍生物。在一些實施例中，所得經修飾的基于吲哚的非天然氨基酸經歷后續(xù)修飾反應。這個方面也包括用于制備、純化、表征和使用能夠進行所述非天然氨基酸的任何所述翻譯后修飾的所述試劑的方法。
在某些實施例中，多肽包括至少一種由一種宿主細胞在活體內進行的共翻譯或翻譯后修飾，其中所述翻譯后修飾通常無法通過另一種宿主細胞類型進行。在某些實施例中，多肽包括至少一種由真核細胞在活體內進行的共翻譯或翻譯后修飾，其中所述共翻譯或翻譯后修飾通常無法通過非真核細胞進行。這些共翻譯或翻譯后修飾的實施例包括(但不限于)糖基化、乙?；?、?；?、脂質修飾、棕櫚?；?、棕櫚酸鹽加成、磷酸化、糖脂鍵修飾等。在一個實施例中，共翻譯或翻譯后修飾包含通過GlcNAc-天冬酰胺鍵聯將寡糖與天冬酰胺連接(包括(但不限于)，其中寡糖包含(GlcNAc-Man)2-Man-GlcNAc-GlcNAc等)。在另一個實施例中，共翻譯或翻譯后修飾包含通過GalNAc-絲氨酸、GalNAc-蘇氨酸、GlcNAc-絲氨酸或GlcNAc-蘇氨酸鍵聯將寡糖(包括(但不限于)Gal-GalNAc、Gal-GlcNAc等)與絲氨酸或蘇氨酸連接。分泌信號序列的實施例包括(但不限于)原核分泌信號序列、真核分泌信號序列、關于細菌表達進行5′優(yōu)化的真核分泌信號序列、新穎分泌信號序列、果膠酸裂解酶分泌信號序列、Omp A分泌信號序列和噬菌體分泌信號序列。分泌信號序列的實施例包括(但不限于)STII(原核)、Fd GIII和M13(噬菌體)、Bgl2(酵母)和源自轉位子的信號序列bla。在某些實施例中，蛋白質或多肽可包含分泌或定位序列、抗原決定基標簽、FLAG標簽、聚組氨酸標簽、GST融合物等。這個方面同樣包括用于制備、純化、表征和使用含有至少一種所述共翻譯或翻譯后修飾的這些多肽的方法。在其它實施例中，糖基化非天然氨基酸多肽是以非糖基化形式制備。糖基化非天然氨基酸的此類非糖基化形式是視情況由以下方法或任何所述方法的組合產生，所述方法包括以化學或酶促方式從經分離或實質上經純化或未經純化的糖基化非天然氨基酸多肽中移除寡糖基團；在不使此類非天然氨基酸多肽糖基化的宿主(所述宿主包括經工程化或突變以不使此類多肽糖基化的原核細胞或真核細胞)中產生非天然氨基酸；向細胞培養(yǎng)基(其中，由通常會使此類多肽糖基化的真核細胞產生此類非天然氨基酸多肽)中引入糖基化抑制劑。本發(fā)明中也描述通常經糖基化的非天然氨基酸多肽(通常經糖基化表示當在使天然存在多肽糖基化的條件下制備時會糖基化的多肽)的這些非糖基化形式。當然，通常經糖基化的非天然氨基酸多肽的這些非糖基化形式視情況呈未經純化形式、實質上經純化形式或經分離形式。
在替代實施例中，非天然氨基酸多肽含有至少一個、至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個、至少六個、至少七個、至少八個、至少九個或十個或十個以上含有羰基、酮基、醛基、肼基、雜環(huán)(包括含氮雜環(huán))基團或其經保護形式的非天然氨基酸。非天然氨基酸可相同或不同，例如，蛋白質中可存在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個或20個以上不同位點，其包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個或20個以上不同的非天然氨基酸。在某些實施例中，以蛋白質的天然存在形式存在的特定氨基酸中的至少一個(但少于全部)經非天然氨基酸取代。
本發(fā)明中提供和描述的方法和組合物包括包含至少一個含有羰基、酮基、醛基、肼基、雜環(huán)(包括含氮雜環(huán))基團或其經保護或經掩蔽形式的非天然氨基酸的多肽。將至少一個非天然氨基酸引入多肽中可允許應用包括特定化學反應(包括(但不限于)與一個或一個以上非天然氨基酸反應，而不與通常存在的20種氨基酸反應)的接合化學。一旦并入非天然存在氨基酸側鏈，就可通過利用本發(fā)明中描述的化學方法或適用于天然編碼氨基酸中存在的特定官能團或取代基的化學方法來修飾這些側鏈。
本發(fā)明中描述的非天然氨基酸方法和組合物提供具有多種官能團、取代基或部分的物質與其它物質(包括(但不限于)所需官能團)的接合物。
在某些實施例中，本發(fā)明中描述的非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽、連接子和試劑(包括式I-XV化合物和化合物1-4)在水溶液中在適度酸性條件(包括(但不限于)約1到約6的pH值)下穩(wěn)定。在其它實施例中，這些化合物在適度酸性條件下穩(wěn)定至少一個月。在其它實施例中，這些化合物在適度酸性條件下穩(wěn)定至少2周。在其它實施例中，這些化合物在適度酸性條件下穩(wěn)定至少5天。
本發(fā)明中描述的組合物、方法、技術和策略的另一方面是研究或使用前述任一種經修飾或未經修飾的非天然氨基酸多肽的方法。這個方面中包括(僅舉例來說)將會由于包含經修飾或未經修飾的非天然氨基酸多肽的多肽或蛋白質而獲益的治療、診斷、基于檢定、工業(yè)、化妝品、植物生物學、環(huán)境、能量產生、消費品和/或軍事用途。
III.多肽中非天然氨基酸的定位 本發(fā)明中描述的方法和組合物包括將一個或一個以上非天然氨基酸并入多肽中。在某些實施例中，在不破壞多肽活性的一個或一個以上特定位置處并入一個或一個以上非天然氨基酸。視情況通過進行“保守性”取代(包括(但不限于)以非天然或天然疏水性氨基酸取代疏水性氨基酸，以非天然或天然龐大氨基酸取代龐大氨基酸，以非天然或天然親水性氨基酸取代親水性氨基酸)和/或將非天然氨基酸插入不需活性的位置中來實現此并入。盡管對于本發(fā)明中描述的非天然氨基酸來說，所述取代尚未可知，但在天然存在氨基酸的基團內進行保守性取代的實踐已有文獻記載。類似方法視情況用于本發(fā)明中描述的非天然氨基酸。
可使用多種生物化學和結構方法來選擇多肽內用非天然氨基酸進行取代的所需位點。多肽鏈的任何位置都適于選擇以并入非天然氨基酸，并且對于任何目的來說或在無特定所需目的的情況下，視情況根據合理設計或通過隨機選擇進行選擇。視情況，基于產生具有任何所需性質或活性((包括(但不限于)激動劑、超激動劑、部分激動劑、反向激動劑、拮抗劑、受體結合調節(jié)劑、受體活性調節(jié)劑、與結合搭配物結合的調節(jié)劑、結合搭配物活性調節(jié)劑、結合搭配物構象調節(jié)劑、二聚物或多聚物形成)、與天然分子相比無活性或性質改變的非天然氨基酸多肽(其視情況經進一步修飾或保持未經修飾)，或操縱多肽的任何物理或化學性質(諸如溶解性、聚集或穩(wěn)定性)來進行所需位點的選擇。舉例來說，可使用包括(但不限于)點突變分析、丙氨酸掃描或同系物掃描法的方法來鑒別多肽中需要多肽的生物活性的位置。視多肽所尋求的所需活性而定，除通過包括(但不限于)丙氨酸或同系物掃描誘變的方法鑒別為對生物活性來說較為關鍵的那些殘基之外的殘基是用非天然氨基酸取代的良好候選者?；蛘?，再次視多肽所尋求的所需活性而定，經鑒別為對生物活性來說較為關鍵的位點也是用非天然氨基酸取代的良好候選者。另一代替方法將為用非天然氨基酸簡單進行多肽鏈上每一位置中的連續(xù)取代且觀察對多肽活性的影響。在任何多肽中選擇用非天然氨基酸取代的位置的任何手段、技術或方法都適用于本發(fā)明中描述的方法、技術和組合物中。
也可研究含有缺失的多肽的天然存在突變體的結構和活性以確定可能允許用非天然氨基酸取代的蛋白質區(qū)域。一旦除去可能無法允許用非天然氨基酸取代的殘基，就可使用包括(但不限于)相關多肽和任何締合配體或結合蛋白的三維結構的方法來研究提出的取代在每一剩余位置上的影響。在蛋白質數據庫(ProteinData Bank)(PDB，www.rcsb.org)(含有蛋白質以及核酸的大分子的三維結構數據的集中數據庫)中可獲得多種多肽的X射線結晶和NMR結構，其可用于鑒別可用非天然氨基酸取代的氨基酸位置。另外，如果無法獲得三維結構數據，那么視情況作出模型來研究多肽的二級結構和三級結構。因此，易于獲得可用于用非天然氨基酸取代的氨基酸位置的身份。
并入非天然氨基酸的例示性位點包括(但不限于)從潛在受體結合區(qū)域中排除的那些位點，或與結合蛋白或配體結合的區(qū)域，其完全或部分地對溶劑暴露，與鄰近殘基具有最小氫鍵結相互作用或無氫鍵結相互作用，最低程度地暴露于鄰近反應性殘基，和/或處于如由特定多肽與其相締合受體、配體或結合蛋白的三維晶體結構所預測具有高度彈性的區(qū)域中。
多種非天然氨基酸視情況取代或并入多肽中的給定位置中。舉例來說，根據對多肽與其相締合配體、受體和/或結合蛋白的三維晶體結構的研究來選擇用于并入的特定非天然氨基酸，優(yōu)選保守性取代。
在一個實施例中，本發(fā)明中描述的方法包括向多肽中并入非天然氨基酸，其中所述非天然氨基酸包含第一反應性基團；并且使所述多肽與包含第二反應性基團的分子(包括(但不限于)所需官能團)接觸。在某些實施例中，第一反應性基團是羰基部分并且第二反應性基團是肼部分，由此形成吲哚鍵聯。在某些實施例中，第一反應性基團是肼部分并且第二反應性基團是羰基部分，由此形成吲哚鍵聯。
在一些情況下，使非天然氨基酸取代或并入與多肽內的其它添加、取代或缺失組合以影響其它化學、物理、藥理和/或生物特性。在一些情況下，其它添加、取代或缺失增加多肽的穩(wěn)定性(包括(但不限于)對蛋白水解降解的抗性)或增加多肽對其適當受體、配體和/或結合蛋白的親和性。在一些情況下，其它添加、取代或缺失增加多肽的溶解度(包括(但不限于)，當在大腸桿菌或其它宿主細胞中表達時)。在一些實施例中，選擇用天然編碼或非天然氨基酸取代的位點，此外，選擇另一位點來并入非天然氨基酸，以增加在大腸桿菌或其它重組宿主細胞中表達后的多肽溶解性。在一些實施例中，多肽包含調節(jié)對締合配體、結合蛋白和/或受體的親和性、調節(jié)(包括(但不限于)增加或減少)受體二聚化、穩(wěn)定受體二聚物、調節(jié)循環(huán)半衰期、調節(jié)釋放或生物可用性、利于純化，或改良或改變特定投藥途徑的另一添加、取代或缺失。類似地，非天然氨基酸多肽可包含改良多肽的檢測(包括(但不限于)GFP)、通過組織或細胞膜的轉運、前藥釋放或活化、尺寸減小、純化或其它特性的化學或酶促裂解序列、蛋白酶裂解序列、反應性基團、抗體結合域(包括(但不限于)FLAG或poly-His)或其它基于親和性的序列(包括(但不限于)FLAG、poly-His、GST等)或鍵聯分子(包括(但不限于)生物素)。
IV.作為范例的生長激素超基因家族 本發(fā)明中描述的方法、組合物、策略和技術不限于多肽或蛋白質的特定類型、種類或家族。實際上，幾乎任何多肽都可視情況經設計或修飾以包括至少一個本發(fā)明中描述的經修飾或未經修飾的非天然氨基酸。僅舉例來說，多肽與治療蛋白同源。
因此，關于生長激素(GH)超基因家族的以下描述是為實現說明性目的并且僅作為實施例來提供，并且不會對本發(fā)明中描述的方法、組合物、策略和技術的范圍造成限制。此外，本申請案中對GH多肽的提及打算使用其專業(yè)術語作為GH超基因家族中的任何成員的實施例。因此，應了解，本發(fā)明中關于GH多肽或蛋白質所描述的修飾和化學同樣可適用于GH超基因家族中的任何成員，包括本發(fā)明中特定列出的那些成員。
以下蛋白質包括由生長激素(GH)超基因家族的基因編碼的蛋白質(Bazan，F.，Immunology Today 11350-354(1990)；Bazan，J.F.Science 257410-411(1992)；Mott，H.R.和Campbell，I.D.，Current Opinion in Structural Biology 5114-121(1995)；Silvennoinen，O.和Ihle，J.N.，SIGNALLING BY THE HEMATOPOIETIC CYTOKINERECEPTORS(1996))生長激素、泌乳刺激素、胎盤催乳激素、紅細胞生成素(EPO)、血小板生成素(TPO)、白細胞介素-2(IL-2)、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12(p35次單位)、IL-13、IL-15、抑瘤素M、睫狀神經營養(yǎng)因子、白血病抑制因子、α干擾素、β干擾素、ε干擾素、γ干擾素、ω干擾素、τ干擾素、粒細胞-菌落刺激因子(G-CSF)、粒細胞-巨噬細胞菌落刺激因子(GM-CSF)、巨噬細胞菌落刺激因子(M-CSF)和心肌營養(yǎng)素-1(CT-1)(“GH超基因家族”)。預計這個基因家族的其它成員將來會通過基因克隆和測序加以鑒別。GH超基因家族的成員具有類似的二級結構和三級結構，但其通常具有有限的氨基酸或DNA序列一致性。共同的結構特征使得所述基因家族的新成員易于鑒別且同樣適用本發(fā)明中描述的非天然氨基酸方法和組合物。
包括G-CSF(Zink等人，FEBS Lett.314435(1992)；Zink等人，Biochemistry338453(1994)；Hill等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905167(1993))、GM-CSF(Diederichs，K.等人，Science 1541779-1782(1991)；Walter等人，J.Mol.Biol.2241075-1085(1992))、IL-2(Bazan，J.F.和McKay，D.B.，Science 257410-413(1992))、IL-4(Redfield等人，Biochemistry 3011029-11035(1991)；Powers等人，Science 2561673-1677(1992))和IL-5(Milburn等人，Nature 363172-176(1993))的眾多細胞因子的結構已通過X射線衍射和NMR研究加以確定，并且其展示與GH結構的驚人保守性，但其缺乏顯著的一級序列同源性。根據建模和其它研究認為IFN是這個家族的成員(Lee等人，J.Interferon Cytokine Res.15341(1995)；Murgolo等人，Proteins 1762(1993)；Radhakrishnan等人，Structure 41453(1996)；Klaus等人，J.Mol.Biol.274661(1997))。包括睫狀神經營養(yǎng)因子(CNTF)、白血病抑制因子(LIF)、血小板生成素(TPO)、抑瘤素M、巨噬細胞菌落刺激因子(M-CSF)、IL-3、IL-6、IL-7、IL-9、IL-12、IL-13、IL-15和粒細胞-菌落刺激因子(G-CSF)以及諸如α、β、ω、τ、ε和γ干擾素等IFN的大量其它細胞因子和生長因子都屬于這個家族(在Mott和Campbell，Current Opinion in Structural Biology 5114-121(1995)；Silvennoinen和Ihle(1996)SIGNALLING BY THE HEMATOPOIETICCYTOKINE RECEPTORS中評述)。如今認為所有上述細胞因子和生長因子構成一個大的基因家族。
除了共有類似的二級結構和三級結構之外，這個家族的成員還共有以下性質，即其必須使細胞表面受體寡聚以激活細胞內信號轉導途徑。一些GH家族成員(包括(但不限于)GH和EPO)與單一類型的受體結合并且使其形成同型二聚物。包括(但不限于)IL-2、IL4和IL-6的其它家族成員與一種以上類型的受體結合并且使這些受體形成異質二聚物或更高級聚集體(Davis等人，(1993)Science 2601805-1808；Paonessa等人，(1995)EMBO J.141942-1951；Mott和Campbell，Current Opinion in Structural Biology 5114-121(1995))。誘變研究已展示，如同GH一樣，這些其它細胞因子和生長因子含有多個受體結合位點(通常兩個)，并且依次與其同源受體結合(Mott和Campbell，Current Opinion in Structural Biology5114-121(1995)；Matthews等人，(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 939471-9476)。如同GH一樣，這些其它家族成員的主要受體結合位點主要存在于四個α螺旋和A-B環(huán)中。參與受體結合的螺旋束中的特定氨基酸在家族成員中有所不同。與GH超基因家族的成員相互作用的大多數細胞表面受體在結構上相關并且構成第二大的多基因家族。例如參見美國專利第6,608,183號，其是以引用的方式并入本發(fā)明中以描述GH超基因家族。
由GH超基因家族的多個成員的突變研究得到的一般結論是連接α螺旋的環(huán)通常趨向于不參與受體結合。具體來說，對于大多數(若非全部)家族成員中的受體結合來說，短B-C環(huán)似乎并非必要。為此，在GH超基因家族的成員中，B-C環(huán)視情況經如本發(fā)明中所述的非天然氨基酸取代。A-B環(huán)、C-D環(huán)(以及干擾素/GH超家族的類IL-10成員的D-E環(huán))也視情況經非天然氨基酸取代。最接近螺旋A并且遠離最后螺旋的氨基酸也趨向于不參與受體結合，并且也可為用于引入非天然氨基酸的位點。在一些實施例中，非天然氨基酸在包括(但不限于)A-B、B-C、C-D或D-E環(huán)的前1、2、3、4、5、6、7或7個以上氨基酸的環(huán)結構內的任何位置處進行取代。在一些實施例中，非天然氨基酸在A-B、B-C、C-D或D-E環(huán)的后1、2、3、4、5、6、7或7個以上氨基酸內進行取代。
GH家族的某些成員(包括(但不限于)EPO、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IFN、GM-CSF、TPO、IL-10、IL-12p35、IL-13、IL-15和β干擾素)含有N-鍵聯和/或O-鍵聯的糖。蛋白質中的糖基化位點幾乎全部存在于環(huán)區(qū)域中并且不存在于α螺旋束中。因為環(huán)區(qū)域通常不參與受體結合并且因為其為用于共價連接糖基團的位點，所以其可為將非天然氨基酸取代引入蛋白質中的適用位點。蛋白質中包含N-鍵聯糖基化位點以及O-鍵聯糖基化位點的氨基酸為非天然氨基酸取代的位點，因為這些氨基酸為表面暴露的。因此，天然蛋白質在這些位點處允許連接到蛋白質上的龐大糖基團，并且糖基化位點趨向于位于遠離受體結合位點處。
有可能在將來發(fā)現GH基因家族的其它成員?？赏ㄟ^預測蛋白質序列的計算機輔助的二級結構和三級結構分析并且通過設計用來鑒別與特定標靶結合的分子的選擇技術來鑒別GH超基因家族的新成員。GH超基因家族的成員通常具有四個或五個由非螺旋狀氨基酸(環(huán)區(qū)域)連接的兩性分子螺旋。在一些實施例中，蛋白質在其N末端含有疏水信號序列以促進從細胞中分泌。這些后來發(fā)現的GH超基因家族成員也包括在本發(fā)明中描述的方法和組合物中。
V.非天然氨基酸 本發(fā)明中描述的方法和組合物中所使用的非天然氨基酸具有以下四種性質中的至少一種(1)非天然氨基酸側鏈上的至少一個官能團具有至少一種與20種常見的遺傳性編碼氨基酸(即，丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸和纈氨酸)的化學反應性正交，或至少與包括非天然氨基酸的多肽中存在的天然存在氨基酸的化學反應性正交的特征和/或活性和/或反應性；(2)所引入的非天然氨基酸對20種常見的遺傳性編碼氨基酸實質上呈化學惰性；(3)非天然氨基酸可穩(wěn)定地并入多肽中，優(yōu)選地具有與天然存在氨基酸相當的穩(wěn)定性或在典型生理條件下具有穩(wěn)定性，且進一步優(yōu)選地，所述并入可通過活體內系統發(fā)生；以及(4)非天然氨基酸包括羰基、酮基、醛基、肼基、雜環(huán)(包括含氮雜環(huán))基團(包括吲哚基)或可通過與試劑反應而轉變?yōu)轸驶?、酮基、醛基、肼基、雜環(huán)(包括含氮雜環(huán))基團(包括吲哚基)的官能團，所述反應優(yōu)選地在不破壞包括非天然氨基酸的多肽的生物性質的條件下發(fā)生(當然，除非此生物性質的破壞為修飾/轉變的目的)，或優(yōu)選其中轉變可在水性條件下在介于約1與約6之間的pH值下發(fā)生，或優(yōu)選其中非天然氨基酸上的反應性位點為親電子位點。可用于本發(fā)明中描述的組合物和方法的滿足關于非天然氨基酸的所述四種性質的氨基酸的說明性非限制性實施例呈示于圖15-18中?？蓪⑷魏螖的康姆翘烊话被嵋攵嚯闹?。
應注意，雖然圖15、圖16和圖18呈示具有經取代的碳環(huán)芳基側鏈的氨基酸，但應了解，這些圖也揭示經取代的雜芳基側鏈。舉例來說，圖15的每一化合物都具有經取代的苯基側鏈；然而，在一些實施例中，苯基是經吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、噻吩基或呋喃基置換。因此，碳環(huán)芳基側鏈只是本發(fā)明中包括的多種芳香族基團的說明性實施例。
非天然氨基酸視情況也包括羰基或可轉變?yōu)轸驶慕洷Ｗo或經掩蔽基團、在經保護基團脫保護或經掩蔽基團去掩蔽后的羰基、肼基或可轉變?yōu)殡禄慕洷Ｗo或經掩蔽基團。
視情況用于本發(fā)明中描述的方法和組合物中的非天然氨基酸包括(但不限于)包含可光活化交聯劑的氨基酸、經自旋標記的氨基酸、熒光氨基酸、金屬結合氨基酸、含金屬的氨基酸、放射性氨基酸、具有新穎官能團的氨基酸、與其它分子共價或非共價相互作用的氨基酸、光籠化和/或可光致異構化氨基酸、包含生物素或生物素類似物的氨基酸、糖基化氨基酸(諸如經糖取代的絲氨酸)、其它經碳水化合物修飾的氨基酸、含酮基的氨基酸、包含聚乙二醇或其它聚醚的氨基酸、經重原子取代的氨基酸、可化學裂解和/或可光裂解的氨基酸、具有與天然氨基酸相比延長的側鏈的氨基酸(包括(但不限于)聚醚或長鏈烴，其包括(但不限于)大于約5個碳或大于約10個碳)、含經碳鍵聯的糖的氨基酸、氧化還原活性氨基酸、含氨基硫代酸的氨基酸，以及包含一個或一個以上毒性部分的氨基酸。
在一些實施例中，非天然氨基酸包含糖部分。這些氨基酸的實施例包括N-乙酰基-L-葡糖胺基-L-絲氨酸、N-乙酰基-L-半乳糖胺基-L-絲氨酸、N-乙酰基-L-葡糖胺基-L-蘇氨酸、N-乙?；?L-葡糖胺基-L-天冬酰胺和O-甘露糖胺基-L-絲氨酸。這些氨基酸的實施例也包括氨基酸與糖之間的天然存在N-鍵或O-鍵由自然界中通常不存在的共價鍵(包括(但不限于)烯烴、肟、硫醚、酰胺、雜環(huán)(包括含氮雜環(huán))、羰基等)代替的實施例。這些氨基酸的實施例也包括天然存在蛋白質中通常不存在的糖類，諸如2-脫氧-葡萄糖、2-脫氧半乳糖等。
通過將非天然氨基酸并入多肽中而并入這些多肽中的化學部分提供多種優(yōu)點和對多肽的操縱。舉例來說，獨特非天然氨基酸(包括(但不限于)具有二苯甲酮和芳基疊氮化物(包括但不限于苯基疊氮化物側鏈)的氨基酸)例如允許蛋白質的有效活體內和活體外光交聯。光反應性非天然氨基酸的實施例包括(但不限于)對疊氮基-苯丙氨酸和對苯甲?；?苯丙氨酸。具有光反應性非天然氨基酸的多肽隨后視情況通過光反應性基團的激發(fā)(提供瞬時控制)而任意交聯。在非限制性實施例中，非天然氨基酸的甲基經同位素標記取代(包括(但不限于)經甲基取代)，作為局部結構和動力學的探針(包括(但不限于)借助于核磁共振和振動光譜)。
A.非天然氨基酸的結構和合成肼基、類肼基、經掩蔽肼基以及經保護肼基 含有肼基的非天然氨基酸可與多種羰基和羰基等效基團反應以通過吲哚鍵聯形成接合物。因此，在本發(fā)明中描述的某些實施例中是具有包含肼基、類肼基(其具有與肼基類似的反應性并且在結構上與肼基類似)、經掩蔽肼基(其可容易地轉化為肼基)或經保護肼基(其在脫保護后具有與肼基類似的反應性)的側鏈的非天然氨基酸。這些氨基酸包括具有式(I)的結構的氨基酸
其中 A是可選的，并且當存在時為低碳亞烷基、經取代低碳亞烷基、低碳亞環(huán)烷基、經取代低碳亞環(huán)烷基、低碳亞烯基、經取代低碳亞烯基、亞炔基、經取代亞炔基、低碳亞雜烷基、經取代亞雜烷基、低碳亞雜環(huán)烷基、經取代低碳亞雜環(huán)烷基、亞芳基、經取代亞芳基、亞雜芳基、經取代亞雜芳基、亞烷芳基、經取代亞烷芳基、亞芳烷基或經取代亞芳烷基； B是可選的，并且當存在時為選自由以下各基團組成的群組的連接子低碳亞烷基、經取代低碳亞烷基、低碳亞烯基、經取代低碳亞烯基、低碳亞雜烷基、經取代低碳亞雜烷基、亞芳基、經取代亞芳基、亞雜芳基、經取代亞雜芳基、-O-、-O-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-S-、-S-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-S(O)k-(其中k為1、2或3)、-S(O)k(亞烷基或經取代亞烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、-C(O)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-N(R′)CO-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)C(NCN)N(R′)-、-N(R′)C(NNO2)N(R′)-、-N(R′)C(NCOOR′)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)2-N＝N-和-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-；并且R′各自獨立地為H、烷基或經取代烷基； J為
R為H、低碳亞烯基、經取代低碳亞烯基、亞炔基、經取代亞炔基、羰基或經取代羰基； R1為H、氨基保護基、樹脂、至少一個氨基酸、多肽或多核苷酸； R2為OH、酯保護基、樹脂、至少一個氨基酸、多肽或多核苷酸； R3與R4各自獨立地為H、鹵素、低碳烷基或經取代低碳烷基，或R3與R4合起來或兩個R3基團合起來視情況形成環(huán)烷基或雜環(huán)烷基； 或-A-B-J-R基團合起來形成包含肼基、經保護肼基或經掩蔽肼基的雙環(huán)或三環(huán)環(huán)烷基或雜環(huán)烷基； 應注意，如果結構J中出現

那么這表示J可在任何位置處與B和R連接。作為非限制性實施例，如果J是肼苯基衍生物，那么B和J視情況位于環(huán)周圍，如下所示
也應進一步注意，環(huán)視情況進一步視情況經取代。另外，應注意到，與肼基相鄰的至少一個取代基是氫。這些非天然氨基酸視情況呈鹽形式，或并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或多核苷酸中并視情況經翻譯后修飾。
在一個實施例中，A與B都是鍵，各R3為H并且R4為H。在另一個實施例中，R1與R2各自為至少一個氨基酸。在另一個實施例中，R1與R2各自為至少兩個氨基酸。在另一個實施例中，R1與R2各自為至少三個氨基酸。在另一個實施例中，R1與R2各自為至少四個氨基酸。在另一個實施例中，R1與R2各自為至少五個氨基酸。在另一個實施例中，R1與R2各自為至少六個氨基酸。
在某些實施例中，式(I)化合物在水溶液中在適度酸性條件下穩(wěn)定至少1個月。在某些實施例中，式(I)化合物在適度酸性條件下穩(wěn)定至少2周。在某些實施例中，式(I)化合物在適度酸性條件下穩(wěn)定至少5天。在某些實施例中，所述酸性條件是pH值為約2到約8。
另外，包括具有式(II)的結構的以下氨基酸
其中 A是可選的，并且當存在時為低碳亞烷基、經取代低碳亞烷基、低碳亞環(huán)烷基、經取代低碳亞環(huán)烷基、低碳亞烯基、經取代低碳亞烯基、亞炔基、經取代亞炔基、低碳亞雜烷基、經取代亞雜烷基、低碳亞雜環(huán)烷基、經取代低碳亞雜環(huán)烷基、亞芳基、經取代亞芳基、亞雜芳基、經取代亞雜芳基、亞烷芳基、經取代亞烷芳基、亞芳烷基或經取代亞芳烷基； B是可選的，并且當存在時為選自由以下各基團組成的群組的連接子低碳亞烷基、經取代低碳亞烷基、低碳亞烯基、經取代低碳亞烯基、低碳亞雜烷基、經取代低碳亞雜烷基、亞芳基、經取代亞芳基、亞雜芳基、經取代亞雜芳基、-O-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-S-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-S(O)k-(其中k為1、2或3)、-S(O)k(亞烷基或經取代亞烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、-C(O)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-NR′-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、＝N-O-(亞烷基或經取代亞烷基)、-N(R′)CO-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)2-N＝N-和-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-；并且R′各自獨立地為H、烷基或經取代烷基； R1為H、氨基保護基、樹脂、至少一個氨基酸、多肽或多核苷酸；并且 R2為OH、酯保護基、樹脂、至少一個氨基酸、多肽或多核苷酸； R3和R4是獨立地選自由氫組成的群組或選自胺保護基，其包括(但不限于)


并且 Ra是各自獨立地選自由H、鹵素、烷基、經取代烷基、CN、NO2、-N(R′)2、-C(O)R′、-C(O)N(R′)2、-OR′和-S(O)kR′(其中k為1、2或3)組成的群組，并且R′各自獨立地為H、烷基或經取代烷基。
這些非天然氨基酸視情況呈鹽形式，或并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或多核苷酸中并視情況經翻譯后修飾。
在一個實施例中，A與B都是鍵。在另一個實施例中，R1與R2各自為至少一個氨基酸。在另一個實施例中，R1與R2各自為至少兩個氨基酸。在另一個實施例中，R1與R2各自為至少三個氨基酸。在另一個實施例中，R1與R2各自為至少四個氨基酸。在另一個實施例中，R1與R2各自為至少五個氨基酸。在另一個實施例中，R1與R2各自為至少六個氨基酸。
另外，包括具有式(III)的結構的以下氨基酸
其中 B是可選的，并且當存在時為選自由以下各基團組成的群組的連接子低碳亞烷基、經取代低碳亞烷基、低碳亞烯基、經取代低碳亞烯基、低碳亞雜烷基、經取代低碳亞雜烷基、-亞芳基、經取代亞芳基、亞雜芳基、經取代亞雜芳基、-O-、-N(R′)-、-S-、-O-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-S-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-S(O)k-(其中k為1、2或3)、-S(O)k(亞烷基或經取代亞烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、-C(O)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-NR′-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-N(R′)CO-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)2-N＝N-和-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-；-S(O)kN(R′)-、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)2-N＝N-和-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-；并且R′各自獨立地為H、烷基或經取代烷基； R1為H、氨基保護基、樹脂、至少一個氨基酸、多肽或多核苷酸； R2為OH、酯保護基、樹脂、至少一個氨基酸、多肽或多核苷酸； R3和R4是獨立地選自由氫組成的群組或選自胺保護基，其包括(但不限于)


并且 Ra是各自獨立地選自由H、鹵素、烷基、經取代烷基、-N(R′)2、-C(O)R′、-C(O)N(R′)2、-OR′和-S(O)kR′(其中k為1、2或3)組成的群組，并且R′各自獨立地為H、烷基或經取代烷基；并且 n為0到8。
這些非天然氨基酸可呈鹽形式，或可并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或多核苷酸中并視情況經翻譯后修飾。
在另一個實施例中是具有以下結構的式(II)化合物
其中，n為0、1、2、3或4；m為0、1、2、3或4；條件是n+m為1、2、3、4或5；X1和X2獨立地為鍵、O或NH；并且y為0或1。
另外，包括以下氨基酸
其中這些化合物視情況氨基經保護且羧基經保護，或為其鹽，或可并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或多核苷酸中并視情況經翻譯后修飾。
另外，包括具有式(IV)的結構的以下氨基酸
其中 R1為H、氨基保護基、樹脂、至少一個氨基酸、多肽或多核苷酸； R2為OH、酯保護基、樹脂、至少一個氨基酸、多肽或多核苷酸； R3和R4是獨立地選自由氫組成的群組或選自胺保護基，其包括(但不限于)


并且 Ra是各自獨立地選自由H、鹵素、烷基、經取代烷基、CN、NO2、-N(R′)2、-C(O)R′、-C(O)N(R′)2、-OR′和-S(O)kR′(其中k為1、2或3)組成的群組，并且R′各自獨立地為H、烷基或經取代烷基。
這些非天然氨基酸視情況呈鹽形式，或并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或多核苷酸中并視情況經翻譯后修飾。
另外，包括以下氨基酸
其中這些化合物視情況氨基經保護、視情況羧基經保護、視情況氨基經保護且羧基經保護，或為其鹽，或視情況并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或多核苷酸中并視情況經翻譯后修飾。
B.非天然氨基酸的結構和合成羰基、類羰基、經掩蔽羰基和經保護羰基 具有親電子反應性基團的氨基酸可進行多種反應以通過各種化學反應(包括(但不限于)親核加成反應)鍵聯分子。這些親電子反應性基團包括羰基(包括酮基或醛基)、類羰基(其具有類似于羰基的反應性并且在結構上與羰基類似)、經掩蔽羰基(其可容易地轉化為羰基)，或經保護羰基(其在脫保護后具有與羰基類似的反應性)。這些氨基酸包括具有式(V)的結構的氨基酸
其中 A是可選的，并且當存在時為低碳亞烷基、經取代低碳亞烷基、低碳亞環(huán)烷基、經取代低碳亞環(huán)烷基、低碳亞烯基、經取代低碳亞烯基、亞炔基、低碳亞雜烷基、經取代亞雜烷基、低碳亞雜環(huán)烷基、經取代低碳亞雜環(huán)烷基、亞芳基、經取代亞芳基、亞雜芳基、經取代亞雜芳基、亞烷芳基、經取代亞烷芳基、亞芳烷基或經取代亞芳烷基； B是可選的，并且當存在時為選自由以下各基團組成的群組的連接子低碳亞烷基、經取代低碳亞烷基、低碳亞烯基、經取代低碳亞烯基、低碳亞雜烷基、經取代低碳亞雜烷基、亞芳基、經取代亞芳基、亞雜芳基、經取代亞雜芳基、-O-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-S-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-S(O)k(亞烷基或經取代亞烷基)-(其中k為1、2或3)、-C(O)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-C(S)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-NR′-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-CON(R′)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-CSN(R′)-(亞烷基或經取代亞烷基)-和-N(R′)CO-(亞烷基或經取代亞烷基)-，其中R′各自獨立地為H、烷基或經取代烷基； J為

R為H、烷基、經取代烷基、環(huán)烷基或經取代環(huán)烷基； R″各自獨立地為H、烷基、經取代烷基或保護基，或當存在一個以上R″基團時，兩個R″視情況形成雜環(huán)烷基； R1為H、氨基保護基、樹脂、至少一個氨基酸、多肽或多核苷酸；并且 R2為OH、酯保護基、樹脂、至少一個氨基酸、多肽或多核苷酸； R3與R4各自獨立地為H、鹵素、低碳烷基或經取代低碳烷基，或R3與R4或兩個R3基團視情況形成環(huán)烷基或雜環(huán)烷基； 或-A-B-J-R基團合起來形成包含至少一個羰基(包括二羰基)、經保護羰基(包括經保護二羰基)或經掩蔽羰基(包括經掩蔽二羰基)的雙環(huán)或三環(huán)環(huán)烷基或雜環(huán)烷基； 或-J-R基團合起來形成包含至少一個羰基(包括二羰基)、經保護羰基(包括經保護二羰基)或經掩蔽羰基(包括經掩蔽二羰基)的單環(huán)或雙環(huán)環(huán)烷基或雜環(huán)烷基； 條件是當A為亞苯基并且R3各自為H時，B存在；并且當A為-(CH2)4-并且R3各自為H時，B不為-NHC(O)(CH2CH2)-；并且當A與B都不存在并且R3各自為H時，R不為甲基。
這些非天然氨基酸視情況呈鹽形式，或并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或多核苷酸中并視情況經翻譯后修飾。
在某些實施例中，式(V)化合物在水溶液中在適度酸性條件下穩(wěn)定至少1個月。在某些實施例中，式(V)化合物在適度酸性條件下穩(wěn)定至少2周。在某些實施例中，式(V)化合物在適度酸性條件下穩(wěn)定至少5天。在某些實施例中，所述酸性條件是pH值為約2到約8。
在式(V)化合物的某些實施例中，B為低碳亞烷基、經取代低碳亞烷基、-O-(亞烷基或經取代亞烷基)-、亞芳基、經取代亞芳基、亞雜芳基、經取代亞雜芳基、-C(O)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-CON(R′)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-S(亞烷基或經取代亞烷基)-、-S(O)(亞烷基或經取代亞烷基)-或-S(O)2(亞烷基或經取代亞烷基)-。在式(I)化合物的某些實施例中，B為-O(CH2)-、-CH＝N-、-CH＝N-NH-、-NHCH2-、-NHCO-、-C(O)-、-C(O)-(CH2)-、-CONH-(CH2)-、-SCH2-、-S(＝O)CH2-或-S(O)2CH2-。在式(V)化合物的某些實施例中，R為C1-6烷基或環(huán)烷基。在式(V)化合物的某些實施例中，R為-CH3、-CH(CH3)2或環(huán)丙基。在式(V)化合物的某些實施例中，R1為H、叔丁氧羰基(Boc)、9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)、N-乙?；⑺姆阴；?TFA)或芐氧羰基(Cbz)。在式(V)化合物的某些實施例中，R1為樹脂、至少一個氨基酸、多肽或多核苷酸。在式(V)化合物的某些實施例中，R2為OH、O-甲基、O-乙基或O-叔丁基。在式(V)化合物的某些實施例中，R2為樹脂、至少一個氨基酸、多肽或多核苷酸。在式(V)化合物的某些實施例中，R2為多核苷酸。在式(V)化合物的某些實施例中，R2為核糖核酸(RNA)。在式(V)化合物的某些實施例中，R2為tRNA。在式(V)化合物的某些實施例中，tRNA特異性識別選擇密碼子。在式(V)化合物的某些實施例中，選擇密碼子是選自由琥珀密碼子、赭石密碼子、蛋白石密碼子、獨特密碼子、稀有密碼子、非天然密碼子、五堿基密碼子和四堿基密碼子組成的群組。在式(V)化合物的某些實施例中，R2為抑制tRNA。
在式(V)化合物的某些實施例中，

是選自由以下各基團組成的群組 (i)A為經取代低碳亞烷基、C4亞芳基、經取代亞芳基、亞雜芳基、經取代亞雜芳基、亞烷芳基、經取代亞烷芳基、亞芳烷基或經取代亞芳烷基； B是可選的，并且當存在時為選自由以下各基團組成的群組的二價連接子低碳亞烷基、經取代低碳亞烷基、低碳亞烯基、經取代低碳亞烯基、亞芳基、經取代亞芳基、亞雜芳基、經取代亞雜芳基、-O-、-O-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、-C(O)-、-C(O)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-C(S)-、-N(R′)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-CSN(R′)-、-N(R′)CO-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-N(R′)C(O)O-、-N(R′)C(S)-、-S(O)N(R′)、-S(O)2N(R′)、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)N(R′)-、-N(R′)S(O)2N(R′)、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)2-N＝N-、-N(R′)C(NCN)N(R′)-、-N(R′)C(NNO2)N(R′)-、-N(R′)C(NCOOR′)N(R′)-和-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-； (ii)A是可選的，并且當存在時為經取代低碳亞烷基、C4亞芳基、經取代亞芳基、亞雜芳基、經取代亞雜芳基、亞烷芳基、經取代亞烷芳基、亞芳烷基或經取代亞芳烷基； B為選自由以下各基團組成的群組的二價連接子低碳亞烷基、經取代低碳亞烷基、低碳亞烯基、經取代低碳亞烯基、亞芳基、經取代亞芳基、亞雜芳基、經取代亞雜芳基、-O-、-O-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、-C(O)-、-C(O)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-C(S)-、-N(R′)、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-CSN(R′)-、-N(R′)CO-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-N(R′)C(O)O-、-N(R′)C(S)-、-S(O)N(R′)、-S(O)2N(R′)、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)N(R′)-、-N(R′)S(O)2N(R′)-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)2-N＝N-、-N(R′)C(NCN)N(R′)-、-N(R′)C(NNO2)N(R′)-、-N(R′)C(NCOOR′)N(R′)-和-C(R′)2-N(R-)-N(R′)-； (iii)A為低碳亞烷基； B是可選的，并且當存在時為選自由以下各基團組成的群組的二價連接子低碳亞烷基、經取代低碳亞烷基、低碳亞烯基、經取代低碳亞烯基、亞芳基、經取代亞芳基、亞雜芳基、經取代亞雜芳基、-O-、-O-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-C(O)-(亞烷基或經取代亞烷基)-和-CON(R′)-(亞烷基或經取代亞烷基)-，和 (iv)A為亞苯基； B為選自由以下各基團組成的群組的二價連接子低碳亞烷基、經取代低碳亞烷基、低碳亞烯基、經取代低碳亞烯基、亞芳基、經取代亞芳基、亞雜芳基、經取代亞雜芳基、-O-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-C(O)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-CON(R′)-(亞烷基或經取代亞烷基)-和-N(R′)CO-(亞烷基或經取代亞烷基)-； J為

R′各自獨立地為H、烷基或經取代烷基； R″各自獨立地為H、烷基、經取代烷基或保護基，或當存在一個以上R″基團時，兩個R″視情況形成雜環(huán)烷基； R1是可選的，并且當存在時為H、氨基保護基、樹脂、至少一個氨基酸、多肽或多核苷酸；并且 R2是可選的，并且當存在時為OH、酯保護基、樹脂、至少一個氨基酸、多肽或多核苷酸；并且 R3與R4各自獨立地為H、鹵素、低碳烷基或經取代低碳烷基； R′為H、烷基或經取代烷基； R為H、烷基、經取代烷基、環(huán)烷基或經取代環(huán)烷基； 或-A-B-J-R基團合起來形成包含至少一個羰基的雙環(huán)或三環(huán)環(huán)烷基或雜環(huán)烷基。
另外，包括具有式(VI)的結構的氨基酸
其中 A是可選的，并且當存在時為低碳亞烷基、經取代低碳亞烷基、低碳亞環(huán)烷基、經取代低碳亞環(huán)烷基、低碳亞烯基、經取代低碳亞烯基、亞炔基、低碳亞雜烷基、經取代亞雜烷基、低碳亞雜環(huán)烷基、經取代低碳亞雜環(huán)烷基、亞芳基、經取代亞芳基、亞雜芳基、經取代亞雜芳基、亞烷芳基、經取代亞烷芳基、亞芳烷基或經取代亞芳烷基； B是可選的，并且當存在時為選自由以下各基團組成的群組的連接子低碳亞烷基、經取代低碳亞烷基、低碳亞烯基、經取代低碳亞烯基、低碳亞雜烷基、經取代低碳亞雜烷基、亞芳基、經取代亞芳基、亞雜芳基、經取代亞雜芳基、-O-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-S-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-S(O)k-(其中k為1、2或3)、-S(O)k(亞烷基或經取代亞烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、-C(O)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-NR′-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-N(R′)CO-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)NR′-(亞烷基或經取代亞烷基)、-N(R′)C(S)NR′-(亞烷基或經取代亞烷基)、-N(R′)S(O)kN R′-(亞烷基或經取代亞烷基)、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)、-C(R′)2-N＝N-、-N(R′)C(NCN)NR′-(亞烷基或經取代亞烷基)、-N(R′)C(NNO2)NR′-(亞烷基或經取代亞烷基)、-N(R′)C(NCOOR′)NR′-(亞烷基或經取代亞烷基)和-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自獨立地為H、烷基或經取代烷基； R為H、烷基、經取代烷基、環(huán)烷基或經取代環(huán)烷基； R1為H、氨基保護基、樹脂、至少一個氨基酸、多肽或多核苷酸；并且 R2為OH、酯保護基、樹脂、至少一個氨基酸、多肽或多核苷酸； 條件是當A為亞苯基時，B存在；并且當A為-(CH2)4-時，B不為-NHC(O)(CH2CH2)-；并且當A與B都不存在時，R不為甲基。這些非天然氨基酸視情況呈鹽形式，或并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或多核苷酸中并視情況經翻譯后修飾。
另外，包括具有式(VII)的結構的氨基酸
其中 B為選自由以下各基團組成的群組的連接子低碳亞烷基、經取代低碳亞烷基、低碳亞烯基、經取代低碳亞烯基、低碳亞雜烷基、經取代低碳亞雜烷基、亞芳基、經取代亞芳基、亞雜芳基、經取代亞雜芳基、-O-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-S-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-S(O)k-(其中k為1、2或3)、-S(O)k(亞烷基或經取代亞烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、-C(O)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-NR′-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-CON(R′)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-CSN(R′)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-N(R′)CO-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-S(O)kN(R′)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-N(R′)C(O)NR′-(亞烷基或經取代亞烷基)、-N(R′)C(S)NR′-(亞烷基或經取代亞烷基)、-N(R′)S(O)kNR′-(亞烷基或經取代亞烷基)、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)2-N＝N-、-N(R′)C(NCN)NR′-(亞烷基或經取代亞烷基)、-N(R′)C(NNO2)NR′-(亞烷基或經取代亞烷基)、-N(R′)C(NCOOR′)NR′-(亞烷基或經取代亞烷基)和-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自獨立地為H、烷基或經取代烷基； R為H、烷基、經取代烷基、環(huán)烷基或經取代環(huán)烷基； R1為H、氨基保護基、樹脂、至少一個氨基酸、多肽或多核苷酸；并且 R2為OH、酯保護基、樹脂、至少一個氨基酸、多肽或多核苷酸； Ra是各自獨立地選自由H、鹵素、烷基、經取代烷基、NO2、CN、-N(R′)2、-C(O)R′、-C(O)N(R′)2、-OR′和-S(O)kR′(其中k為1、2或3)組成的群組，其中R′各自獨立地為H、烷基或經取代烷基；或至少兩個Ra合起來形成雜環(huán)、雜芳基或芳基。
這些非天然氨基酸視情況呈鹽形式，或并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或多核苷酸中并視情況經翻譯后修飾。
另外，包括以下氨基酸
這些非天然氨基酸為視情況氨基經保護的基團、羧基經保護和/或呈鹽形式，或并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或多核苷酸中并視情況經翻譯后修飾。
另外，包括具有式(VIII)的結構的以下氨基酸
其中 B是可選的，并且當存在時為選自由以下各基團組成的群組的連接子低碳亞烷基、經取代低碳亞烷基、低碳亞烯基、經取代低碳亞烯基、低碳亞雜烷基、經取代低碳亞雜烷基、亞芳基、經取代亞芳基、亞雜芳基、經取代亞雜芳基、-O-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-S-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-S(O)k-(其中k為1、2或3)、-S(O)k(亞烷基或經取代亞烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2、-OS(O)2-、-C(O)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-NR′-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-CON(R′)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-CSN(R′)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-N(R′)CO-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)NR′-(亞烷基或經取代亞烷基)、-N(R′)C(S)NR′-(亞烷基或經取代亞烷基)、-N(R′)S(O)kNR′-(亞烷基或經取代亞烷基)、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)2-N＝N-、-N(R′)C(NCN)NR′-(亞烷基或經取代亞烷基)、-N(R′)C(NNO2)NR′-(亞烷基或經取代亞烷基)、-N(R′)C(NCOOR′)NR′-(亞烷基或經取代亞烷基)和-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自獨立地為H、烷基或經取代烷基； R為H、烷基、經取代烷基、環(huán)烷基或經取代環(huán)烷基； R1為H、氨基保護基、樹脂、至少一個氨基酸、多肽或多核苷酸；并且 R2為OH、酯保護基、樹脂、至少一個氨基酸、多肽或多核苷酸； Ra是各自獨立地選自由H、鹵素、烷基、經取代烷基、CN、NO2、-N(R′)2、-C(O)R′、-C(O)N(R′)2、-OR′和-S(O)k R′(其中k為1、2或3)組成的群組，其中R′各自獨立地為H、烷基或經取代烷基；并且n為0到8； 條件是當A為-(CH2)4-時，B不為-NHC(O)(CH2CH2)-。這些非天然氨基酸視情況呈鹽形式，或并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或多核苷酸中并視情況經翻譯后修飾。
另外，包括以下氨基酸


其中這些化合物視情況氨基經保護、視情況羧基經保護、視情況氨基經保護且羧基經保護，或為其鹽，或并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或多核苷酸中并視情況經翻譯后修飾。
另外，包括具有式(IX)的結構的以下氨基酸
其中 A是可選的，并且當存在時為低碳亞烷基、經取代低碳亞烷基、低碳亞環(huán)烷基、經取代低碳亞環(huán)烷基、低碳亞烯基、經取代低碳亞烯基、亞炔基、低碳亞雜烷基、經取代亞雜烷基、低碳亞雜環(huán)烷基、經取代低碳亞雜環(huán)烷基、亞芳基、經取代亞芳基、亞雜芳基、經取代亞雜芳基、亞烷芳基、經取代亞烷芳基、亞芳烷基或經取代亞芳烷基； B是可選的，并且當存在時為選自由以下各基團組成的群組的連接子低碳亞烷基、經取代低碳亞烷基、低碳亞烯基、經取代低碳亞烯基、低碳亞雜烷基、經取代低碳亞雜烷基、亞芳基、經取代亞芳基、亞雜芳基、經取代亞雜芳基、-O-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-S-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-S(O)k-(其中k為1、2或3)、-S(O)k(亞烷基或經取代亞烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、-C(O)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-NR′-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-CON(R′)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-CSN(R′)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-N(R′)CO-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)NR′-(亞烷基或經取代亞烷基)、-N(R′)C(S)NR′-(亞烷基或經取代亞烷基)、-N(R′)S(O)kNR′-(亞烷基或經取代亞烷基)、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)2-N＝N-、-N(R′)C(NCN)NR′-(亞烷基或經取代亞烷基)、-N(R′)C(NNO2)NR′-(亞烷基或經取代亞烷基)、-N(R′)C(NCOOR′)NR′-(亞烷基或經取代亞烷基)和-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自獨立地為H、烷基或經取代烷基； R1為H、氨基保護基、樹脂、至少一個氨基酸、多肽或多核苷酸； R2為OH、酯保護基、樹脂、至少一個氨基酸、多肽或多核苷酸；并且 Y和Z是獨立地選自由-OH、經氧取代的烷基、-SH或經硫取代的烷基組成的群組，并且Y和Z合起來可形成環(huán)烷基環(huán)。
這些非天然氨基酸視情況呈鹽形式，或并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或多核苷酸中并視情況經翻譯后修飾。
另外，包括具有式(X)的結構的以下氨基酸
其中 B是可選的，并且當存在時為選自由以下各基團組成的群組的連接子低碳亞烷基、經取代低碳亞烷基、低碳亞烯基、經取代低碳亞烯基、低碳亞雜烷基、經取代低碳亞雜烷基、亞芳基、經取代亞芳基、亞雜芳基、經取代亞雜芳基、-O-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-S-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-S(O)k-(其中k為1、2或3)、-S(O)k(亞烷基或經取代亞烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2、-OS(O)2-、-C(O)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-N R′-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-CON(R′)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-CSN(R′)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-N(R′)CO-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)NR′-(亞烷基或經取代亞烷基)、-N(R′)C(S)NR′-(亞烷基或經取代亞烷基)、-N(R′)S(O)kNR′-(亞烷基或經取代亞烷基)、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)2-N＝N-、-N(R′)C(NCN)NR′-(亞烷基或經取代亞烷基)、-N(R′)C(NNO2)NR′-(亞烷基或經取代亞烷基)、-N(R′)C(NCOOR′)NR′-(亞烷基或經取代亞烷基)和-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自獨立地為H、烷基或經取代烷基； R1為H、氨基保護基、樹脂、至少一個氨基酸、多肽或多核苷酸； R2為OH、酯保護基、樹脂、至少一個氨基酸、多肽或多核苷酸； Ra是各自獨立地選自由H、鹵素、烷基、經取代烷基、CN、NO2、-N(R′)2、-C(O)R′、-C(O)N(R′)2、-OR′和-S(O)kR′(其中k為1、2或3)組成的群組，其中R′各自獨立地為H、烷基或經取代烷基；或至少兩個Ra合起來形成雜環(huán)、雜芳基或芳基；并且 Y和Z是獨立地選自由-OH、經氧取代的烷基、-SH或經硫取代的烷基組成的群組，并且Y和Z合起來可形成環(huán)烷基環(huán)。
這些非天然氨基酸視情況呈鹽形式，或并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或多核苷酸中并視情況經翻譯后修飾。
另外，包括以下氨基酸

其中這些化合物視情況氨基經保護、視情況羧基經保護、視情況氨基經保護且羧基經保護，或為其鹽，或并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或多核苷酸中并視情況經翻譯后修飾。
另外，包括具有式(XI)的結構的以下氨基酸
B是可選的，并且當存在時為選自由以下各基團組成的群組的連接子低碳亞烷基、經取代低碳亞烷基、低碳亞烯基、經取代低碳亞烯基、低碳亞雜烷基、經取代低碳亞雜烷基、-亞芳基、經取代亞芳基、亞雜芳基、經取代亞雜芳基、-O-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-S-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-S(O)k-(其中k為1、2或3)、-S(O)k(亞烷基或經取代亞烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2、-C(O)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-NR′-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-CON(R′)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-CSN(R′)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-N(R′)CO-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-S(O)kN(R′)、-N(R′)C(O)NR′-(亞烷基或經取代亞烷基)、-N(R′)C(S)NR′-(亞烷基或經取代亞烷基)、-N(R′)S(O)kNR′-(亞烷基或經取代亞烷基)、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)2-N＝N-、-N(R′)C(NCN)NR′-(亞烷基或經取代亞烷基)、-N(R′)C(NNO2)NR′-(亞烷基或經取代亞烷基)、-N(R′)C(NCOOR′)NR′-(亞烷基或經取代亞烷基)和-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自獨立地為H、烷基或經取代烷基； R為H、烷基、經取代烷基、環(huán)烷基或經取代環(huán)烷基； R1為H、氨基保護基、樹脂、至少一個氨基酸、多肽或多核苷酸； R2為OH、酯保護基、樹脂、至少一個氨基酸、多肽或多核苷酸； Ra是各自獨立地選自由H、鹵素、烷基、經取代烷基、CN、NO2、-N(R′)2、-C(O)R′、-C(O)N(R′)2、-OR′和-S(O)kR′(其中k為1、2或3)組成的群組，其中R′各自獨立地為H、烷基或經取代烷基；或至少兩個Ra合起來形成雜環(huán)、雜芳基或芳基；并且 Y獨立地選自由OR″、NR″R″、NC(O)R″組成的群組，其中R″各自獨立地為H、烷基、經取代烷基。
這些非天然氨基酸視情況呈鹽形式，或并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或多核苷酸中并視情況經翻譯后修飾。
另外，包括以下氨基酸
其中這些化合物視情況氨基經保護、視情況羧基經保護、視情況氨基經保護且羧基經保護，或為其鹽，或并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或多核苷酸中并視情況經翻譯后修飾。
另外，包括具有式(XII)的結構的以下氨基酸
R1為H、氨基保護基、樹脂、至少一個氨基酸、多肽或多核苷酸； R2為OH、酯保護基、樹脂、至少一個氨基酸、多肽或多核苷酸； Ra是各自獨立地選自由H、鹵素、烷基、經取代烷基、CN、NO2、-N(R′)2、-C(O)R′、-C(O)N(R′)2、-OR′和-S(O)kR′(其中k為1、2或3)組成的群組，其中R′各自獨立地為H、烷基或經取代烷基；或至少兩個Ra合起來形成雜環(huán)、雜芳基或芳基； R3和R4獨立地為H、鹵素、CN、NO2、烷基、經取代烷基、N(R′)2、C(O)R′、-C(O)N(R′)2、-OR′和-S(O)kR′(其中k為1、2或3)，其中R′各自獨立地為H、烷基或經取代烷基； X為C、N、O、S；條件是當X為O或S時，R4不可為H、鹵素、CN、NO2、烷基、經取代烷基、N(R′)2、C(O)R′、-C(O)N(R′)2、-OR′和-S(O)kR′；其中k為1、2或3，并且n為0、1或2。
另外，包括以下氨基酸
其中這些化合物視情況氨基經保護、視情況羧基經保護、視情況氨基經保護且羧基經保護，或為其鹽，或并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或多核苷酸中并視情況經翻譯后修飾。
另外，包括具有式(XIII)的結構的以下氨基酸
其中 B是可選的，并且當存在時為選自由以下各基團組成的群組的連接子低碳亞烷基、經取代低碳亞烷基、低碳亞烯基、經取代低碳亞烯基、低碳亞雜烷基、經取代低碳亞雜烷基、-亞芳基、經取代亞芳基、亞雜芳基、經取代亞雜芳基、-O-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-S-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-S(O)k-(其中k為1、2或3)、-S(O)k(亞烷基或經取代亞烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、-C(O)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-NR′-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-CON(R′)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-CSN(R′)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-N(R′)CO-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)NR′-(亞烷基或經取代亞烷基)、-N(R′)C(S)NR′-(亞烷基或經取代亞烷基)、-N(R′)S(O)kNR′-(亞烷基或經取代亞烷基)、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)2-N＝N-、-N(R′)C(NCN)NR′-(亞烷基或經取代亞烷基)、-N(R′)C(NNO2)NR′-(亞烷基或經取代亞烷基)、-N(R′)C(NCOOR′)NR′-(亞烷基或經取代亞烷基)和-C(R′)2-NN(R′)-N(R′)-，其中R′各自獨立地為H、烷基或經取代烷基； R1為H、氨基保護基、樹脂、至少一個氨基酸、多肽或多核苷酸； R2為OH、酯保護基、樹脂、至少一個氨基酸、多肽或多核苷酸； Ra是各自獨立地選自由H、鹵素、烷基、經取代烷基、-N(R′)2、-C(O)R′、-C(O)N(R′)2、-OR′和-S(O)kR′(其中k為1、2或3)組成的群組，其中R′各自獨立地為H、烷基或經取代烷基；并且n為0到8，并且 Y和Z是獨立地選自由-OH、經氧取代的烷基、-SH或經硫取代的烷基組成的群組，并且Y和Z合起來可形成環(huán)烷基環(huán)。
這些非天然氨基酸視情況呈鹽形式，或并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或多核苷酸中并視情況經翻譯后修飾。
另外，包括以下氨基酸
其中這些化合物視情況氨基經保護、視情況羧基經保護、視情況氨基經保護且羧基經保護，或為其鹽，或并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或多核苷酸中并視情況經翻譯后修飾。
另外，包括具有式(XIV)的結構的以下氨基酸
其中 B是可選的，并且當存在時為選自由以下各基團組成的群組的連接子低碳亞烷基、經取代低碳亞烷基、低碳亞烯基、經取代低碳亞烯基、低碳亞雜烷基、經取代低碳亞雜烷基、-亞芳基、經取代亞芳基、亞雜芳基、經取代亞雜芳基、-O-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-S-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-S(O)k-(其中k為1、2或3)、-S(O)k(亞烷基或經取代亞烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2、-C(O)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-NR′-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-CON(R′)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-CSN(R′)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-N(R′)CO-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N R′-(亞烷基或經取代亞烷基)、-N(R′)C(S)NR′-(亞烷基或經取代亞烷基)、-N(R′)S(O)kNR′-(亞烷基或經取代亞烷基)、-N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-、-N(R′)C(NGN)NR′-(亞烷基或經取代亞烷基)、-N(R′)′C(NNO2)NR′-(亞烷基或經取代亞烷基)、-N(R′)C(NCOOR′)NR′-(亞烷基或經取代亞烷基)和-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自獨立地為H、烷基或經取代烷基； R為H、烷基、經取代烷基、環(huán)烷基或經取代環(huán)烷基； R1為H、氨基保護基、樹脂、至少一個氨基酸、多肽或多核苷酸； R2為OH、酯保護基、樹脂、至少一個氨基酸、多肽或多核苷酸； Ra是各自獨立地選自由H、鹵素、烷基、經取代烷基、-N(R′)2、-C(O)R′、-C(O)N(R′)2、-OR′和-S(O)kR′(其中k為1、2或3)組成的群組，其中R′各自獨立地為H、烷基或經取代烷基；并且n為0到8；并且 Y獨立地選自由OR″、NR″R″、NC(O)R″組成的群組，其中R″各自獨立地為H、烷基、經取代烷基。
這些非天然氨基酸視情況呈鹽形式，或并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或多核苷酸中并視情況經翻譯后修飾。
另外，包括以下氨基酸
其中這些化合物視情況氨基經保護、視情況羧基經保護、視情況氨基經保護且羧基經保護，或為其鹽，或并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或多核苷酸中并視情況經翻譯后修飾。
C.含有吲哚基官能團的非天然氨基酸 通過含有肼的非天然氨基酸與含有羰基的試劑之間的反應或含有羰基的非天然氨基酸與含有肼基的試劑之間的反應來制備含有吲哚基團的非天然氨基酸。此反應被稱作費歇爾吲哚合成(Fisher indole synthesis)。此反應通常是在強酸和/或金屬離子加速劑存在下在極苛刻條件下進行，或在有機溶劑中在回流下進行。圖2描述此反應的機理，其包括在芳基肼與羰基化合物之間形成芳基腙中間物，接著進行[3，3]σ移位重排(sigmarropic rearrangement)以在消除氨后形成吲哚產物。
在一個實施例中，羰基與芳基肼之間的反應是在室溫下在水性緩沖液中進行。在另一個實施例中，羰基與芳基肼之間的反應是在約1到約6以及約2到約4的pH值下進行。另外，例如通過進行腙中間物形成和重排步驟來加速反應以在不同pH值下形成吲哚。在一個實施例中，腙中間物的形成是在pH 5下實現。在另一個實施例中，重排步驟是在pH 1下進行。圖3-6和圖8-11描述pH值對費歇爾吲哚合成的影響。
在某些實施例中，使用金屬離子來加速吲哚產物的形成速率。圖12闡明對吲哚產物的形成速率具有加速作用的金屬離子的非限制性實施例。在另一個實施例中，反應環(huán)境中有機溶劑的量對吲哚產物的形成速率具有影響。圖14描述溶劑對吲哚產物的形成速率的影響。
此反應中所用的試劑視情況進一步與所需官能團鍵聯。在一些實施例中，將非天然氨基酸并入多肽中，在與適當溶劑反應后，在多肽與所關注的分子之間形成接合物。
所述氨基酸包括具有式(XV)的結構的氨基酸
其中 A是可選的，并且當存在時為低碳亞烷基、經取代低碳亞烷基、低碳亞環(huán)烷基、經取代低碳亞環(huán)烷基、低碳亞烯基、經取代低碳亞烯基、亞炔基、經取代亞炔基、低碳亞雜烷基、經取代亞雜烷基、低碳亞雜環(huán)烷基、經取代低碳亞雜環(huán)烷基、亞芳基、經取代亞芳基、亞雜芳基、經取代亞雜芳基、亞烷芳基、經取代亞烷芳基、亞芳烷基或經取代亞芳烷基； B是可選的，并且當存在時為選自由以下各基團組成的群組的連接子低碳亞烷基、經取代低碳亞烷基、低碳亞烯基、經取代低碳亞烯基、低碳亞雜烷基、經取代低碳亞雜烷基、-亞芳基、經取代亞芳基、亞雜芳基、經取代亞雜芳基、-O-、-O-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-S-、-S-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-S(O)k-(其中k為1、2或3)、-S(O)k(亞烷基或經取代亞烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2、-C(O)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-N(R′)CO-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)C(NCN)N(R′)-、-N(R′)C(NNO2)N(R′)-、-N(R′)C(NCOOR′)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)2-N＝N-和-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，并且R′各自獨立地為H、烷基或經取代烷基； J為
R1為H、氨基保護基、樹脂、至少一個氨基酸、多肽或多核苷酸；并且 R2為OH、酯保護基、樹脂、至少一個氨基酸、多肽或多核苷酸； R3與R4各自獨立地為H、鹵素、低碳烷基或經取代低碳烷基，或R3與R4或兩個R3基團視情況形成環(huán)烷基或雜環(huán)烷基； R5各自獨立地為H、烷基、經取代烷基、烯基、經取代烯基、炔基、經取代炔基、烷氧基、經取代烷氧基、烷基烷氧基、經取代烷基烷氧基、聚氧化烯、經取代聚氧化烯、芳基、經取代芳基、雜芳基、經取代雜芳基、烷芳基、經取代烷芳基、芳烷基、經取代芳烷基、-(亞烷基或經取代亞烷基)-ON(R″)2、CN、NO2、-(亞烷基或經取代亞烷基)-C(O)SR″、-(亞烷基或經取代亞烷基)-S-S-(芳基或經取代芳基)、-C(O)R″、-C(O)2R″或-C(O)N(R″)2，其中R″各自獨立地為氫、烷基、經取代烷基、烯基、經取代烯基、烷氧基、經取代烷氧基、芳基、經取代芳基、雜芳基、烷芳基、經取代烷芳基、芳烷基、經取代芳烷基、L-Y，或當存在一個以上R″基團時，兩個R″視情況形成雜環(huán)烷基； 當存在一個以上R5基團時，兩個R5視情況形成雜環(huán)烷基或芳香族雜環(huán)烷基； n為0、1、2或3，并且m為0、1、2或3，條件是n或m中的至少一個不為0； 其中，具有相締合Ra基團的結構1、2、3和4中的各環(huán)可含有0、1或2個Ra基團，并且Ra各自獨立地選自由H、鹵素、烷基、經取代烷基、-N(R″)2、-C(O)R″、-C(O)N(R″)2、-OR″和-S(O)kR″組成的群組，其中R″各自獨立地為H、烷基或經取代烷基；或當存在一個以上Ra基團時，兩個Ra視情況形成芳基、環(huán)烷基或雜環(huán)烷基； Y是選自標記；染料；聚合物；水溶性聚合物；聚乙二醇的衍生物；光交聯劑；細胞毒性化合物；藥物；親和性標記；光親和性標記；反應性化合物；樹脂；第二蛋白質或多肽或多肽類似物；抗體或抗體片段；金屬螯合劑；輔因子；脂肪酸；碳水化合物；多核苷酸；DNA；RNA；反義多核苷酸；糖類、水溶性樹枝狀聚合物、環(huán)糊精、生物材料；納米粒子；自旋標記；熒光團；含金屬的部分；放射性部分；新穎官能團；與其它分子共價或非共價相互作用的基團；光籠化部分；光化輻射可激發(fā)的部分；配體；可光致異構化部分；生物素；生物素類似物；結合有重原子的部分；可化學裂解的基團；可光裂解的基團；延長的側鏈；碳鍵聯的糖；氧化還原活性劑；氨基硫代酸；毒性部分；經同位素標記的部分；生物物理探針；磷光基團；化學發(fā)光基團；電子致密基團；磁性基團；插入基團；發(fā)色團；能量轉移劑；生物活性劑(在這種情況下，生物活性劑可包括具有治療活性的藥劑，并且非天然氨基酸多肽或經修飾的非天然氨基酸可與附屬治療劑一起充當共治療劑或充當向生物體內的所需位點傳遞治療劑的工具)；可檢測標記；小分子；抑制性核糖核酸；放射性核苷酸；中子俘獲劑；生物素的衍生物；量子點；納米傳遞素；放射性傳遞素；抗體酶、活化復合激活劑、病毒、佐劑、糖苷配基、過敏原、血管抑素、抗激素、抗氧化劑、適體、向導RNA、皂角苷、穿梭載體、大分子、擬抗原決定基、受體、反膠束和其任何組合； L是可選的，并且當存在時為選自由以下各基團組成的群組的連接子亞烷基、經取代亞烷基、亞烯基、經取代亞烯基、-O-、-O-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-S-、-S-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-S(O)k-、-S(O)k(亞烷基或經取代亞烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-N(R′)CO-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-N(R′)C(O)O-、-(亞烷基或經取代亞烷基)-O-N＝CR′-、-(亞烷基或經取代亞烷基)-C(O)NR′-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-(亞烷基或經取代亞烷基)-S(O)k-(亞烷基或經取代亞烷基)-S-、-(亞烷基或經取代亞烷基)-S-S-、-S(O)kN(R′)、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、-N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-和-C(R′)2N(R′)-N(R′)-，其中k為1、2或3并且R′各自獨立地為H、烷基或經取代烷基； 或-A-B-J基團合起來形成包含吲哚部分的雙環(huán)或三環(huán)環(huán)烷基或雜環(huán)烷基。
在一個實施例中，Y是選自水溶性聚合物；聚氧化烯；聚乙二醇；聚乙二醇的衍生物；光交聯劑；至少一個氨基酸；至少一個糖基；至少一個核苷酸；至少一個核苷；配體；生物素；生物素類似物；可檢測標記；和其任何組合。
在另一個實施例中是具有化合物1-4的結構的化合物
其中 A是可選的，并且當存在時為低碳亞烷基、經取代低碳亞烷基、低碳亞環(huán)烷基、經取代低碳亞環(huán)烷基、低碳亞烯基、經取代低碳亞烯基、亞炔基、經取代亞炔基、低碳亞雜烷基、經取代亞雜烷基、低碳亞雜環(huán)烷基、經取代低碳亞雜環(huán)烷基、亞芳基、經取代亞芳基、亞雜芳基、經取代亞雜芳基、亞烷芳基、經取代亞烷芳基、亞芳烷基或經取代亞芳烷基； B是可選的，并且當存在時為一端與含吲哚的部分鍵聯的連接子，所述連接子選自由以下各基團組成的群組低碳亞烷基、經取代低碳亞烷基、低碳亞烯基、經取代低碳亞烯基、低碳亞雜烷基、經取代低碳亞雜烷基、-亞芳基、經取代亞芳基、亞雜芳基、經取代亞雜芳基、-O-、-O-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-S-、-S-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-S(O)k-(其中k為1、2或3)、-S(O)k(亞烷基或經取代亞烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、-C(O)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-N(R′)-、-N R′-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-N(R′)CO-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)、-N(R′)C(NCN)N(R′)-、-N(R′)C(NNO2)N(R′)-、-N(R′)C(NCOOR′)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)2-N＝N-和-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，并且R′各自獨立地為H、烷基或經取代烷基； R1為H、氨基保護基、樹脂、至少一個氨基酸、多肽或多核苷酸；并且 R2為OH、酯保護基、樹脂、至少一個氨基酸、多肽或多核苷酸； n為0、1、2或3，并且m為0、1、2或3，條件是n或m中的至少一個不為0； 其中，具有相締合Ra基團的結構1、2、3和4中的各環(huán)可含有0、1或2個Ra基團，并且Ra是各自獨立地選自由H、鹵素、烷基、經取代烷基、-N(R″)2、-C(O)R″、-C(O)N(R″)2、-O R″和-S(O)kR″(其中k為1、2或3)組成的群組，其中R″各自獨立地為H、烷基或經取代烷基；或當存在一個以上Ra基團時，兩個Ra視情況形成芳基、環(huán)烷基或雜環(huán)烷基； R3與R4各自獨立地為H、鹵素、低碳烷基或經取代低碳烷基，或R3與R4或兩個R3基團視情況形成環(huán)烷基或雜環(huán)烷基； R5各自獨立地為H、鹵素、烷基、經取代烷基、烯基、經取代烯基、炔基、經取代炔基、烷氧基、經取代烷氧基、烷基烷氧基、經取代烷基烷氧基、聚氧化烯、經取代聚氧化烯、芳基、經取代芳基、雜芳基、經取代雜芳基、烷芳基、經取代烷芳基、芳烷基、經取代芳烷基、-(亞烷基或經取代亞烷基)-ON(R″)2、OH、NH2、CN、NO2、-(亞烷基或經取代亞烷基)-C(O)SR″、-(亞烷基或經取代亞烷基)-S-S-(芳基或經取代芳基)、-C(O)R″、-C(O)2R″或-C(O)N(R″)2，其中R″各自獨立地為氫、烷基、經取代烷基、烯基、經取代烯基、烷氧基、經取代烷氧基、芳基、經取代芳基、雜芳基、烷芳基、經取代烷芳基、芳烷基、經取代芳烷基，或當存在一個以上R″基團時，兩個R″視情況形成雜環(huán)烷基； 或R5為L-X，其中，X是選自由以下各物組成的群組標記；染料；聚合物；水溶性聚合物；聚乙二醇的衍生物；光交聯劑；細胞毒性化合物；藥物；親和性標記；光親和性標記；反應性化合物；樹脂；第二蛋白質或多肽或多肽類似物；抗體或抗體片段；金屬螯合劑；輔因子；脂肪酸；碳水化合物；多核苷酸；DNA；RNA；反義多核苷酸；糖類、水溶性樹枝狀聚合物、環(huán)糊精、生物材料；納米粒子；自旋標記；熒光團、含金屬的部分；放射性部分；新穎官能團；與其它分子共價或非共價相互作用的基團；光籠化部分；光化輻射可激發(fā)的部分；配體；可光致異構化部分；生物素；生物素類似物；結合有重原子的部分；可化學裂解的基團；可光裂解的基團；延長的側鏈；碳鍵聯的糖；氧化還原活性劑；氨基硫代酸；毒性部分；經同位素標記的部分；生物物理探針；磷光基團；化學發(fā)光基團；電子致密基團；磁性基團；插入基團；發(fā)色團；能量轉移劑；生物活性劑；可檢測標記；小分子；抑制性核糖核酸；放射性核苷酸；中子俘獲劑；生物素的衍生物；量子點；納米傳遞素；放射性傳遞素；抗體酶、活化復合激活劑、病毒、佐劑、糖苷配基、過敏原、血管抑素、抗激素、抗氧化劑、適體、向導RNA、皂角苷、穿梭載體、大分子、擬抗原決定基、受體、反膠束和其任何組合；并且L是可選的，并且當存在時為選自由以下各基團組成的群組的連接子亞烷基、經取代亞烷基、亞烯基、經取代亞烯基、-O-、-O-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-S-、-S-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-S(O)k-(其中k為1、2或3)、-S(O)k(亞烷基或經取代亞烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-N(R′)CO-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-N(R′)C(O)O-、-(亞烷基或經取代亞烷基)-O-N＝CR′-、-(亞烷基或經取代亞烷基)-C(O)NR′-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-(亞烷基或經取代亞烷基)-S(O)k-(亞烷基或經取代亞烷基)-S-、-(亞烷基或經取代亞烷基)-S-S-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、-N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-和-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自獨立地為H、烷基或經取代烷基； 當存在一個以上R5基團時，兩個鄰位R5基團可視情況形成雜環(huán)烷基或芳香族雜環(huán)烷基； 或含有-B-吲哚的部分合起來形成包含至少一個吲哚部分的雙環(huán)或三環(huán)環(huán)烷基或雜環(huán)烷基； 或其活性代謝物、鹽或醫(yī)藥學上可接受的前藥或溶劑化物。
在一個實施例中，X是選自水溶性聚合物；聚氧化烯；聚乙二醇；聚乙二醇的衍生物；光交聯劑；至少一個氨基酸；至少一個糖基；至少一個核苷酸；至少一個核苷；配體；生物素；生物素類似物；可檢測標記；和其任何組合。
在另一個實施例中是具有化合物1-4的結構的化合物，其中A為鍵、經取代或未經取代的低碳亞烷基，或未經取代或經取代的選自由亞苯基、亞吡啶基、亞嘧啶基或亞噻吩基組成的群組的亞芳基。在另一個實施例中是具有化合物1-4的結構的化合物，其中A為鍵。在另一個實施例中是具有化合物1-4的結構的化合物，其中A為經取代或未經取代的低碳亞雜烷基。在另一個實施例中是具有化合物1-4的結構的化合物，其中A為亞苯基。在另一個實施例中是具有化合物1-4的結構的化合物，其中A為經取代低碳亞雜烷基，其中取代基為單一＝O基團。在另一個實施例中是具有化合物1-4的結構的化合物，其中A為經取代低碳亞烷基，其中取代基為單一＝O基團。在另一個實施例中是具有化合物1-4的結構的化合物，其中B為鍵、低碳亞烷基、經取代低碳亞烷基、-O-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-CON(R″)-、-NR′-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-N(R″)CO-、-C(O)-、-C(O)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-CON(R″)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-S(亞烷基或經取代亞烷基)-、-S(O)(亞烷基或經取代亞烷基)-或-S(O)2(亞烷基或經取代亞烷基)-。在另一個實施例中是具有化合物1-4的結構的化合物，其中B為鍵。在另一個實施例中是具有化合物1-4的結構的化合物，其中B為-O(CH2)-、-NHCH2-、-NHCO-、-C(O)-、-C(O)-(CH2)-、-CONH-(CH2)-、-SCH2-、-S(＝O)CH2-或-S(O)2CH2-。在一些實施例中是具有化合物1-4的結構的化合物，其中R5為-OH、-NH2或NO2。在另一個實施例中是具有化合物1-4的結構的化合物，其中R1為H、叔丁氧羰基(Boc)、9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)、N-乙酰基、四氟乙?；?TFA)或芐氧羰基(Cbz)。在另一個實施例中是具有化合物1-4的結構的化合物，其中R1為樹脂、至少一個氨基酸、多肽或多核苷酸。在另一個實施例中是具有化合物1-4的結構的化合物，其中R2為OH、O-甲基、O-乙基或O-叔丁基。在另一個實施例中是具有化合物1-4的結構的化合物，其中R2為樹脂、至少一個氨基酸、多肽或多核苷酸。在另一個實施例中是具有化合物1-4的結構的化合物，其中R2為多核苷酸。在另一個實施例中是具有化合物1-4的結構的化合物，其中R2為核糖核酸(RNA)。在另一個實施例中是具有化合物1-4的結構的化合物，其中R2為tRNA。在另一個實施例中是具有化合物1-4的結構的化合物，其中所述tRNA特異性識別選擇密碼子。在另一個實施例中是具有化合物1-4的結構的化合物，其中所述選擇密碼子是選自由琥珀密碼子、赭石密碼子、蛋白石密碼子、獨特密碼子、稀有密碼子、非天然密碼子、五堿基密碼子和四堿基密碼子組成的群組。在另一個實施例中是具有化合物1-4的結構的化合物，其中R2為抑制tRNA。在另一個實施例中是具有化合物1-4的結構的化合物，其中X為選自由肽、蛋白質、酶、抗體、藥物、染料、脂質、核苷、寡核苷酸、細胞、病毒、脂質體、微粒和膠束組成的群組的生物活性劑。在另一個實施例中是具有化合物1-4的結構的化合物，其中X為選自由抗生素、殺真菌劑、抗病毒劑、消炎劑、抗腫瘤劑、心血管劑、抗焦慮劑、激素、生長因子和類固醇劑組成的群組的藥物。在另一個實施例中是具有化合物1-4的結構的化合物，其中X為選自由辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶和葡萄糖氧化酶組成的群組的酶。在另一個實施例中是具有化合物1-4的結構的化合物，其中X為選自由熒光部分、磷光部分、化學發(fā)光部分、螯合部分、電子致密部分、磁性部分、插入部分、放射性部分、發(fā)色團部分和能量轉移部分組成的群組的可檢測標記。在另一個實施例中是具有化合物1-4的結構的化合物，其中X為包含烷基、經取代烷基、烯基、經取代烯基、炔基、經取代炔基、烷氧基、經取代烷氧基、烷基烷氧基、經取代烷基烷氧基、聚氧化烯、經取代聚氧化烯、芳基、經取代芳基、雜芳基、經取代雜芳基、烷芳基、經取代烷芳基、芳烷基或經取代芳烷基的聚合物。在另一個實施例中是具有化合物1-4的結構的化合物，其中所述聚合物包含聚氧化烯或經取代聚氧化烯。在另一個實施例中是具有化合物1-4的結構的化合物，其中所述聚合物包含-[(亞烷基或經取代亞烷基)-O-(氫、烷基或經取代烷基)]x，其中x為20-10,000。在另一個實施例中是具有化合物1-4的結構的化合物，其中所述聚合物為具有介于約2KDa到約40KDa范圍內的分子量的m-PEG。在某些實施例中，式(XV)化合物在水溶液中在適度酸性條件下穩(wěn)定至少1個月。在某些實施例中，式(XV)化合物在適度酸性條件下穩(wěn)定至少2周。在某些實施例中，式(XV)化合物在適度酸性條件下穩(wěn)定至少5天。在某些實施例中，所述酸性條件是pH值為約2到約8。
所述氨基酸的非限制性實施例包括具有以下結構的氨基酸


或其鹽；或在所述化合物的任何位置處并入的多肽。這些非天然氨基酸視情況呈鹽形式，或并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或多核苷酸中并視情況經翻譯后修飾。
在一些實施例中是進一步具有結構5-8的化合物
n為0、1、2或3，并且m為0、1、2或3，條件是n或m中的至少一個不為0； 其中，具有相締合Ra基團的結構5、6、7和8中的各環(huán)可含有0、1或2個Ra基團，并且Ra是各自獨立地選自由H、鹵素、烷基、經取代烷基、-N(R″)2、-C(O)R″、-C(O)N(R″)2、-OR″和-S(O)kR″(其中k為1、2或3)組成的群組，其中R″各自獨立地為H、烷基或經取代烷基；或當存在一個以上Ra基團時，兩個Ra視情況形成芳基、環(huán)烷基或雜環(huán)烷基。
在另一個實施例中是具有結構9-12的化合物
其中n為0、1、2、3或4；m為0、1、2、3或4；條件是n+m為1、2、3、4或5；X1和X2獨立地為鍵、O或NH；并且y為0或1。
在另一個實施例中是選自由以下各物組成的群組的化合物


或其鹽；或在任何化合物的任何位置處并入的多肽。
C.非天然氨基酸的細胞攝取 真核細胞對非天然氨基酸的攝取是在設計和選擇非天然氨基酸(包括(但不限于)用于并入蛋白質中)時通常考慮的一個問題。舉例來說，α-氨基酸的高電荷密度暗示這些化合物不可能為細胞可滲透的。天然氨基酸是通過一系列基于蛋白質的轉運系統而被吸收到真核細胞中?？蛇M行快速篩檢以分析哪些非天然氨基酸(如果存在)被細胞吸收。例如，參見標題為“Protein Arrays”的美國專利公開案第2004/198637號(此專利公開案是以全文引用的方式并入本發(fā)明中)中的毒性檢定，以及Liu，D.R.和Schultz，P.G.(1999)Progress toward the evolution of anorganism with an expanded genetic code.PNAS United States 964780-4785。盡管易于用各種檢定來分析攝取，但設計適用于細胞攝取途徑的非天然氨基酸的替代方案為提供活體內產生氨基酸的生物合成途徑。
通常，通過如本發(fā)明中所述的細胞攝取產生的非天然氨基酸是以足以進行有效蛋白質生物合成的濃度(包括(但不限于)天然細胞量)產生，但未達到諸如影響其它氨基酸的濃度或耗盡細胞資源的程度。以此方式產生的典型濃度為約10mM到約0.05mM。
D.非天然氨基酸的生物合成 許多生物合成途徑已存在于用于產生氨基酸和其它化合物的細胞中。雖然特定非天然氨基酸的生物合成方法可能在自然界(包括(但不限于)細胞)中不存在，但本發(fā)明中描述的方法和組合物提供這些方法。舉例來說，通過加入新的酶或修飾現有宿主細胞途徑而視情況在宿主細胞中產生非天然氨基酸的生物合成途徑。其它新酶包括天然存在的酶或人工演化的酶。舉例來說，對氨基苯丙氨酸的生物合成(如標題為“In vivo incorporation of unnatural amino acids”的WO2002/085923中的實施例中所呈示)依賴于來自其它生物體的已知酶的組合的加入。可通過以包含這些酶的基因的質粒轉化真核細胞而將所述基因引入到真核細胞中。當在細胞中表達時，這些基因提供合成所需化合物的酶促途徑。本發(fā)明中提供視情況加入的酶的類型的實施例。其它酶序列見于(例如)基因庫(Genbank)中。人工演化的酶可以相同方式加入到細胞中。以此方式操縱細胞的細胞機制和資源以產生非天然氨基酸。
多種方法可用于制備用于生物合成途徑或用于演化現有途徑的新穎酶。舉例來說，包括(但不限于)如由Maxygen，Inc.(可通過萬維網(world wide web)以www.maxygen.com獲得)所開發(fā)的遞歸重組可用于開發(fā)新穎酶和途徑。例如，參見Stemmer(1994)，Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling，Nature370(4)389-391；和Stemmer，(1994)，DNA shuffling by random fragmentation andreassemblyIn vitro recombination for molecular evolution，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，9110747-10751。類似地，由Genencor(可通過萬維網以genencor.com獲得)開發(fā)的DesignPathTM視情況用于代謝途徑工程設計中，其包括(但不限于)用于工程設計在細胞中產生非天然氨基酸的途徑。此技術使用新基因的組合(包括(但不限于)通過功能基因組學以及分子進化和設計所鑒別的那些基因)來改造宿主生物體中的現有途徑。Diversa Corporation(可通過萬維網以diversa.com獲得)也提供快速篩檢基因庫和基因途徑的技術，其包括(但不限于)產生通過生物合成產生非天然氨基酸的新途徑。
通常，以如本發(fā)明中所述的經工程設計的生物合成途徑產生的非天然氨基酸是以足以進行有效蛋白質生物合成的濃度(包括(但不限于)天然細胞量)產生，但未達到諸如影響其它氨基酸濃度或耗盡細胞資源的程度。以此方式在活體內產生的典型濃度為約10mM到約0.05mM。一旦以包含用于產生特定途徑所需的酶的基因的質粒轉化細胞并且產生非天然氨基酸，那么視情況使用活體內選擇以針對核糖體蛋白質合成與細胞生長進一步優(yōu)化非天然氨基酸的產生。
E.其它合成方法 視情況，使用文獻記載的方法或使用本發(fā)明中描述的技術或由其組合來合成本發(fā)明中描述的非天然氨基酸。作為輔助，下表提供視情況經組合以產生所需官能團的各種起始親電子試劑和親核試劑。所提供的信息打算為說明性的并且不限制本發(fā)明中描述的合成技術。
表1共價鍵聯和其前驅物的實施例 一般來說，碳親電子試劑易于受到互補親核試劑(包括碳親核試劑)攻擊，其中攻擊性的親核試劑向碳親電子試劑提供電子對以在親核試劑與碳親電子試劑之間形成新鍵。
碳親核試劑的非限制性實施例包括(但不限于)烷基格氏試劑(alkylGrignard)、烯基格氏試劑、芳基格氏試劑以及炔基格氏試劑、有機鋰試劑、有機鋅試劑、烷基錫試劑、烯基錫試劑、芳基錫試劑以及炔基錫試劑(有機錫烷)、烷基硼烷試劑、烯基硼烷試劑、芳基硼烷試劑以及炔基硼烷試劑(有機硼烷以及有機硼酸鹽)；這些碳親核試劑在水或極性有機溶劑中具有動力學穩(wěn)定的優(yōu)點。碳親核試劑的其它非限制性實施例包括磷內鎓鹽、烯醇和烯醇化物試劑；這些碳親核試劑具有相對易于由前驅物產生的優(yōu)點。當與碳親電子試劑一起使用時，碳親核試劑在碳親核試劑與碳親電子試劑之間形成新的碳-碳鍵。
適于與碳親電子試劑偶合的非碳親核試劑的非限制性實施例包括(但不限于)伯胺與仲胺、硫醇、硫醇鹽，以及硫醚、醇、醇鹽、疊氮化物、氨基脲等。當與碳親電子試劑一起使用時，這些非碳親核試劑通常產生雜原子鍵聯(C-X-C)，其中X為雜原子，其包括(但不限于)氧、硫或氮。
在一個實施例中是制備結構1或2的化合物的方法，其包含使式(II)化合物與含羰基的化合物反應，其中所述式(II)化合物為
其中 A是可選的，并且當存在時為低碳亞烷基、經取代低碳亞烷基、低碳亞環(huán)烷基、經取代低碳亞環(huán)烷基、低碳亞烯基、經取代低碳亞烯基、亞炔基、經取代亞炔基、低碳亞雜烷基、經取代亞雜烷基、低碳亞雜環(huán)烷基、經取代低碳亞雜環(huán)烷基、亞芳基、經取代亞芳基、亞雜芳基、經取代亞雜芳基、亞烷芳基、經取代亞烷芳基、亞芳烷基或經取代亞芳烷基； B是可選的，并且當存在時為一端與含吲哚的部分鍵聯的連接子，所述連接子選自由以下各基團組成的群組低碳亞烷基、經取代低碳亞烷基、低碳亞烯基、經取代低碳亞烯基、低碳亞雜烷基、經取代低碳亞雜烷基、亞芳基、經取代亞芳基、亞雜芳基、經取代亞雜芳基、-O-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-S-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-S(O)k-(其中k為1、2或3)、-S(O)k(亞烷基或經取代亞烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2、-OS(O)2-、-C(O)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-NR′-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、＝N-O-(亞烷基或經取代亞烷基)、-N(R′)CO-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)2-N＝N-和-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-；并且R′各自獨立地為H、烷基或經取代烷基； R1為H、氨基保護基、樹脂、至少一個氨基酸、多肽或多核苷酸；并且 R2為OH、酯保護基、樹脂、至少一個氨基酸、多肽或多核苷酸； Ra是各自獨立地選自由H、鹵素、烷基、經取代烷基、CN、NO2、-N(R′)2、-C(O)R′、-C(O)N(R′)2、-OR′和-S(O)kR′(其中k為1、2或3)組成的群組，并且R′各自獨立地為H、烷基或經取代烷基； R3和R4獨立地為氫或胺保護基，其包括(但不限于)
在另一個實施例中是制備結構1或2的化合物的方法，其中A為經取代或未經取代的低碳亞烷基，或未經取代或經取代的選自由亞苯基、亞吡啶基、亞嘧啶基或亞噻吩基組成的群組的亞芳基。在另一個實施例中是制備結構1或2的化合物的方法，其中A為經取代或未經取代的低碳亞雜烷基。
在另一個實施例中是制備結構1或2的化合物的方法，其中A為經取代低碳亞雜烷基，其中取代基為單一＝O基團。在另一個實施例中是制備結構1或2的化合物的方法，其中A為經取代低碳亞烷基，其中取代基為單一＝O基團。
在另一個實施例中是制備結構1或2的化合物的方法，其中B為低碳亞烷基、經取代低碳亞烷基、-O-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-CON(R″)-、-NR″-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-N(R″)CO-、-C(O)-、-C(O)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-CON(R″)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-S(亞烷基或經取代亞烷基)-、-S(O)(亞烷基或經取代亞烷基)-或-S(O)2(亞烷基或經取代亞烷基)-；其中R″各自獨立地為H、烷基或經取代烷基。
在另一個實施例中是制備結構1或2的化合物的方法，其中B為-O(CH2)-、-NHCH2-、-NHCO-、-C(O)-、-C(O)-(CH2)-、-CONH-(CH2)-、-SCH2-、-S(＝O)CH2-或-S(O)2CH2-。
在另一個實施例中是制備結構1或2的化合物的方法，其中R1為H、叔丁氧羰基(Boc)、9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)、N-乙酰基、四氟乙酰基(TFA)或芐氧羰基(Cbz)。
在另一個實施例中是制備結構1或2的化合物的方法，其中R3和R4為氫、
在另一個實施例中是制備結構1或2的化合物的方法，其中R1為樹脂、至少一個氨基酸、多肽或多核苷酸。在另一個實施例中是制備結構1或2的化合物的方法，其中R2為OH、O-甲基、O-乙基或O-叔丁基。在另一個實施例中是制備結構1或2的化合物的方法，其中R2為樹脂、至少一個氨基酸、多肽或多核苷酸。
在一些實施例中是制備結構1或2的化合物的方法，其中式(II)化合物具有以下結構
其中，n為0、1、2、3或4；m為0、1、2、3或4；條件是n+m為1、2、3、4或5；X1和X2獨立地為鍵、O或NH；并且y為0或1。
在另一個實施例中是制備結構1或2的化合物的方法，其中R2為多核苷酸。在另一個實施例中是制備結構1或2的化合物的方法，其中R2為核糖核酸(RNA)。在另一個實施例中是制備結構1或2的化合物的方法，其中R2為tRNA。在另一個實施例中是制備結構1或2的化合物的方法，其中所述tRNA特異性識別選擇密碼子。在另一個實施例中是制備結構1或2的化合物的方法，其中所述選擇密碼子是選自由琥珀密碼子、赭石密碼子、蛋白石密碼子、獨特密碼子、稀有密碼子、非天然密碼子、五堿基密碼子和四堿基密碼子組成的群組。在另一個實施例中是制備結構1或2的化合物的方法，其中R2為抑制tRNA。
在另一個實施例中是制備結構1或2的化合物的方法，所述化合物選自由以下各物組成的群組
在一些實施例中是制備結構1或2的化合物的方法，所述化合物對應于式(IV)
其中，Ra是各自獨立地選自由H、鹵素、烷基、經取代烷基、CN、NO2、-N(R″)2、-C(O)R″、-C(O)N(R″)2、-OR″和-S(O)kR″(其中k為1、2或3)組成的群組，其中R″各自獨立地為H、烷基或經取代烷基。
在另一個實施例中是制備結構1或2的化合物的方法，所述化合物選自由以下各物組成的群組
在另一個實施例中是制備結構1或2的化合物的方法，其進一步包含使式(V)化合物與含肼的試劑反應；其中所述式(V)化合物為
其中 A是可選的，并且當存在時為低碳亞烷基、經取代低碳亞烷基、低碳亞環(huán)烷基、經取代低碳亞環(huán)烷基、低碳亞烯基、經取代低碳亞烯基、亞炔基、低碳亞雜烷基、經取代亞雜烷基、低碳亞雜環(huán)烷基、經取代低碳亞雜環(huán)烷基、亞芳基、經取代亞芳基、亞雜芳基、經取代亞雜芳基、亞烷芳基、經取代亞烷芳基、亞芳烷基或經取代亞芳烷基； B是可選的，并且當存在時為選自由以下各基團組成的群組的連接子低碳亞烷基、經取代低碳亞烷基、低碳亞烯基、經取代低碳亞烯基、低碳亞雜烷基、經取代低碳亞雜烷基、亞芳基、經取代亞芳基、亞雜芳基、經取代亞雜芳基、-O-、-O-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-S-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-S(O)k(亞烷基或經取代亞烷基)-(其中k為1、2或3)、-C(O)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-C(S)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-CON(R′)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-CSN(R′)-(亞烷基或經取代亞烷基)-和-N(R′)CO-(亞烷基或經取代亞烷基)-，其中R′各自獨立地為H、烷基或經取代烷基； J為

R為H、烷基、經取代烷基、環(huán)烷基或經取代環(huán)烷基； R″各自獨立地為H、烷基、經取代烷基或保護基，或當存在一個以上R″基團時，兩個R″視情況形成雜環(huán)烷基； R1為H、氨基保護基、樹脂、至少一個氨基酸、多肽或多核苷酸；并且 R2為OH、酯保護基、樹脂、至少一個氨基酸、多肽或多核苷酸； R3與R4各自獨立地為H、鹵素、低碳烷基或經取代低碳烷基，或R3與R4或兩個R3基團視情況形成環(huán)烷基或雜環(huán)烷基； 或-A-B-J-R基團合起來形成包含至少一個羰基(包括羰基)、經保護羰基(包括經保護羰基)或經掩蔽羰基(包括經掩蔽羰基)的雙環(huán)或三環(huán)環(huán)烷基或雜環(huán)烷基； 或-J-R基團合起來形成包含至少一個羰基(包括羰基)、經保護羰基(包括經保護羰基)或經掩蔽羰基(包括經掩蔽羰基)的單環(huán)或雙環(huán)環(huán)烷基或雜環(huán)烷基； 條件是當A為亞苯基并且R3各自為H時，B存在；并且當A為-(CH2)4-并且R3各自為H時，B不為-NHC(O)(CH2CH2)-；并且當A與B都不存在并且R3各自為H時，R不為甲基。
在另一個實施例中是制備結構1或2的化合物的方法，所述化合物對應于式(VI)
在另一個實施例中是制備結構1或2的化合物的方法，其中A為經取代或未經取代的低碳亞烷基，或選自由亞苯基、亞吡啶基、亞嘧啶基或方法組成的群組的未經取代或經取代的亞芳基。
在另一個實施例中是制備結構1或2的化合物的方法，其中B為低碳亞烷基、經取代低碳亞烷基、-O-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-CON(R″)-、-NR″-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-N(R″)CO-、-C(O)-、-C(O)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-CON(R″)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-S(亞烷基或經取代亞烷基)-、-S(O)(亞烷基或經取代亞烷基)-或-S(O)2(亞烷基或經取代亞烷基)-。在另一個實施例中是制備結構1或2的化合物的方法，其中B為-O(CH2)-、-NHCH2-、-NHCO-、-C(O)-、-C(O)-(CH2)-、-CONH-(CH2)-、-SCH2-、-S(＝O)CH2-或-S(O)2CH2-。
在另一個實施例中是制備結構1或2的化合物的方法，所述化合物選自由以下各物組成的群組
在另一個實施例中是制備結構1或2的化合物的方法，所述化合物對應于式(VII)
其中，Ra是各自獨立地選自由H、鹵素、烷基、經取代烷基、-N(R″)2、-C(O)R″、-C(O)N(R″)2、-OR″和-S(O)kR″(其中k為1、2或3)組成的群組，其中R″各自獨立地為H、烷基或經取代烷基。
在另一個實施例中是制備結構1或2的化合物的方法，所述化合物選自由以下各物組成的群組

在另一個實施例中是制備結構1或2的化合物的方法，所述化合物對應于式(VIII)
其中，Ra是各自獨立地選自由H、鹵素、烷基、經取代烷基、-N(R″)2、-C(O)R″、-C(O)N(R″)2、-OR″和-S(O)kR″(其中k為1、2或3)組成的群組，其中R″各自獨立地為H、烷基或經取代烷基； Y和Z是獨立地選自由-OH、經氧取代的烷基、-SH或經硫取代的烷基組成的群組，并且Y和Z合起來可形成環(huán)烷基環(huán)。
在另一個實施例中是制備結構1或2的化合物的方法，所述化合物選自由以下各物組成的群組

在另一個實施例中是制備結構1或2的化合物的方法，所述化合物對應于式(IX)
其中，Ra是各自獨立地選自由H、鹵素、烷基、經取代烷基、-N(R″)2、-C(O)R″、-C(O)N(R″)2、-OR″和-S(O)kR″(其中k為1、2或3)組成的群組，其中R″各自獨立地為H、烷基或經取代烷基； Y是獨立地選自由OR″、NR″R″、NC(O)R″組成的群組，其中R″各自獨立地為H、烷基或經取代烷基。
在另一個實施例中是制備結構1或2的化合物的方法，所述化合物選自由以下各物組成的群組
在另一個實施例中是制備結構1或2的化合物的方法，所述化合物對應于式(X)
其中，Ra是各自獨立地選自由H、鹵素、烷基、經取代烷基、-N(R″)2、-C(O)R″、-C(O)N(R″)2、-OR″和-S(O)kR″(其中k為1、2或3)組成的群組，其中R″各自獨立地為H、烷基或經取代烷基；或當存在一個以上Ra基團時，兩個Ra視情況形成環(huán)烷基或雜環(huán)烷基； R3和R4獨立地為H、鹵素、CN、NO2、烷基、經取代烷基、N(R′)2、C(O)R′、-C(O)N(R′)2、-OR′和-S(O)kR′(其中k為1、2或3)，其中R′各自獨立地為H、烷基或經取代烷基； X為C、N或S，條件是當X為O或S時，R4不可為H、鹵素、CN、NO2、烷基、經取代烷基、N(R′)2、C(O)R′、-C(O)N(R′)2、-OR′和-S(O)kR′；其中k為1、2或3，并且n為0、1或2。
在另一個實施例中是制備結構1或2的化合物的方法，所述化合物選自由以下各物組成的群組
在另一個實施例中是制備結構1或2的化合物的方法，所述化合物對應于式(XI)
其中，Ra是各自獨立地選自由H、鹵素、烷基、經取代烷基組成的群組； Y和Z是獨立地選自由-OH、經氧取代的烷基、-SH或經硫取代的烷基組成的群組，并且Y和Z合起來可形成環(huán)烷基環(huán)。
在另一個實施例中是制備結構1或2的化合物的方法，所述化合物選自由以下各物組成的群組
在另一個實施例中是制備結構1或2的化合物的方法，所述化合物對應于式(XII)
其中，Ra是各自獨立地選自由H、鹵素、烷基、經取代烷基、-N(R″)2、-C(O)R″、-C(O)N(R″)2、-OR″和-S(O)kR″(其中k為1、2或3)組成的群組，其中R″各自獨立地為H、烷基或經取代烷基； 其中B進一步包含-CH＝N-O-(亞烷基或經取代亞烷基)-； n為1、2或3；并且 Y是獨立地選自由OR″、NR″R″、NC(O)R″組成的群組，其中R″各自獨立地為H、烷基、經取代烷基。
在另一個實施例中是制備結構1或2的化合物的方法，所述化合物選自由以下各物組成的群組
在另一個實施例中是制備結構1或2的化合物的方法，其中所述化合物可在水溶液中在適度條件下與含羰基的試劑反應。
在另一個實施例中是制備結構1或2的化合物的方法，其中所述化合物與含羰基或含經保護羰基的試劑的反應具有以下特征中的至少一個(i)在約1到約6的pH值范圍內發(fā)生；(ii)產生在生物條件下穩(wěn)定的吲哚鍵聯；(iii)具位點特異性；(iv)不會不可逆轉地破壞多肽的三級結構；(v)在室溫下發(fā)生；(vi)容易在水溶液中發(fā)生；或(vii)具區(qū)域選擇性和/或區(qū)域專一性。
在另一個實施例中是制備結構1或2的化合物的方法，其中適度條件是pH值為約1到約6。在另一個實施例中是制備結構1或2的化合物的方法，其中適度條件是pH值為約3到約6。在另一個實施例中是制備結構1或2的化合物的方法，反應是在水溶液中在適度條件下進行。
在另一個實施例中是制備結構1或2的化合物的方法，其中式(V)化合物與含肼的試劑的反應具有以下特征中的至少一個(i)在約1到約6的pH值范圍內發(fā)生；(ii)產生在生物條件下穩(wěn)定的吲哚鍵聯；(iii)具位點特異性；(iv)不會不可逆轉地破壞多肽的三級結構；(v)容易在室溫下發(fā)生；(vi)容易在水溶液中發(fā)生；或(vii)具區(qū)域選擇性和/或區(qū)域專一性。
VI.具有非天然氨基酸的多肽 為方便起見，這個部分中所描述的化合物的形式、性質和其它特征已經一般性描述和/或用特定實施例加以描述。然而，這個部分中所描述的形式、性質和其它特征不應僅限于這個部分中所提供的一般性描述或特定實施例，而是這個部分中所描述的形式、性質和其它特征同樣良好適用于處于式I-XV的范圍內的所有化合物和具有結構1-4的化合物，包括處于本發(fā)明中的說明書、權利要求以及圖式中所描述的式I-XV和具有結構1-4的化合物的范圍內的任何子式或特定化合物。
本發(fā)明中描述的組合物和方法提供將至少一個非天然氨基酸并入多肽中。非天然氨基酸視情況存在于多肽上的任何位置處，包括多肽的任何末端位置或任何內部位置。相對于同源天然存在氨基酸多肽來說，非天然氨基酸優(yōu)選不破壞多肽的活性和/或三級結構，除非活性和/或三級結構的所述破壞是將非天然氨基酸并入多肽中的一個目的。此外，相對于同源天然存在氨基酸多肽來說，將非天然氨基酸并入多肽中視情況在一定程度上改變多肽的活性(例如，操縱多肽的治療功效；改良多肽的安全性概況；調節(jié)多肽的藥物動力學、藥理學和/或藥效學(例如，增加水溶性、生物可用性；增加血清半衰期；增加治療半衰期；調節(jié)免疫原性；調節(jié)生物活性；或延長循環(huán)時間)；向多肽提供其它官能團；向多肽中并入標簽、標記或可檢測信號；易化多肽的分離性質；以及前述修飾的任何組合)和/或三級結構，而完全不會造成活性和/或三級結構的破壞。盡管相對于同源天然存在氨基酸多肽來說，將非天然氨基酸并入多肽中視情況不會對多肽的活性和/或三級結構產生影響，但對活性和/或三級結構的這些修飾通常是實現這些并入的一個目標。因此，認為非天然氨基酸多肽、包含非天然氨基酸多肽的組合物、用于制造這些多肽和多肽組合物的方法、用于純化、分離和表征這些多肽和多肽組合物的方法，以及使用這些多肽和多肽組合物的方法都在本發(fā)明的范圍內。此外，本發(fā)明中所描述的非天然氨基酸多肽視情況連接到另一多肽(包括(例如)非天然氨基酸多肽或天然存在氨基酸多肽)上。
多肽是選自(例如)任何已知的治療蛋白，所述治療蛋白是已知對患有疾病、病癥或病狀的人具有治療作用的蛋白質。僅舉例來說，多肽是選自α-1抗胰蛋白酶、血管抑素、抗溶血因子、抗體、抗體片段、載脂蛋白、脫輔基蛋白、心房利鈉因子、心房利鈉多肽、心房肽、C-X-C趨化因子、T39765、NAP-2、ENA-78、gro-a、gro-b、gro-c、IP-10、GCP-2、NAP-4、SDF-1、PF4、MIG、降血鈣素、c-kit配體、細胞因子、CC趨化因子、單核細胞趨化蛋白-1、單核細胞趨化蛋白-2、單核細胞趨化蛋白-3、單核細胞炎性蛋白-1α、單核細胞炎性蛋白-iβ、RANTES、1309、R83915、R91733、HCC1、T58847、D31065、T64262、CD40、CD40配體、c-kit配體、膠原蛋白、菌落刺激因子(CSF)、補體因子5a、補體抑制劑、補體受體1、細胞因子、上皮中性粒細胞激活肽-78、MIP-16、MCP-1、表皮生長因子(EGF)、上皮中性粒細胞激活肽、紅細胞生成素(EPO)、剝脫性毒素、因子IX、因子VII、因子VIII、因子X、成纖維細胞生長因子(FGF)、纖維蛋白原、纖維粘連蛋白、四螺旋束蛋白、G-CSF、glp-1、GM-CSF、葡糖腦苷脂酶、促性腺激素、生長因子、生長因子受體、grf、刺猬蛋白、血紅蛋白、肝細胞生長因子(hGF)、水蛭素、人類生長激素(hGH)、人類血清白蛋白、ICAM-1、ICAM-1受體、LFA-1、LFA-1受體、胰島素、類胰島素生長因子(IGF)、IGF-I、IGF-II、干擾素(IFN)、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、白細胞介素(IL)、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、角質細胞生長因子(KGF)、乳鐵蛋白、白血病抑制因子、熒光素酶、神經素、中性粒細胞抑制因子(NIF)、抑瘤素M、成骨蛋白、癌基因產物、paracitonin、甲狀旁腺激素、PD-ECSF、PDGF、肽激素、多效營養(yǎng)因子、蛋白質A、蛋白質G、pth、致熱外毒素A、致熱外毒素B、致熱外毒素C、pyy、松弛素、腎素、SCF、小生物合成蛋白、可溶性補體受體I、可溶性I-CAM 1、可溶性白細胞介素受體、可溶性TNF受體、生長調節(jié)素、生長抑素、生長激素、鏈激酶、超抗原、葡萄球菌腸毒素、SEA、SEB、SEC1、SEC2、SEC3、SED、SEE、類固醇激素受體、超氧化物歧化酶、中毒性休克綜合癥毒素、胸腺素α1、組織型纖溶酶原激活劑、腫瘤生長因子(TGF)、腫瘤壞死因子、腫瘤壞死因子α、腫瘤壞死因子β、腫瘤壞死因子受體(TNFR)、尾加壓素、VLA-4蛋白、VCAM-1蛋白、血管內皮生長因子(VEGF)、尿激酶、mos、ras、raf、met、p53、tat、fos、myc、jun、myb、rel、雌激素受體、孕酮受體、睪丸激素受體、醛固酮受體、LDL受體和皮質酮受體。
本發(fā)明中描述的非天然氨基酸多肽視情況通過生物合成或非生物合成來制備。生物合成表示利用翻譯系統(細胞或非細胞)的任何方法，其包括使用以下組分中的至少一個多核苷酸、密碼子、tRNA和核糖體。非生物合成表示不利用翻譯系統的任何方法這種方法可進一步分為利用固態(tài)肽合成方法、固相肽合成方法的方法；利用至少一種酶的方法；以及不利用至少一種酶的方法；另外，這些子部分中的任何子部分都可與另一子部分重疊，并且許多方法視情況利用這些子部分的組合。
本發(fā)明中描述的方法、組合物、策略和技術不限于多肽或蛋白質的特定類型、種類或家族。實際上，本發(fā)明中描述的組合物的范圍允許幾乎任何多肽都包括至少一個本發(fā)明中描述的非天然氨基酸。僅舉例來說，多肽與治療蛋白同源。在相關或另一個實施例中，非天然氨基酸多肽與生長激素超基因家族的任何多肽成員同源。
非天然氨基酸多肽視情況如本發(fā)明中其它地方所述進一步經修飾，或非天然氨基酸多肽視情況不經進一步修飾而使用。出于多種目的將非天然氨基酸并入多肽中，所述目的包括(但不限于)定制蛋白質結構和/或功能的改變，改變蛋白酶標靶位點的大小、酸性、親核性、氫鍵結、疏水性、可接近性，靶向部分(包括(但不限于)，對于多肽陣列)等。包括非天然氨基酸的多肽可具有增強的或甚至全新的催化或生物物理性質。僅舉例來說，可通過將非天然氨基酸包括于多肽中來改變以下性質毒性、生物分布、結構性質、光譜性質、化學和/或光化學性質、催化能力、半衰期(包括(但不限于)血清半衰期)、與其它分子反應(包括(但不限于)共價或非共價)的能力等。具有包括至少一個非天然氨基酸的多肽的組合物適用于(包括，但不限于)新穎治療劑、診斷劑、催化酶、工業(yè)酶、結合蛋白(包括(但不限于)抗體)，以及研究(包括(但不限于)對蛋白質結構和功能的研究)。例如，參見Dougherty，(2000)Unnatural Amino Acids as Probes of ProteinStructure and Function，Current Opinion in Chemical Biology，4645-652。
此外，多肽的非天然氨基酸組分的側鏈向多肽提供多種其它官能團；僅舉例來說，且并非加以限制，多肽的非天然氨基酸部分的側鏈包括任何所需官能團。
一方面，組合物包括至少一種具有至少一個(包括(但不限于)至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個、至少六個、至少七個、至少八個、至少九個或至少十個或十個以上)非天然氨基酸的多肽。這些非天然氨基酸視情況相同或不同。另外，多肽中視情況存在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或20個以上的不同位點，其包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或20個以上的不同或相同非天然氨基酸。另一方面，組合物包括其中存在的至少一個(但少于全部)特定氨基酸經非天然氨基酸取代的多肽。對于具有一個以上非天然氨基酸的給定多肽來說，這些非天然氨基酸可相同或不同(僅舉例來說，多肽可包括兩種或兩種以上不同類型的非天然氨基酸，或可包括兩個相同的非天然氨基酸)。對于具有兩個以上非天然氨基酸的給定多肽來說，所述非天然氨基酸可相同、不同或為多個數目的相同種類的非天然氨基酸與至少一個不同的非天然氨基酸的組合。
盡管本發(fā)明中描述的非天然氨基酸多肽的實施例是視情況通過固相肽合成方法(僅舉例來說，使用固體樹脂)、通過溶液相肽合成方法和/或不借助于酶以化學方式合成，但本發(fā)明中描述的非天然氨基酸多肽的其它實施例允許通過細胞膜、細胞提取物或溶解產物系統或通過活體內系統(僅舉例來說，使用原核細胞或真核細胞的細胞機制)合成。在其它或另外的實施例中，本發(fā)明中描述的非天然氨基酸多肽的一種關鍵特征在于其是利用核糖體來合成。在本發(fā)明中描述的非天然氨基酸多肽的其它或另外的實施例中，非天然氨基酸多肽是通過方法的組合(包括(但不限于)固體樹脂、不借助于酶、借助于核糖體和/或通過活體內系統的組合)來合成。
通過核糖體和/或活體內系統合成非天然氨基酸多肽具有與用固體樹脂或不借助于酶合成的非天然氨基酸多肽不同的優(yōu)點和特征。這些優(yōu)點或特征包括不同的雜質分布利用核糖體的系統和/或活體內系統將具有源自所利用的生物系統的雜質，其包括宿主細胞蛋白質、膜部分和脂質，而來自利用固體樹脂和/或不借助于酶的系統的雜質分布可包括有機溶劑、保護基、樹脂材料、偶合試劑以及合成程序中使用的其它化學品。另外，通過使用核糖體和/或活體內系統合成的非天然氨基酸多肽的同位素模式可反映細胞所利用的原料的同位素模式；另一方面，用固體樹脂和/或不借助于酶合成的非天然氨基酸多肽的同位素模式可反映合成中所利用的氨基酸的同位素模式。此外，通過使用核糖體和/或活體內系統合成的非天然氨基酸可實質上不含氨基酸的D-異構體，和/或可能能夠容易地將內部半胱氨酸氨基酸并入多肽的結構中，和/或可能很少提供內部氨基酸缺失多肽。另一方面，通過固體樹脂和/或不使用酶合成的非天然氨基酸多肽可具有較高含量的氨基酸的D-異構體和/或較低含量的內部半胱氨酸氨基酸和/或較高百分比的內部氨基酸缺失多肽。此外，應能夠區(qū)分通過使用核糖體和/或活體內系統合成的非天然氨基酸多肽與通過固體樹脂和/或不使用酶合成的非天然氨基酸多肽。
VII.包含核酸和寡核苷酸的組合物和方法 A.用于本發(fā)明中的通用重組核酸方法 在本發(fā)明中描述的方法和組合物的眾多實施例中，將編碼所關注的多肽(包括例如GH多肽)的核酸分離、克隆，并且通常使用重組方法使其變異。這些實施例是用于(包括，但不限于)蛋白質表達或產生來源于多肽的變異體、衍生物、表達盒或其它序列的過程中。在一些實施例中，編碼多肽的序列是操作性連接于異源啟動子上。
本發(fā)明中也描述可產生非天然氨基酸多肽的細胞，其中所述多肽上的至少一個非天然氨基酸包含具有羰基、肼、吲哚鍵聯的側鏈。所述細胞使用本發(fā)明中描述的方法或其變化形式產生所述非天然氨基酸多肽，但通過生物合成產生至少一個非天然氨基酸?？墒褂帽景l(fā)明中描述的技術、方法、組合物和策略或其變化形式來制備可生物合成至少一個非天然氨基酸的細胞。
可根據母體多肽的氨基酸序列來合成編碼包含非天然氨基酸的多肽的核苷酸序列，且隨后改變所述核苷酸序列以實現相關氨基酸殘基的引入(即，并入或取代)或移除(即，缺失或取代)?？筛鶕墨I所記載的方法通過定點誘變來適當修飾核苷酸序列?；蛘撸赏ㄟ^化學合成來制備核苷酸序列，包括(但不限于)通過使用寡核苷酸合成儀并且優(yōu)選地選擇將產生重組多肽的宿主細胞中所偏愛的那些密碼子來制備核苷酸序列，其中寡核苷酸是根據所需多肽的氨基酸序列進行設計。舉例來說，可通過PCR、連接或連接鏈反應來合成并組裝編碼所需多肽的部分的若干小寡核苷酸。例如，參見Barany等人，Proc.Natl.Acad.Sci.88189-193(1991)；U.S.6,521,427，其是以引用的方式并入本發(fā)明中以揭示前述內容。
本發(fā)明中描述的非天然氨基酸方法和組合物利用重組遺傳學領域中的技術。揭示用于本發(fā)明中描述的非天然氨基酸方法和組合物的通用方法的基礎著作包括Sambrook等人，Molecular Cloning，A Laboratory Manual(第3版，2001)；Kriegler，Gene Transfer and ExpressionA Laboratory Manual(1990)；以及Current Protocolsin Molecular Biology(Ausubel等人編，1994)。
描述分子生物學技術的一般著作包括Berger和Kimmel，Guide to MolecularCloning Techniques，Methods in Enzymology，第152卷，Academic Press，Inc.，SanDiego，CA(Berger)；Sambrook等人，Molecular Cloning-A Laboratory Manual(第2版)，第1卷或第2卷，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NewYork，1989(″Sambrook″)以及Current Protocols in Molecular Biology，F.M.Ausubel等人編，Current Protocols，Greene Publishing Associates，Inc.與John Wiley & Sons，Inc.的合資企業(yè)，(1999全年增補)(″Ausubel″)。這些著作描述誘變，載體、啟動子的使用以及許多其它相關主題，所述相關主題涉及(包括，但不限于)包括用于制備包括非天然氨基酸、正交tRNA、正交合成酶和其對的蛋白質的選擇密碼子的基因或多核苷酸的產生。
出于多種目的在本發(fā)明中描述的非天然氨基酸方法和組合物中使用多種類型的誘變，所述目的包括(但不限于)產生新穎合成酶或tRNA，使tRNA分子突變，使編碼合成酶、tRNA庫的多核苷酸突變，產生合成酶庫，產生選擇密碼子，插入編碼所關注的蛋白質或多肽中的非天然氨基酸的選擇密碼子。所述誘變包括(但不限于)定點誘變、隨機點誘變、同源重組、DNA改組或其它遞歸誘變方法、嵌合構建、使用含有尿嘧啶的模板的誘變、寡核苷酸定向誘變、經硫代磷酸酯修飾的DNA誘變、使用帶缺口的雙螺旋DNA的誘變等，或其任何組合。其它合適方法包括點錯配修復、使用修復缺陷型宿主品系的誘變、限制性選擇和限制性純化、缺失誘變、通過總基因合成進行的誘變、雙鏈斷裂修復等。包括(但不限于)涉及嵌合構筑體的誘變也包括在本發(fā)明中描述的非天然氨基酸方法和組合物中。在一個實施例中，可由天然存在分子或已變異或突變的天然存在分子的文獻所記載的信息(包括(但不限于)序列比較、物理性質、晶體結構等)來指導誘變。
本發(fā)明中可見的著作和實施例描述這些和其它相關程序。其它信息可見于以下公開案和其中引用的參考文獻中Ling等人，Approaches to DNA mutagenesisanoverview，Anal Biochem.254(2)157-178(1997)；Dale等人，Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the phosphorothioate method，Methods Mol.Biol.57369-374(1996)；Smith，In vitro mutagenesis，Ann.Rev.Genet.19423-462(1985)；Botstein和Shortle，Strategies and applications of in vitromutagenesis，Science 2291193-1201(1985)；Carter，Site-directed mutagenesis，Biochem.J.2371-7(1986)；Kunkel，The efficiency of oligonucleotide directedmutagenesis，在Nucleic Acids & Molecular Biology中(Eckstein，F.和Lilley，D.M.J.編，Springer Verlag，Berlin))(1987)；Kunkel，Rapid and efficient site-specificmutagenesis without phenotypic selection，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82488-492(1985)；Kunkel等人，Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypicselection，Methods in Enzymol.154，367-382(1987)；Bass等人，Mutant Trprepressors with new DNA-binding specificities，Science 242240-245(1988)；Methodsin Enzymol.100468-500(1983)；Methods in Enzymol.154329-350(1987)；Zoller和Smith，Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13-derived vectorsanefficient and general procedure for the production of point mutations in any DNAfragment，Nucleic Acids Res.106487-6500(1982)；Zoller 和Smith，Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors，Methods in Enzymol.100468-500(1983)；Zoller和Smith，Oligonucleotide-directedmutagenesisa simple method using two oligonucleotide primers and asingle-stranded DNA template，Methods in Enzymol.154329-350(1987)；Taylor等人，The use of phosphorothioate-modified DNA in restriction enzyme reactions toprepare nicked DNA，Nucl.Acids Res.138749-8764(1985)；Taylor等人，The rapidgeneration of oligonucleotide-directed mutations at high frequency usingphosphorothioate-modified DNA，Nucl.Acids Res.138765-8785(1985)；Nakamaye和Eckstein，Inhibition of restriction endonuclease Nci I cleavage by phosphorothioategroups and its application to oligonucleotide-directed mutagenesis，Nucl.Acids Res.149679-9698(1986)；Sayers等人，5′-3′Exonucleases in phosphorothioate-basedoligonucleotide-directed mutagenesis，Nucl.Acids Res.16791-802(1988)；Sayers等人，Strand specific cleavage of phosphorothioate-containing DNA by reaction withrestriction endonucleases in the presence of ethidium bromide，(1988)Nucl.Acids Res.16803-814；Kramer等人，The gapped duplex DNA approach tooligonucleotide-directed mutation construction，Nucl.Acids Res.129441-9456(1984)；Kramer和Fritz，Oligonucleotide-directed construction of mutations viagapped duplex DNA，Methods in Enzymol.154350-367(1987)；Kramer等人，Improved enzymatic in vitro reactions in the gapped duplex DNA approach tooligonucleotide-directed construction of mutations，Nucl.Acids Res.167207(1988)；Fritz等人，Oligonucleotide-directed construction of mutationsa gapped duplex DNAprocedure without enzymatic reactions in vitro，Nucl.Acids Res.166987-6999(1988)；Kramer等人，Point Mismatch Repair，Cell 38879-887(1984)；Carter等人，Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis using M13 vectors，Nucl.AcidsRes.134431-4443(1985)；Carter，Improved oligonucleotide-directed mutagenesisusing M13 vectors，Methods in Enzymol.154382-403(1987)；Eghtedarzadeh和Henikoff，Use of oligonucleotides to generate large deletions，Nucl.Acids Res.145115(1986)；Wells等人，Importance of hydrogen-bond formation in stabilizing thetransition state of subtilisin，Phil.Trans.R.Soc.Lond.A 317415-423(1986)；Nambiar等人，Total synthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease Sprotein，Science 2231299-1301(1984)；Sakmar和Khorana，Total synthesis andexpression of a gene for the alpha-subunit of bovine rod outer segment guaninenucleotide-binding protein(transducin)，Nucl.Acids Res.146361-6372(1988)；Wells等人，Cassette mutagenesisan efficient method for generation of multiplemutations at defined sites，Gene 34315-323(1985)；Grundstrom等人，Oligonucleotide-directed mutagenesis by microscale ′shot-gun′gene synthesis，Nucl.Acids Res.133305-3316(1985)；Mandecki，Oligonucleotide-directed double-strandbreak repair in plasmids of Escherichia colia method for site-specific mutagenesis，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，837177-7181(1986)；Arnold，Protein engineering forunusual environments，Current Opinion in Biotechnology 4450-455(1993)；Sieber等人，Nature Biotechnology，19456-460(2001).W.P.C.Stemmer，Nature 370，389-91(1994)；以及I.A.Lorimer，I.Pastan，Nucleic Acids Res.23，3067-8(1995)。關于這些方法中的一些方法的其它細節(jié)可見于Methods in Enzymology第154卷中，所述文獻也描述各種誘變方法對故障查找問題的有效控制。
本發(fā)明中描述的方法和組合物也包括使用真核宿主細胞、非真核宿主細胞以及生物體通過正交tRNA/RS對在活體內并入非天然氨基酸。用對應于本發(fā)明中描述的多肽的多核苷酸或包括對應于本發(fā)明中描述的多肽的多核苷酸的構筑體(包括(但不限于)對應于本發(fā)明中描述的多肽的載體，其可為(例如)克隆載體或表達載體)使宿主細胞遺傳工程化(包括(但不限于)轉化、轉導或轉染)。舉例來說，將正交tRNA、正交tRNA合成酶和欲衍生的蛋白質的編碼區(qū)域操作性連接到在所需宿主細胞中起作用的基因表達控制元件上。載體可呈(例如)質粒、科斯質粒(cosmid)、噬菌體、細菌、病毒、裸露多核苷酸或接合多核苷酸的形式。通過特定方法將載體引入細胞和/或微生物中，所述方法包括電穿孔(Fromm等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82，5824(1985))、通過病毒載體感染、由具有核酸的小粒子在小珠粒或粒子的基質內或在表面上高速彈道滲透(Klein等人，Nature 327，70-73(1987))等。
可在經改良適于諸如篩檢步驟、活化啟動子或選擇轉化株等活動的常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)經工程化設計的宿主細胞?？梢暻闆r將這些細胞培養(yǎng)到轉基因生物體中。包括(但不限于)關于細胞分離和培養(yǎng)(例如，關于后續(xù)核酸分離)的其它有用參考文獻包括Freshney(1994)Culture of Animal Cells，a Manual of BasicTechnique，第3版，Wiley-Liss，New York以及其中引用的參考文獻；Payne等人，(1992)Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons，Inc.NewYork，NY；Gamborg和Phillips(編)(1995)Plant Cell，Tissue and Organ Culture；Fundamental Methods Springer Lab Manual，Springer-Verlag(Berlin Heidelberg NewYork)以及Atlas和Parks(編)The Handbook of Microbiological Media(1993)CRCPress，Boca Raton，FL。
可使用將標靶核酸引入細胞中的數種方法，其中任一方法都可用于本發(fā)明中描述的方法和組合物中。這些方法包括將受體細胞與含有DNA的細菌原生質體融合、電穿孔、基因槍法(projectile bombardment)和經病毒載體(在本發(fā)明中進一步論述)感染等。細菌細胞可用于擴增含有對應于本發(fā)明中描述的多肽的DNA構筑體的質粒的數目。使細菌生長到對數生長期并且可通過多種方法分離細菌內的質粒(例如參見Sambrook)。另外，可購得眾多試劑盒以用于從細菌中純化質粒(例如參見EasyPrepTM、FlexiPrepTM，兩者都來自Pharmacia Biotech；StrataCleanTM，來自Stratagene；以及QIAprepTM，來自Qiagen)。然后，進一步操縱經分離并純化的質粒以產生其它質粒，將其用于轉染細胞或并入用于感染生物體的相關載體中。典型載體含有轉錄和翻譯終止子、轉錄和翻譯起始序列，以及適用于調節(jié)特定標靶核酸的表達的啟動子。載體視情況包含通用表達盒，其含有至少一個獨立的終止子序列、允許所述表達盒在真核細胞或原核細胞或兩者中復制的序列(包括(但不限于)穿梭載體)以及用于原核系統與真核系統兩者的選擇標記。載體適于在原核細胞、真核細胞或優(yōu)選兩者中復制和整合。參見Gillam和Smith，Gene 881(1979)；Roberts等人，Nature，328731(1987)；Schneider，E.等人，Protein Expr.Purif.6(1)10-14(1995)；Ausubel，Sambrook，Berger(都同上文)。適用于克隆的細菌和噬菌體的目錄由(例如)ATCC提供，例如，ATCC出版的The ATCC Catalogue of bacteria and bacteriophage(1992)Gherna等人(編)。用于測序、克隆和分子生物學的其它方面的其它基本程序以及潛在理論考慮因素也見于Watson等人，(1992)Recombinant DNA，第2版，Scientific American Books，NY中。另外，基本上任何核酸(以及實質上任何經標記核酸，無論標準或非標準)都可從多種商業(yè)來源的任一個定制或標準定購，這些商業(yè)來源諸如the MidlandCertified Reagent Company(Midland，TX mcrc.com)、The Great American GeneCompany(Ramona，CA，通過萬維網以genco.com獲得)、ExpressGen Inc.(Chicago，IL，通過萬維網以expressgen.com獲得)、Operon Technologies Inc.(Alameda，CA)以及許多其它來源。
B.選擇密碼子 本發(fā)明中描述的方法和組合物中所涵蓋的選擇密碼子擴充蛋白質生物合成機制的遺傳密碼子框架。舉例來說，選擇密碼子包括(但不限于)獨特三堿基密碼子、無義密碼子(諸如終止密碼子，包括(但不限于)琥珀密碼子(UAG)或蛋白石密碼子(UGA))、非天然密碼子、四個或四個以上堿基的密碼子、稀有密碼子等。可引入所需基因或多核苷酸中的選擇密碼子的數目范圍廣泛，包括(但不限于)在編碼所關注的多肽的至少一部分的單一多核苷酸中存在一個或一個以上、兩個或兩個以上、三個或三個以上、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個或10個以上選擇密碼子。
在一個實施例中，所述方法涉及使用作為終止密碼子的選擇密碼子以在活體內并入一個或一個以上的非天然氨基酸。舉例來說，產生識別終止密碼子(包括(但不限于)UAG)的O-tRNA并且通過O-RS用所需非天然氨基酸使O-tRNA氨?；Ｌ烊淮嬖谒拗鞯陌滨；?tRNA合成酶無法識別此O-tRNA?？墒褂枚c誘變在所關注的多肽中的所關注位點處引入終止密碼子(包括(但不限于)UAG)。例如，參見Sayers，J.R.等人，(1988)，5′，3′Exonuclease in phosphorothioate-basedoligomicleotide-directed mutagenesis.Nucleic Acids Res.，16(3)791-802。當在活體內組合O-RS、O-tRNA和編碼所關注的多肽的核酸時，回應UAG密碼子而并入非天然氨基酸以得到在指定位置處含有非天然氨基酸的多肽。
也可利用稀有密碼子來編碼非天然氨基酸。舉例來說，當活體外蛋白質合成反應中的精氨酸濃度降低時，證明稀有精氨酸密碼子AGG有效用于通過經丙氨酸?；暮铣蓆RNA插入Ala。例如參見Ma等人，Biochemistry.327939(1993)。在這種情況下，合成tRNA與作為大腸桿菌中的次要物質存在的天然存在tRNAArg競爭。一些生物體并不使用所有三聯體密碼子。已利用藤黃微球菌(Micrococcus luteus)中的未指定密碼子AGA在活體外轉錄/翻譯提取物中插入氨基酸。例如參見Kowal和Oliver，Nucl.Acid.Res.，254685(1997)。在一個實施例中，可產生本發(fā)明中描述的組合物和方法的組分以在活體內使用這些稀有密碼子。
活體內并入非天然氨基酸可在不顯著干擾真核宿主細胞的情況下進行。舉例來說，因為UAG密碼子的抑制效率取決于O-tRNA(包括(但不限于)琥珀抑制tRNA)與真核釋放因子(包括(但不限于)eRF)(其結合終止密碼子，并起始正在生長的肽從核糖體中的釋放)之間的競爭，所以抑制效率可通過(包括，但不限于)增加O-tRNA和/或抑制tRNA的表達水平來進行調節(jié)。
選擇密碼子還包含延長密碼子，包括(但不限于)四個或四個以上堿基的密碼子，諸如四個、五個、六個或六個以上堿基的密碼子。四堿基密碼子的實施例包括(但不限于)AGGA、CUAG、UAGA、CCCU等。五堿基密碼子的實施例包括(但不限于)AGGAC、CCCCU、CCCUC、CUAGA、CUACU、UAGGC等。本發(fā)明中描述的方法和組合物的特征包括使用基于移碼抑制(frameshiftsuppression)的延長密碼子。四個或四個以上堿基的密碼子可將(包括，但不限于)一個或一個以上非天然氨基酸插入同一個蛋白質中。舉例來說，在存在具有反密碼子環(huán)(例如，具有至少8-10nt的反密碼子環(huán))的突變O-tRNA(包括(但不限于)特定移碼抑制tRNA)的情況下，將四個或四個以上堿基的密碼子讀作單一氨基酸。在其它實施例中，反密碼子環(huán)可解碼(包括，但不限于)至少一個四堿基密碼子、至少一個五堿基密碼子或至少一個六堿基密碼子或更多堿基的密碼子。因為存在256種可能的四堿基密碼子，所以可使用四個或四個以上堿基的密碼子在同一細胞中編碼多個非天然氨基酸。參見Anderson等人，(2002)Exploring the Limits of Codon and Anticodon Size，Chemistry and Biology，9237-244；Magliery，(2001)Expanding the Genetic CodeSelection of EfficientSuppressors of Four-base Codons and Identification of″Shifty″Four-base Codonswith a Library Approach in Escherichia coli.J.Mol.Biol.307755-769。
舉例來說，已經使用活體外生物合成方法利用四堿基密碼子將非天然氨基酸并入蛋白質中。例如參見Ma等人，(1993)Biochemistry，327939-7945；和Hohsaka等人，(1999)J.Am.Chem.Soc，12134-40。使用CGGG和AGGU，從而在活體外利用兩個化學?；囊拼a抑制tRNA同時將2-萘基丙氨酸和賴氨酸的NBD衍生物并入抗生物素蛋白鏈菌素中。例如參見Hohsaka等人，(1999)J.Am.Chem.Soc，12112194-12195。在活體內研究中，Moore等人檢查具有NCUA反密碼子的tRNALeu衍生物抑制UAGN密碼子(N可為U、A、G或C)的能力，并且發(fā)現四聯體UAGA可通過具有UCUA反密碼子的tRNALeu以13％到26％的效率解碼，其中在0或-1框架中極少解碼。參見Moore等人，(2000)J.Mol.Biol.，298195-205。在一個實施例中，可在本發(fā)明中描述的方法和組合物中使用基于稀有密碼子或無義密碼子的延長密碼子，其可減少其它不合需要的位點處的錯義通讀和移碼抑制。
對于給定系統來說，選擇密碼子也可包括一個天然三堿基密碼子，其中內源性系統不使用(或很少使用)天然堿基密碼子。舉例來說，這包括缺乏識別天然三堿基密碼子的tRNA的系統，和/或三堿基密碼子為稀有密碼子的系統。
選擇密碼子視情況包括非天然堿基對。這些非天然堿基對進一步擴充現有的遺傳符號系統。一個額外的堿基對使三聯體密碼子的數目從64增加到125。第三堿基對的性質包括穩(wěn)定并具選擇性的堿基配對、通過聚合酶以高保真性有效地酶促并入DNA中以及在合成新的非天然堿基對之后有效的持續(xù)引物延伸。對可適于方法和組合物的非天然堿基對的描述包括(例如)Hirao等人，(2002)Anunnatural base pair for incorporating amino acid analogues into protein，NatureBiotechnology，20177-182，并且還參見Wu，Y.等人(2002)J.Am.Chem.Soc.12414626-14630。其它相關公開案列于本發(fā)明中。
對于活體內使用來說，非天然核苷是膜可滲透的并且經磷酸化以形成相應的三磷酸鹽。另外，增加的遺傳信息為穩(wěn)定的并且不受細胞酶破壞。Benner和其它人先前的工作利用不同于典型Watson-Crick配對的氫鍵結模式，其中最值得注意的實施例是iso-C:iso-G配對。例如參見Switzer等人，(1989)J.Am.Chem.Soc，1118322-8322；和Piccirilli等人，(1990)Nature，34333-37；Kool，(2000)Curr.Opin.Chem.Biol.，4602-608。這些堿基通常在一定程度上與天然堿基錯配并且不能酶促復制。Kool和同事證實堿基之間的疏水性堆積相互作用可代替氫鍵結來驅動堿基對的形成。參見Kool，(2000)Curr.Opin.Chem.Biol.，4602-608；以及Guckian和Kool，(1998)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，36(24)2825-2828。在開發(fā)滿足所有上述要求的非天然堿基對的工作中，Schultz、Romesberg和同事已系統地合成并研究了一系列非天然疏水性堿基。發(fā)現PICS:PICS自身配對比天然堿基對穩(wěn)定，并且可通過大腸桿菌DNA聚合酶I的克列諾片段(Klenow fragment)(KF)有效地并入DNA中。例如參見McMinn等人，(1999)J.Am.Chem.Soc，12111585-11586；和Ogawa等人，(2000)J.Am.Chem.Soc，1223274-3278?？赏ㄟ^KF以足以用于生物功能的效率和選擇性合成3MN3MN自身配對。例如參見Ogawa等人，(2000)J.Am.Chem.Soc，1228803-8804。然而，這兩種堿基都充當用于進一步復制的鏈終止子。突變DNA聚合酶近來已得到發(fā)展，其可用于復制PICS自身配對。另外，也可復制7AI自身配對。例如參見Tae等人，(2001)J.Am.Chem.Soc，1237439-7440。也已開發(fā)出在結合Cu(II)后形成穩(wěn)定配對的新穎金屬堿基對Dipic:Py。參見Meggers等人，(2000)J.Am.Chem.Soc，12210714-10715。因為延長密碼子和非天然密碼子固有地與天然密碼子正交，所以本發(fā)明中描述的非天然氨基酸方法可利用這一性質來產生正交tRNA以供其使用。
也可使用翻譯旁路系統(translational bypassing system)將非天然氨基酸并入所需多肽中。在翻譯旁路系統中，將大序列并入基因中，但并未將其翻譯成蛋白質。所述序列含有充當誘導核糖體跳過所述序列并在插入下游重新開始翻譯的提示的結構。
在某些實施例中，本發(fā)明中描述的方法和/或組合物中所關注的蛋白質或多肽(或其部分)是由核酸編碼。通常，核酸包含至少一個選擇密碼子、至少兩個選擇密碼子、至少三個選擇密碼子、至少四個選擇密碼子、至少五個選擇密碼子、至少六個選擇密碼子、至少七個選擇密碼子、至少八個選擇密碼子、至少九個選擇密碼子、十個或十個以上的選擇密碼子。
可在“Mutagenesis and Other Molecular Biology Techniques”指導下使用(例如)本發(fā)明中描述的方法對編碼所關注的蛋白質或多肽的基因進行誘變，從而使其包括(例如)一個或一個以上的選擇密碼子以并入非天然氨基酸。舉例來說，對所關注的蛋白質的核酸進行誘變以使其包括一個或一個以上的選擇密碼子，從而提供一個或一個以上的非天然氨基酸的并入。本發(fā)明中描述的方法和組合物包括例如包括至少一個非天然氨基酸的任何蛋白質的任何這種變異體(包括(但不限于)突變體)形式。類似地，本發(fā)明中描述的方法和組合物包括相應核酸，即，具有一個或一個以上編碼一個或一個以上非天然氨基酸或允許所述非天然氨基酸的活體內并入的選擇密碼子的任何核酸。
可容易地使編碼所關注的多肽(包括(僅舉例來說)GH多肽)的核酸分子突變以在多肽的任何所需位置處引入半胱氨酸。半胱氨酸廣泛用于將反應性分子、水溶性聚合物、蛋白質或多種其它分子引入所關注的蛋白質上。適于將半胱氨酸并入多肽的所需位置中的方法包括美國專利第6,608,183號(其是以引用的方式并入本發(fā)明中以揭示前述揭示內容)中所述的方法，以及誘變技術。這種引入并利用半胱氨酸的技術的使用可與本發(fā)明中描述的引入并利用非天然氨基酸的技術聯合使用。
VIII.包含非天然氨基酸的多肽的活體內產生 為方便起見，這部分中描述的包含非天然氨基酸的多肽的活體內產生已經一般性描述和/或用特定實施例加以描述。然而，這部分中所描述的包含非天然氨基酸的多肽的活體內產生不應僅限于這部分中所提供的一般描述或特定實施例，而是這部分中所描述的包含非天然氨基酸的多肽的活體內產生同樣良好適用于處于式I-XV的范圍內的所有化合物，包括處于本發(fā)明中的說明書、權利要求以及圖式中所描述的式I-XV的范圍內的任何子式或特定化合物。
可使用經修飾以添加或取代在天然存在系統中未編碼的氨基酸的tRNA和tRNA合成酶在活體內產生本發(fā)明中描述的多肽。
產生使用在天然存在系統中未編碼的氨基酸的tRNA和tRNA合成酶的方法描述于(例如)標題為“In vivo incorporation of unnatural amino acids”的美國專利第7,045,337號和標題為“Methods and compositions for the production oforthogonal tRNA-aminoacyl tRNA synthetases pairs”的美國專利第7,083,970號中，所述專利都是以引用的方式并入本發(fā)明中。這些方法涉及產生獨立于翻譯系統的內源性(且因此有時稱作“正交”)合成酶和tRNA起作用的翻譯機制。在一個實施例中，翻譯系統包含編碼多肽的多核苷酸；所述多核苷酸可為從相應DNA轉錄的mRNA，或所述mRNA可從RNA病毒載體中產生；此外，所述多核苷酸包含對應于并入非天然氨基酸的預先指定位點的選擇密碼子。翻譯系統進一步包含包括非天然氨基酸的tRNA，其中所述tRNA對前述選擇密碼子具有特異性；在其它實施例中，非天然氨基酸經氨?；?。在其它或另外的實施例中，翻譯系統包含對tRNA具有特異性的氨?；铣擅福⑶以谄渌蛄硗獾膶嵤├校g系統包含正交tRNA和正交氨?；鵷RNA合成酶。在其它或另外的實施例中，翻譯系統包含以下各物中的至少一個包含前述多核苷酸的質粒(通常呈DNA的形式)、包含前述多核苷酸的基因組DNA(通常呈DNA的形式)或前述多核苷酸已整合于其中的基因組DNA(在其它實施例中，所述整合為穩(wěn)定整合)。在翻譯系統的其它或另外的實施例中，選擇密碼子是選自由琥珀密碼子、赭石密碼子、蛋白石密碼子、獨特密碼子、稀有密碼子、非天然密碼子、五堿基密碼子和四堿基密碼子組成的群組。在翻譯系統的其它或另外的實施例中，tRNA為抑制tRNA。在其它或另外的實施例中，非天然氨基酸多肽是由核糖體合成。
在其它或另外的實施例中，翻譯系統包含正交tRNA(O-tRNA)和正交氨?；鵷RNA合成酶(O-RS)。通常，在翻譯系統中O-RS優(yōu)先用至少一個非天然氨基酸使O-tRNA氨?；⑶襉-tRNA識別至少一個由系統中的其它tRNA無法識別的選擇密碼子。為回應所編碼的選擇密碼子，翻譯系統因此將非天然氨基酸插入系統中所產生的多肽中，從而將非天然氨基酸“取代”到所編碼的多肽中的位置中。
用于將特定合成氨基酸插入多肽中的多種正交tRNA和氨?；鵷RNA合成酶通常適用于本發(fā)明中描述的方法中以產生本發(fā)明中描述的非天然氨基酸多肽。舉例來說，酮基特異性O-tRNA/氨?；?tRNA合成酶是描述于Wang，L.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100(1)56-61(2003)和Zhang，Z.等人，Biochem.42(22)6735-6746(2003)中。例示性O-RS或其部分是由多核苷酸序列編碼并且包括美國專利第7,045,337號和第7,083,970號(其各自是以全文引用的方式并入本發(fā)明中)中所揭示的氨基酸序列。與O-RS一起使用的相應O-tRNA分子也描述于美國專利第7,045,337號和第7,083,970號中，所述專利是以全文引用的方式并入本發(fā)明中。另外，Mehl等人，J.Am.Chem.Soc.2003；125935-939以及Santoro等人，Nature Biotechnology 2002年10月；201044-1048(其是以全文引用的方式并入本發(fā)明中)論述篩檢方法以及用于將對氨基苯丙氨酸并入多肽中的氨?；鵷RNA合成酶和tRNA分子。
適用于本發(fā)明中描述的方法中的例示性O-tRNA序列包括(但不限于)如美國專利第7,045,337號(其是以引用的方式并入本發(fā)明中)中所揭示的核苷酸序列SEQ ID NO1或2。對特定非天然氨基酸具有特異性的O-tRNA/氨酰基-tRNA合成酶對的其它實施例描述于美國專利第7,083,970號中，所述專利是以全文引用的方式并入本發(fā)明中。在釀酒酵母中結合含酮基氨基酸與含疊氮基氨基酸兩者的O-RS和O-tRNA描述于Chin，J.W.等人，Science 301964-967(2003)中。
O-tRNA/氨?；?tRNA合成酶的使用涉及選擇編碼非天然氨基酸的特異性密碼子。盡管可使用任何密碼子，但通常需要選擇很少或從不在表達O-tRNA/氨酰基-tRNA合成酶的細胞中使用的密碼子。僅舉例來說，例示性密碼子包括諸如終止密碼子(琥珀密碼子、赭石密碼子和蛋白石密碼子)等無義密碼子、四個或四個以上堿基的密碼子以及很少使用或不使用的其它天然三堿基密碼子。
可使用誘變方法(包括(但不限于)定點誘變、盒式誘變、限制選擇誘變等)將特異性選擇密碼子引入多核苷酸編碼序列中的適當位置中。
產生可用于并入非天然氨基酸的蛋白質生物合成機制的組分(諸如O-RS、O-tRNA和正交O-tRNA/O-RS對)的方法描述于Wang，L.等人，Science 292498-500(2001)；Chin，J.W.等人，J.Am.Chem.Soc.1249026-9027(2002)；Zhang，Z.等人，Biochemistry 426735-6746(2003)中。用于活體內并入非天然氨基酸的方法和組合物描述于美國專利第7,045,337號中，所述專利是以全文引用的方式并入本發(fā)明中。用于選擇用于生物體的活體內翻譯系統中的正交tRNA-tRNA合成酶對的方法也描述于美國專利第7,045,337號和第7,083,970號中，所述專利都是以全文引用的方式并入本發(fā)明中。另外，標題為“Site Specific Incorporation of Keto AminoAcids into proteins”的PCT公開案第WO 04/035743號(其是以全文引用的方式并入)描述用于并入酮基氨基酸的正交RS和tRNA對。標題為“Expanding theEukaryotic Genetic Code”的PCT公開案第WO 04/094593號(其是以全文引用的方式并入本發(fā)明中)描述用于將非天然編碼的氨基酸并入真核宿主細胞中的正交RS和tRNA對。
用于產生至少一種重組正交氨?；?tRNA合成酶(O-RS)的方法包含(a)產生來源于來自第一生物體的至少一種氨?；?tRNA合成酶(RS)的(視情況突變體)RS庫，所述第一生物體包括(但不限于)原核生物體，僅舉例來說，詹氏甲烷球菌、熱自養(yǎng)甲烷桿菌、嗜鹽菌、大腸桿菌、超嗜熱古菌、強烈熾熱球菌、極端嗜熱古菌、嗜熱泉生古細菌、嗜熱棲熱菌等，或真核生物體；(b)選擇(和/或篩檢)RS(視情況突變體RS)庫中在非天然氨基酸和天然氨基酸的存在下氨?；籺RNA(O-tRNA)的成員，從而提供活性(視情況突變體)RS的池；和/或(c)選擇(視情況通過陰性選擇)所述池中在不存在非天然氨基酸的情況下優(yōu)先氨?；疧-tRNA的活性RS(包括(但不限于)突變體RS)，從而提供至少一種重組O-RS；其中至少一種重組O-RS優(yōu)先用非天然氨基酸使O-tRNA氨?；?br> 在一個實施例中，RS為非活性RS?？赏ㄟ^使活性RS突變來產生非活性RS。僅舉例來說，可通過使至少約1個、至少約2個、至少約3個、至少約4個、至少約5個、至少約6個或至少約10個或10個以上的氨基酸突變?yōu)椴煌被?包括(但不限于)丙氨酸)來產生非活性RS。
可使用各種技術來產生突變體RS庫，所述技術包括(但不限于)根據蛋白質三維RS結構的合理設計，或隨機或合理設計技術中RS核苷酸的誘變。僅舉例來說，可通過定點突變、隨機突變、產生多樣性的重組突變、嵌合構筑體、合理設計以及本發(fā)明中描述的其它方法來產生突變體RS。
在一個實施例中，選擇(和/或篩檢)RS(視情況突變體RS)庫中的活性成員(包括(但不限于)在非天然氨基酸和天然氨基酸的存在下氨?；籺RNA(O-tRNA)的成員)包括(但不限于)將陽性選擇或篩檢標記(包括(但不限于)抗生素抗性基因等)和(視情況突變體)RS庫引入多個細胞中，其中陽性選擇和/或篩檢標記包含至少一個選擇密碼子，其包括(但不限于)琥珀密碼子、赭石密碼子、蛋白石密碼子、獨特密碼子、稀有密碼子、非天然密碼子、五堿基密碼子以及四堿基密碼子；在選擇劑存在下使所述多個細胞生長；通過抑制陽性選擇或篩檢標記中的至少一個選擇密碼子來鑒別在選擇和/或篩檢劑的存在下存活(或展示特異性反應)的細胞，從而提供含有活性(視情況突變體)RS池的陽性選擇細胞的子集。視情況，選擇和/或篩檢劑濃度可改變。
一方面，陽性選擇標記為氯霉素乙?；D移酶(CAT)基因，并且選擇密碼子為CAT基因中的琥珀終止密碼子。其它選擇標記包括(但不限于)新霉素抗性基因、殺稻瘟菌素抗性基因、潮霉素抗性基因或任何其它可用的抗性基因。視情況，陽性選擇標記為β-內酰胺酶基因，并且選擇密碼子為β-內酰胺酶基因中的琥珀終止密碼子。另一方面，陽性篩檢標記包含熒光或發(fā)光篩檢標記或基于親和性的篩檢標記(包括(但不限于)細胞表面標記)。
在一個實施例中，陰性選擇或篩檢池中的活性RS(視情況突變體)(包括(但不限于)在不存在非天然氨基酸的情況下優(yōu)先氨酰基化O-tRNA的活性RS)包括(但不限于)利用來自陽性選擇或篩檢的活性(視情況突變體)RS池將陰性選擇或篩檢標記引入第二生物體的多個細胞中，其中陰性選擇或篩檢標記包含至少一個選擇密碼子(包括(但不限于)抗生素抗性基因，其包括(但不限于)氯霉素乙酰基轉移酶(CAT)基因)；并且，鑒別在補充有非天然氨基酸以及篩檢或選擇劑的第一培養(yǎng)基中存活或展示特異性篩檢反應，但在未補充有非天然氨基酸以及選擇或篩檢劑的第二培養(yǎng)基中不能存活或不展示特異性反應的細胞，從而提供具有至少一種重組O-RS的存活細胞或篩檢細胞。僅舉例來說，CAT鑒別方案視情況充當確定適當O-RS重組體的陽性選擇和/或陰性篩檢。例如，視情況在含有具有或不具有一個或一個以上非天然氨基酸的CAT(其包含至少一個選擇密碼子)的生長培養(yǎng)盤上復制克隆池。因此，認為僅在含有非天然氨基酸的培養(yǎng)盤上生長的菌落含有重組O-RS。一方面，選擇(和/或篩檢)劑的濃度有所改變。在一些方面，第一生物體與第二生物體不同。因此，第一生物體和/或第二生物體視情況包含原核生物、真核生物、哺乳動物、大腸桿菌、真菌、酵母、古細菌、真細菌、植物、昆蟲、原生生物等。在其它實施例中，篩檢標記包含熒光或發(fā)光篩檢標記或基于親和性的篩檢標記。
在另一個實施例中，篩檢或選擇(包括(但不限于)陰性選擇)池中的活性(視情況突變體)RS包括(但不限于)分離來自陽性選擇步驟(b)的活性突變體RS的池；將陰性選擇或篩檢標記(其中陰性選擇或篩檢標記包含至少一個選擇密碼子(包括(但不限于)毒性標記基因，其包括(但不限于)核糖核酸酶barnase基因，所述基因包含至少一個選擇密碼子))和活性(視情況突變體)RS的池引入第二生物體的多個細胞中；并且鑒別在未補充非天然氨基酸的第一培養(yǎng)基中存活或展示特異性篩檢反應，但在補充有非天然氨基酸的第二培養(yǎng)基中不能存活或不展示特異性篩檢反應的細胞，從而提供具有至少一種重組O-RS的存活細胞或篩檢細胞，其中至少一種重組O-RS對非天然氨基酸具有特異性。一方面，至少一個選擇密碼子包含約兩個或兩個以上的選擇密碼子。這些實施例視情況可包括其中至少一個選擇密碼子包含兩個或兩個以上的選擇密碼子，并且其中第一生物體與第二生物體不同(包括(但不限于)，每一生物體視情況為(包括，但不限于)原核生物、真核生物、哺乳動物、大腸桿菌、真菌、酵母、古細菌、真細菌、植物、昆蟲、原生生物等)。此外，一些方面包括其中陰性選擇標記包含核糖核酸酶barnase基因(其包含至少一個選擇密碼子)。其它方面包括其中篩檢標記視情況包含熒光或發(fā)光篩檢標記或基于親和性的篩檢標記。在本發(fā)明中的實施例中，篩檢和/或選擇視情況包括篩檢和/或選擇嚴格度的變化。
在另一個實施例中，產生至少一種重組正交氨?；?tRNA合成酶(O-RS)的方法可進一步包含(d)分離至少一種重組O-RS；(e)產生來源于至少一種重組O-RS的第二組O-RS(視情況突變)；以及(f)重復步驟(b)和(c)，直到獲得包含優(yōu)先氨?；疧-tRNA的能力的突變O-RS。視情況，重復步驟(d)-(f)(包括，但不限于)至少約兩次。一方面，來源于至少一種重組O-RS的第二組突變O-RS可通過誘變(包括(但不限于)隨機誘變、定點誘變、重組或其組合)產生。
在上述方法中，選擇/篩檢步驟(包括(但不限于)陽性選擇/篩檢步驟(b)、陰性選擇/篩檢步驟(c)或陽性和陰性選擇/篩檢步驟(b)和(c)兩者)的嚴格度視情況包括改變選擇/篩檢嚴格度。在另一個實施例中，陽性選擇/篩檢步驟(b)、陰性選擇/篩檢步驟(c)或陽性和陰性選擇/篩檢步驟(b)和(c)兩者包含使用報導基因，其中所述報導基因是由熒光活化細胞分選技術(FACS)進行檢測或其中所述報導基因是通過發(fā)光進行檢測。視情況，在細胞表面、噬菌體呈現等上呈現報導基因，并且根據涉及非天然氨基酸或類似物的親和性或催化活性來選擇報導基因。在一個實施例中，將突變合成酶呈現在細胞表面、噬菌體呈現等上。
產生重組正交tRNA(O-tRNA)的方法包括(但不限于)(a)產生來源于至少一種tRNA(包括(但不限于)來自第一生物體的抑制tRNA)的突變體tRNA的庫；(b)選擇(包括(但不限于)陰性選擇)或篩檢在來自第一生物體的RS不存在的情況下由來自第二生物體的氨?；?tRNA合成酶(RS)氨?；?視情況突變體)tRNA的庫，從而提供tRNA(視情況突變體)的池；以及(c)選擇或篩檢tRNA(視情況突變體)的池中由引入的正交RS(O-RS)氨?；某蓡T，從而提供至少一種重組O-tRNA；其中所述至少一種重組O-tRNA識別選擇密碼子并且無法由來自第二生物體的RS有效識別，并且由O-RS優(yōu)先氨?；Ｔ谝恍嵤├?，至少一種tRNA為抑制tRNA和/或包含天然和/或非天然堿基的獨特三堿基密碼子，或為無義密碼子、稀有密碼子、非天然密碼子、包含至少4個堿基的密碼子、琥珀密碼子、赭石密碼子或蛋白石終止密碼子。在一個實施例中，重組O-tRNA具有正交性的改良。應了解，在一些實施例中，在無需修飾的情況下視情況將O-tRNA從第二生物體引入到第一生物體中。在多個實施例中，第一生物體與第二生物體相同或不同并且視情況選自(包括，但不限于)原核生物(包括(但不限于)詹氏甲烷球菌、熱自養(yǎng)甲烷桿菌、大腸桿菌、嗜鹽菌等)、真核生物、哺乳動物、真菌、酵母、古細菌、真細菌、植物、昆蟲、原生生物等。另外，重組tRNA視情況經非天然氨基酸氨?；渲蟹翘烊话被崾翘烊坏鼗蛲ㄟ^遺傳操縱在活體內生物合成。視情況將非天然氨基酸加入到至少第一生物體或第二生物體的生長培養(yǎng)基中，其中所述非天然氨基酸能夠達到適當細胞內濃度以允許并入非天然氨基酸多肽中。
一方面，選擇(包括(但不限于)陰性選擇)或篩檢庫中由氨酰基-tRNA合成酶(步驟(b))氨?；?視情況突變體)tRNA包括將毒性標記基因(其中所述毒性標記基因包含至少一個選擇密碼子(或導致產生毒性劑或靜態(tài)劑的基因或生物體必需的基因，其中這種標記基因包含至少一個選擇密碼子))和(視情況突變體)tRNA的庫引入來自第二生物體的多個細胞中；以及，選擇存活細胞，其中所述存活細胞含有包含至少一種正交tRNA或非功能性tRNA的(視情況突變體)tRNA的池。舉例來說，可通過使用比較比率細胞密度檢定來選擇存活細胞。
另一方面，毒性標記基因可包括兩個或兩個以上的選擇密碼子。在本發(fā)明中描述的方法的另一個實施例中，毒性標記基因為核糖核酸酶barnase基因，其中所述核糖核酸酶barnase基因包含至少一個琥珀密碼子。視情況，核糖核酸酶barnase基因可包括兩個或兩個以上的琥珀密碼子。
在另一個實施例中，選擇或篩檢(視情況突變體)tRNA的池中由引入的正交RS(O-RS)氨?；某蓡T可包括將陽性選擇或篩檢標記基因(其中所述陽性標記基因包含藥物抗性基因(包括(但不限于)β-內酰胺酶基因，其包含至少一個選擇密碼子，諸如至少一個琥珀終止密碼子)或生物體必需的基因，或使得毒性劑解毒的基因)以及O-RS和(視情況突變體)tRNA的池引入來自第二生物體的多個細胞中；以及，鑒別在選擇或篩檢劑(包括(但不限于)抗生素)的存在下生長的存活細胞或篩檢細胞，從而提供具有至少一種重組tRNA的細胞池，其中所述至少一種重組tRNA是由O-RS氨?；⑶一貞鲋辽僖粋€選擇密碼子而將氨基酸插入由陽性標記基因編碼的翻譯產物中。在另一個實施例中，選擇和/或篩檢劑的濃度存在改變。
提供產生特異性O-tRNA/O-RS對的方法。方法包括(但不限于)(a)產生來源于來自第一生物體的至少一種tRNA的突變體tRNA的庫；(b)陰性選擇或篩檢庫中在來自第一生物體的RS不存在的情況下由來自第二生物體的氨酰基-tRNA合成酶(RS)氨?；?視情況突變體)tRNA，從而提供(視情況突變體)tRNA的池；(c)選擇或篩檢(視情況突變體)tRNA的池中由引入的正交RS(O-RS)氨?；某蓡T，從而提供至少一種重組O-tRNA。所述至少一種重組O-tRNA識別選擇密碼子并且無法由來自第二生物體的RS有效識別，并且由O-RS優(yōu)先氨?；?。所述方法也包括(d)產生來源于來自第三生物體的至少一種氨?；?tRNA合成酶(RS)的(視情況突變體)RS的庫；(e)選擇或篩檢突變體RS的庫中在非天然氨基酸和天然氨基酸的存在下優(yōu)先氨酰基化所述至少一種重組O-tRNA的成員，從而提供活性(視情況突變體)RS的池；以及(f)陰性選擇或篩檢池中在不存在非天然氨基酸的情況下優(yōu)先氨酰基化所述至少一種重組O-tRNA的活性(視情況突變體)RS，從而提供至少一種特異性O-tRNA/O-RS對，其中所述至少一種特異性O-tRNA/O-RS對包含至少一種對非天然氨基酸具有特異性的重組O-RS和至少一種重組O-tRNA。由本發(fā)明中描述的方法產生的特異性O-tRNA/O-RS對包括在本發(fā)明中描述的范圍和方法中。舉例來說，特異性O-tRNA/O-RS對可包括(包括，但不限于)mutRNATyr-mutTyrRS對(諸如mutRNATyr-SS12TyrRS對)、mutRNALeu-mutLeuRS對、mutRNAThr-mutThrRS對、mutRNAGlu-mutGluRS對等。另外，這些方法包括其中第一生物體與第三生物體相同(包括(但不限于)詹氏甲烷球菌)。
用于選擇用于第二生物體的活體內翻譯系統中的正交tRNA-tRNA合成酶對的方法也包括在本發(fā)明中描述的方法中。所述方法包括(但不限于)將標記基因、tRNA以及從第一生物體分離或來源于第一生物體的氨?；?tRNA合成酶(RS)引入來自第二生物體的第一組細胞中；將標記基因和tRNA引入來自第二生物體的雙重復細胞組中；以及，選擇不能在雙重復細胞組中存活的第一組中的存活細胞或篩檢展示特異性篩檢反應而在雙重復細胞組中不能產生這種反應的細胞，其中第一組和雙重復細胞組是在選擇或篩檢劑存在下生長，其中存活細胞或篩檢細胞包含用于第二生物體的活體內翻譯系統中的正交tRNA-tRNA合成酶對。在一個實施例中，比較以及選擇或篩檢包括活體內互補檢定。選擇或篩檢劑的濃度可改變。
本發(fā)明中描述的生物體包含多種生物體以及多種組合。在一個實施例中，生物體視情況為原核生物體，其包括(但不限于)詹氏甲烷球菌、熱自養(yǎng)甲烷桿菌、嗜鹽菌、大腸桿菌、超嗜熱古菌、強烈熾熱球菌、極端嗜熱古菌、嗜熱泉生古細菌、嗜熱棲熱菌等?；蛘?，生物體為真核生物體，其包括(但不限于)植物(包括(但不限于)復雜植物，諸如單子葉植物或雙子葉植物)、藻類、原生生物、真菌(包括(但不限于)酵母等)、動物(包括(但不限于)哺乳動物、昆蟲、節(jié)肢動物等)等。
A.在非真核細胞和真核細胞中的表達 這部分中所揭示的技術可應用于本發(fā)明中描述的非天然氨基酸多肽的非真核細胞和真核細胞中的表達。所述表達系統進一步描述于美國專利申請案第號中。
如本發(fā)明中所述的真核宿主細胞或非真核宿主細胞提供合成較大適用量的包含非天然氨基酸的多肽的能力。一方面，組合物視情況包括(但不限于)至少10微克、至少50微克、至少75微克、至少100微克、至少200微克、至少250微克、至少500微克、至少1毫克、至少10毫克、至少100毫克、至少1克或1克以上的包含非天然氨基酸的多肽，或可通過活體內多肽產生方法(本發(fā)明中提供關于重組蛋白產生和純化的細節(jié))得到的量的所述多肽。另一方面，多肽視情況以在(包括，但不限于)細胞溶解產物、緩沖液、醫(yī)藥緩沖液或其它液體懸浮液(包括(但不限于)約1nl到約100L或100L以上的體積)中(包括，但不限于)每升至少10微克多肽、每升至少50微克多肽、每升至少75微克多肽、每升至少100微克多肽、每升至少200微克多肽、每升至少250微克多肽、每升至少500微克多肽、每升至少1毫克多肽或每升至少10毫克多肽或每升10毫克以上的多肽的濃度存在于組合物中。在包括至少一個非天然氨基酸的真核細胞中產生大量(包括(但不限于)大于通過其它方法(包括(但不限于)活體外翻譯)得到的典型量)蛋白質是本發(fā)明中描述的方法、技術和組合物的特征。
如本發(fā)明中所述的真核宿主細胞或非真核宿主細胞提供生物合成較大適用量的包含非天然氨基酸的多肽的能力。舉例來說，包含非天然氨基酸的多肽可以在細胞提取物、細胞溶解產物、培養(yǎng)基、緩沖液等中(包括，但不限于)至少10微克/升、至少50微克/升、至少75微克/升、至少100微克/升、至少200微克/升、至少250微克/升或至少500微克/升、至少1毫克/升、至少2毫克/升、至少3毫克/升、至少4毫克/升、至少5毫克/升、至少6毫克/升、至少7毫克/升、至少8毫克/升、至少9毫克/升、至少10毫克/升、至少20毫克/升、30毫克/升、40毫克/升、50毫克/升、60毫克/升、70毫克/升、80毫克/升、90毫克/升、100毫克/升、200毫克/升、300毫克/升、400毫克/升、500毫克/升、600毫克/升、700毫克/升、800毫克/升、900毫克/升、1克/升、5克/升、10克/升或10克/升以上的蛋白質的濃度產生。
這個部分中所揭示的技術可應用于本發(fā)明中描述的非天然氨基酸多肽的表達系統、培養(yǎng)和分離。非天然氨基酸多肽可在任何數目的合適表達系統(包括(但不限于)酵母、昆蟲細胞、哺乳動物細胞和細菌)中表達。
一旦已建立重組宿主細胞株(即，已將表達構筑體引入宿主細胞中并且分離具有適當表達構筑體的宿主細胞)，就在適于產生多肽的條件下培養(yǎng)重組宿主細胞株。重組宿主細胞株的培養(yǎng)方法應取決于所利用的表達構筑體的性質和宿主細胞的身份。通常使用文獻所記載的方法來培養(yǎng)重組宿主細胞株。通常在含有可吸收的碳、氮和無機鹽來源并且視情況含有維生素、氨基酸、生長因子和其它蛋白質培養(yǎng)補充劑的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)重組宿主細胞。用于培養(yǎng)宿主細胞的液體培養(yǎng)基可視情況含有防止不需要的微生物生長的抗生素或抗真菌劑和/或包括(但不限于)用于選擇含有表達載體的宿主細胞的抗生素的化合物。
重組宿主細胞可以分批或連續(xù)形式培養(yǎng)，其中細胞收集(在所需多肽在細胞內積聚的情況下)或培養(yǎng)物上清液的收集為分批或連續(xù)形式。對于原核宿主細胞中的產生來說，優(yōu)選分批培養(yǎng)和細胞收集。如果通過細胞或細胞系表達系統來實現蛋白質表達，那么可以多種模式(包括(但不限于)在整個培養(yǎng)物主體內以懸浮形式生長的非錨定依賴性細胞，或作為需要與固體底物連接以進行增殖的錨定依賴性細胞(即，單層類型的細胞生長))使細胞在活體外增殖。來自連續(xù)建立的細胞系的非錨定依賴性或懸浮液培養(yǎng)物是用于大規(guī)模產生細胞和細胞產物的最廣泛使用的手段。此外，可根據如上所述的多種產生考慮因素來選擇細胞類型和增殖模式。
在一個實施例中，本發(fā)明中描述的非天然氨基酸多肽是在重組系統中表達之后進行純化。可通過多種文獻所記載的方法從宿主細胞或培養(yǎng)基中純化多肽。通常，在細菌宿主細胞中產生的多種多肽可溶性較差或不可溶(呈包涵體的形式)。在一個實施例中，為增大重組產生的多肽的溶解性，利用本發(fā)明中所揭示的方法可容易地在所選擇的多肽中進行氨基酸取代。在不溶性多肽的情況下，所述多肽可通過離心或過濾從宿主細胞溶解產物中收集并且可進一步接著進行細胞的均質化。在可溶性較差的多肽的情況下，可加入包括(但不限于)聚乙烯亞胺(PEI)的化合物以誘發(fā)部分可溶性多肽的沉淀。隨后，可通過離心或過濾方便地收集沉淀的多肽?？墒褂梦墨I所記載的方法將重組宿主細胞破碎或均質化以從細胞內釋放包涵體?？墒褂梦墨I廣泛記載的方法進行宿主細胞破碎或均質化，所述方法包括(但不限于)酶促細胞破碎、超聲波降解、杜恩斯均質化(dounce homogenization)或高壓釋放破碎。在本發(fā)明中描述并涵蓋的方法的一個實施例中，使用高壓釋放技術來破碎大腸桿菌宿主細胞以釋放多肽的包涵體。當處理多肽的包涵體時，由于諸如溶解、機械剪切或蛋白質水解等因素，將重復均質化時間最小化以便最大化包涵體的產率而不造成損失為有利的。
隨后，可使用文獻所記載的眾多合適溶解劑中的任一個使不溶性或沉淀的多肽溶解。舉例來說，用尿素或鹽酸胍溶解多肽。溶解多肽的體積應最小化，以便可使用可方便處理的批量大小來進行大批量制備。在重組宿主可以體積為數千升的批量生長的大規(guī)模商業(yè)裝置中，此因素可為重要的。另外，當在大規(guī)模商業(yè)裝置中制造多肽時，尤其對于人類醫(yī)藥用途來說，如果可能的話，應避免可能損壞機器和容器或多肽產物本身的苛性化學品。在本發(fā)明中描述并涵蓋的方法中已展示，可使用較溫和變性劑尿素代替較苛性變性劑鹽酸胍來溶解多肽包涵體。尿素的使用顯著地降低對在多肽的制造和純化過程中所用的不銹鋼設備造成損壞的風險，同時有效溶解多肽包涵體。
在可溶性多肽的情況下，肽可分泌到周質空間或培養(yǎng)基中。另外，可溶性肽可存在于宿主細胞的細胞質中。可溶性肽可在進行純化步驟之前加以濃縮?？墒褂梦墨I所記載的方法(包括(但不限于)本發(fā)明中描述的方法)從(例如)細胞溶解產物或培養(yǎng)基中濃縮可溶性肽。另外，可使用文獻所記載的方法(包括(但不限于)本發(fā)明中描述的方法)破碎宿主細胞并且從宿主細胞的細胞質或周質空間中釋放可溶性肽。
當以融合蛋白形式制備多肽時，優(yōu)選去除融合序列?？赏ㄟ^包括(但不限于)酶促裂解或化學裂解的方法來實現融合序列的去除，其中優(yōu)選酶促裂解。可使用文獻所記載的方法來實現融合序列的酶促去除。用于去除融合序列的酶的選擇將根據融合體的身份來確定，并且反應條件將根據酶的選擇來指定?？墒褂冒?但不限于)溴化氰、TEV蛋白酶和其它試劑的試劑來實現化學裂解。視情況，通過文獻所記載的方法從裂解的融合序列中純化裂解的多肽。這些方法將由融合序列和多肽的身份和性質來確定。純化方法可包括(但不限于)尺寸排阻色譜、疏水性相互作用色譜、離子交換色譜或透析或其任何組合。
也視情況純化多肽以從蛋白質溶液中去除DNA?？赏ㄟ^文獻所記載的方法來去除DNA，所述方法包括(但不限于)沉淀或離子交換色譜。在一個實施例中，通過用核酸沉淀劑(諸如(但不限于)硫酸魚精蛋白)沉淀來去除DNA。可使用文獻所記載的方法(包括(但不限于)離心或過濾)將多肽與沉淀的DNA分離。在將使用多肽來治療人類的情況下，宿主核酸分子的去除是一個重要因素，并且本發(fā)明中描述的方法將宿主細胞DNA降低到醫(yī)藥學上可接受的水平。
小規(guī)?；虼笠?guī)模發(fā)酵的方法也可用于蛋白質表達中，所述方法包括(但不限于)發(fā)酵罐、振蕩燒瓶、流化床生物反應器、中空纖維生物反應器、轉瓶培養(yǎng)系統以及攪拌槽生物反應器系統。這些方法中的每一個都可以分批、分批饋料或連續(xù)模式方法進行。
通?？墒褂梦墨I所記載的方法來回收本發(fā)明中描述的人類形式的非天然氨基酸多肽。舉例來說，可將培養(yǎng)基或細胞溶解產物離心或過濾以去除細胞碎片?？蓪⑸锨逡簼饪s或稀釋到所需體積或滲濾到合適緩沖液中以調節(jié)制劑以便用于進一步純化。本發(fā)明中描述的非天然氨基酸多肽的進一步純化包括(但不限于)使多肽變異體的脫酰胺和截短形式與相應完整形式分離。
根據文獻所記載的方法，可將本發(fā)明中描述的方法和組合物中所涵蓋的多肽(包括(但不限于)包含非天然氨基酸的多肽、包含非天然氨基酸的多肽的抗體、包含非天然氨基酸的多肽的結合搭配物)部分純化或實質上純化為均質。因此，可根據文獻所記載的方法來回收和純化本發(fā)明中描述的多肽，所述方法包括(但不限于)硫酸銨或乙醇沉淀、酸或堿提取、柱色譜、親和柱色譜、陰離子或陽離子交換色譜、磷酸纖維素色譜、疏水性相互作用色譜、羥基磷灰石色譜、凝集素色譜、凝膠電泳以及其任何組合。在制備恰當折疊的成熟蛋白時，必要時可使用蛋白再折疊步驟。在需要高純度的最終純化步驟中可使用高效液相色譜(HPLC)、親和色譜或其它合適方法。在一個實施例中，使用針對非天然氨基酸(或包含非天然氨基酸的多肽)制備的抗體作為純化試劑，從而(包括，但不限于)用于包含一個或一個以上非天然氨基酸的多肽的基于親和性的純化。必要時，在部分地純化或純化到均質后，視情況將多肽用于多種效用，包括(但不限于)用作檢定組分、治療劑、預防劑、診斷劑、研究試劑和/或用作抗體制備的免疫原。
在真核宿主細胞或非真核宿主細胞中制備包含至少一個非天然氨基酸的多肽的一個優(yōu)點在于，所述多肽通常會以其天然構象進行折疊。然而，在本發(fā)明中描述的方法和組合物的某些實施例中，在合成、表達和/或純化之后，多肽可具有不同于相關多肽的所需構象的構象。在本發(fā)明中描述的方法和組合物的一方面中，視情況使所表達的蛋白質變性并且隨后使其復性。此可選的變性和復性是利用文獻所記載的方法來實現，所述方法包括(但不限于)將伴侶蛋白(chaperonin)添加到所關注的多肽中，以及將多肽溶解在離液劑(包括(但不限于)鹽酸胍)中，并且利用蛋白二硫化物異構酶。
一般來說，有時需要使所表達的多肽變性和還原，并且隨后使所述多肽再折疊成優(yōu)選構象。舉例來說，可通過將胍、尿素、DTT、DTE和/或伴侶蛋白加入到所關注的翻譯產物中來實現所述再折疊。使蛋白質還原、變性和復性的方法包括上述參考文獻，以及Debinski等人，(1993)J.Biol.Chem.，26814065-14070；Kreitman和Pastan(1993)Bioconjug.Chem..4581-585；和Buchner，等人，(1992)Anal.Biochem.，205263-270。舉例來說，Debinski等人描述胍-DTE中包涵體蛋白的變性和還原?？稍诤?包括，但不限于)氧化型谷胱甘肽和L-精氨酸的氧化還原緩沖液中使蛋白質再折疊。再折疊試劑可流動或以其它方式移動以與一種或一種以上的多肽或其它表達產物接觸，或一種或一種以上的多肽或其它表達產物也可流動或以其它方式移動以與再折疊試劑接觸。
在原核制備非天然氨基酸多肽的情況下，如此制備的多肽可能會錯誤折疊并且因此缺乏生物活性或具有降低的生物活性?？赏ㄟ^“再折疊”來恢復蛋白質的生物活性。在一個實施例中，通過使用(例如)一種或一種以上的離液劑(包括(但不限于)尿素和/或胍)以及能夠還原二硫鍵的還原劑(包括(但不限于)二硫蘇糖醇、DTT或2-巰基乙醇、2-ME)溶解(其中多肽也為不溶性的)、展開并還原多肽鏈而使錯誤折疊的多肽再折疊。在中等濃度的離液劑下，隨后加入氧化劑(包括(但不限于)氧、胱氨酸或胱胺)，其允許再形成二硫鍵?？墒褂梦墨I所記載的方法使展開或錯誤折疊的多肽再折疊，所述方法諸如美國專利第4,511,502號、第4,511,503號和第4,512,922號中所述的方法，所述專利的每一個都是以引用的方式并入本發(fā)明中以揭示前述揭示內容。多肽也可與其它蛋白質共折疊以形成異二聚物或異多聚物。在再折疊或共折疊之后，視情況將多肽進一步純化。
在純化之后，可將非天然氨基酸多肽交換到不同緩沖液中和/或通過文獻所記載的方法(包括(但不限于)滲濾和透析)使其濃縮。以單一純化蛋白質形式提供的hGH可經歷聚集和沉淀。在某些實施例中，經純化的非天然氨基酸多肽可為至少90％純(如由反相高效液相色譜(RP-HPLC)或十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)所測量)。在某些其它實施例中，經純化的非天然氨基酸多肽可為至少95％純，或至少98％純，或至少99％純或具有更高純度。無論非天然氨基酸多肽的純度的確切數值如何，非天然氨基酸多肽都足夠純以便用作醫(yī)藥產品或用于進一步加工(包括(但不限于)與諸如PEG等水溶性聚合物接合)。
在某些實施例中，非天然氨基酸多肽分子在不存在其它活性成分或蛋白質(除了賦形劑、載劑以及穩(wěn)定劑、血清白蛋白等)的情況下可用作治療劑，并且在某些實施例中，非天然氨基酸多肽分子可與另一種多肽或聚合物復合。
可使用多種方法和程序來分析含有一個或一個以上非天然氨基酸的多肽的產率和純度，所述方法和程序包括(但不限于)與蛋白質染色法聯合的SDS-PAGE、免疫印跡法、質譜、基質輔助激光解吸/電離-質譜(MALDI-MS)、液相色譜/質譜、等電聚焦、分析型陰離子交換、色譜聚焦和圓二色譜。舉例來說，這些用于表征蛋白質的方法和程序包括(但不限于)Bradford檢定、SDS-PAGE和銀染色SDS-PAGE、考馬斯染色SDS-PAGE(coomassie stained SDS-PAGE)。其它方法包括(但不限于)去除內毒素的步驟。內毒素是位于革蘭氏陰性宿主細胞(諸如，大腸桿菌)的外膜上的脂多糖(LPS)。降低內毒素含量的方法包括(但不限于)使用二氧化硅支撐物、玻璃粉末或羥基磷灰石的純化技術，反相色譜、親和色譜、尺寸排阻色譜、陰離子交換色譜、疏水性相互作用色譜，這些方法的組合等?？赡苄枰揎椈蚱渌椒ㄒ詮乃P注的多肽中去除諸如共遷移蛋白等污染物。測量內毒素含量的方法包括(但不限于)鱟變形細胞溶解產物(Limulus AmebocyteLysate，LAL)檢定。
在某些實施例中，可通過生物合成將式I-XV的氨基酸(包括在式I-XV的范圍內的任何子式或特定化合物)并入多肽中，從而產生非天然氨基酸多肽。在其它實施例中，在多肽內的特定位點處并入所述氨基酸。在其它實施例中，使用翻譯系統將所述氨基酸并入多肽中。在其它實施例中，所述翻譯系統包含(i)編碼多肽的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含對應于并入上述氨基酸的預先指定位點的選擇密碼子，以及(ii)包含氨基酸的tRNA，其中所述tRNA對選擇密碼子具有特異性。在這些翻譯系統的其它實施例中，多核苷酸為在翻譯系統中產生的mRNA。在這些翻譯系統的其它實施例中，翻譯系統包含包括多核苷酸的質?；蚴删w。在這些翻譯系統的其它實施例中，翻譯系統包含包括多核苷酸的基因組DNA。在這些翻譯系統的其它實施例中，多核苷酸被穩(wěn)定地整合到基因組DNA中。在這些翻譯系統的其它實施例中，翻譯系統包含對選擇密碼子具有特異性的tRNA，其中所述選擇密碼子是選自由琥珀密碼子、赭石密碼子、蛋白石密碼子、獨特密碼子、稀有密碼子、非天然密碼子、五堿基密碼子和四堿基密碼子組成的群組。在這些翻譯系統的其它實施例中，tRNA為抑制tRNA。在這些翻譯系統的其它實施例中，翻譯系統包含將在上述氨基酸上氨?；膖RNA。在這些翻譯系統的其它實施例中，翻譯系統包含對tRNA具有特異性的氨酰基合成酶。在這些翻譯系統的其它實施例中，翻譯系統包含正交tRNA和正交氨?；鵷RNA合成酶。在這些翻譯系統的其它實施例中，多肽是由核糖體合成，并且在其它實施例中，翻譯系統為包含選自由細菌細胞、古細菌細胞和真核細胞組成的群組的細胞的活體內翻譯系統。在其它實施例中，細胞為大腸桿菌細胞、酵母細胞、來自假單胞菌種的細胞、哺乳動物細胞、植物細胞或昆蟲細胞。在這些翻譯系統的其它實施例中，翻譯系統為包含來自細菌細胞、古細菌細胞或真核細胞的細胞提取物的活體外翻譯系統。在其它實施例中，細胞提取物是來自大腸桿菌細胞、來自假單胞菌種的細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、植物細胞或昆蟲細胞。在其它實施例中，多肽的至少一部分是通過固相或溶液相肽合成方法或其組合來合成，而在其它實施例中進一步包含將多肽連接到另一多肽上。在其它實施例中，可通過生物合成將式I-XV的氨基酸(包括在式I-XV的范圍內的任何子式或特定化合物)并入多肽中，其中所述多肽是與治療蛋白同源的蛋白質。
B.活體內翻譯后修飾 由于在真核細胞中產生具有至少一個非天然氨基酸的所關注的多肽，這些多肽可能包括真核翻譯后修飾。在某些實施例中，多肽包括至少一個非天然氨基酸以及至少一次由真核細胞在活體內進行的翻譯后修飾，其中所述翻譯后修飾并非由原核細胞進行。舉例來說，翻譯后修飾包括(包括，但不限于)乙?；?、?；?、脂質修飾、棕櫚?；?、棕櫚酸鹽加成、磷酸化、糖脂鍵修飾、糖基化等。一方面，翻譯后修飾包括通過GlcNAc-天冬酰胺鍵聯將寡糖(包括(但不限于)(GlcNAc-Man)2-Man-GlcNAc-GlcNAc))連接到天冬酰胺上。參見表1，其列出真核蛋白質的N-鍵聯寡糖的一些實施例(也可存在其它殘基，其未展示)。另一方面，翻譯后修飾包括通過GalNAc-絲氨酸或GalNAc-蘇氨酸鍵聯，或GlcNAc-絲氨酸或GlcNAc-蘇氨酸鍵聯將寡糖(包括(但不限于)Gal-GalNAc、Gal-GlcNAc等)連接到絲氨酸或蘇氨酸上。
部分1.01表1通過GlcNAc鍵連接的寡糖的實施例

另一方面，翻譯后修飾包括前驅物(包括(但不限于)降血鈣素前驅物、降血鈣素基因相關的肽前驅物、前甲狀旁腺激素原(preproparathyroid hormone)、前胰島素原、胰島素原、前阿黑皮素原(prepro-opiomelanocortin)、阿黑皮素原等)的蛋白水解加工、組裝成多亞單位蛋白質或大分子組裝物，翻譯到細胞中的另一位點(包括(但不限于)細胞器，諸如內質網、高爾基體(golgi apparatus)、核、溶酶體、過氧化物酶體、線粒體、葉綠體、液泡等，或通過分泌途徑)。在某些實施例中，蛋白質包含分泌或定位序列、抗原決定基標簽、FLAG標簽、聚組氨酸標簽、GST融合物等。
非天然氨基酸的一個優(yōu)點在于其提供可用于添加其它分子的其它化學部分。這些修飾可在真核細胞或非真核細胞中活體內進行，或在活體外進行。因此，在某些實施例中，翻譯后修飾是通過非天然氨基酸進行。舉例來說，翻譯后修飾可通過親核-親電子反應進行。目前用于蛋白質的選擇性修飾的大多數反應涉及在親核與親電子反應搭配物之間形成共價鍵，所述反應包括(但不限于)α-鹵基酮與組氨酸或半胱氨酸側鏈的反應。在這些情況下的選擇性是由蛋白質中親核殘基的數目和可接近性決定的。在本發(fā)明中描述或使用本發(fā)明中描述的方法制備的多肽中，可在活體外和活體內使用其它更具選擇性的反應，包括(但不限于)非天然羰基氨基酸與肼的反應。說明性實施例可見于以下參考文獻中。Cornish等人，(1996)J.Am.Chem.Soc.1188150-8151；Mahal等人，(1997)Science，2761125-1128；Wang等人，(2001)Science 292498-500；Chin等人，(2002)J.Am.Chem.Soc.1249026-9027；Chin等人，(2002)Proc.Natl.Acad.Sci..9911020-11024；Wang等人，(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.10056-61；Zhang等人，(2003)Biochemistry.426735-6746；以及Chin等人，(2003)Science 300964-967。這允許用包括熒光團、交聯劑、糖衍生物和細胞毒性分子的許多試劑來選擇性標記幾乎任何蛋白質。也參見2003年1月16日申請的標題為“Glycoprotein synthesis”的美國專利申請案第10/686,944號，所述專利申請案是以引用的方式并入以揭示前述揭示內容。(包括，但不限于)通過疊氮基氨基酸進行的翻譯后修飾也可通過施陶丁格連接反應(Staudinger ligation)(包括(但不限于)利用三芳基膦試劑)進行。例如參見Kiick等人，(2002)Incorporation of azides into recombinant proteinsfor chemoselective modification by the Staudinger ligtation，PNAS99(1)19-24。
IX.用于制備非天然氨基酸多肽的替代系統 已使用數種策略在非重組宿主細胞、誘變宿主細胞或無細胞系統中的蛋白質中引入非天然氨基酸。關于此方面的其它信息可見于美國專利申請案第11/316,534號中。
X.多肽的非天然氨基酸組分的翻譯后修飾 為方便起見，這部分中描述的多肽的非天然氨基酸組分(XA到XJ)的翻譯后修飾已經一般性描述和/或用特定實施例加以描述。然而，這部分中所描述的多肽的非天然氨基酸組分的翻譯后修飾不應僅限于這部分中所提供的一般性描述或特定實施例，而是這部分中所描述的多肽的非天然氨基酸組分的翻譯后修飾同樣良好適用于處于式I-XV的范圍內的所有化合物和具有結構1-4的化合物，包括處于本發(fā)明中的說明書、權利要求以及圖式中所描述的式I-XV和具有結構1-4的化合物的范圍內的任何子式或特定化合物。
已開發(fā)出在蛋白質的活體內翻譯期間位點特異性地并入非天然氨基酸的方法、組合物、技術和策略。通過并入具有與天然存在氨基酸的側鏈化學正交的側鏈化學的非天然氨基酸，此技術允許進行重組蛋白的位點特異性衍生。因此，本發(fā)明中描述的方法、組合物、技術和策略的主要優(yōu)點在于如今可以確定的同源產物形式制備衍生蛋白。然而，本發(fā)明中描述的方法、組合物、反應混合物、技術和策略不限于由活體內蛋白質翻譯技術形成的非天然氨基酸多肽，而是包括由任何技術所形成的非天然氨基酸多肽，所述技術包括(僅舉例來說)表達蛋白質連接、化學合成、基于核糖酶的技術(例如參見本發(fā)明中標題為“替代系統中的表達”的部分)。
將非天然氨基酸并入重組蛋白中的能力廣泛地擴展可為實現翻譯后衍生而執(zhí)行的化學，其中此衍生發(fā)生在活體內或活體外。更明確地說，在多肽的非天然氨基酸部分上利用羰基與肼的反應形成吲哚鍵聯的多肽衍生提供數個優(yōu)點。第一，天然存在氨基酸(a)不含可與肼基反應形成吲哚鍵聯的羰基，并且(b)不含可與羰基反應形成吲哚鍵聯的肼基，并且經設計用于形成所述鍵聯的試劑因此將與多肽的非天然氨基酸組分位點特異性地反應(當然假設非天然氨基酸與相應試劑已經設計以形成所述鍵聯)，因此與使用文獻所記載的方式產生的衍生蛋白的混合物相反，位點選擇性衍生蛋白質的能力提供單一均質產物。第二，所述吲哚鍵聯在生物條件下是穩(wěn)定的，暗示由所述吲哚鍵聯衍生的蛋白質是治療應用的有效候選者。第三，所得吲哚鍵聯的穩(wěn)定性可根據已在其上形成吲哚鍵聯的非天然氨基酸的身份(即，官能團和/或結構)加以操縱。在一些實施例中，非天然氨基酸多肽的吲哚鍵聯具有少于1小時的分解半衰期，在其它實施例中少于1天，在其它實施例中為少于2天，在其它實施例中少于1周并且在其它實施例中多于1周。在其它實施例中，所得吲哚鍵聯在適度酸性條件下穩(wěn)定至少兩周，在其它實施例中，所得吲哚鍵聯在適度酸性條件下穩(wěn)定至少5天。在其它實施例中，非天然氨基酸多肽在介于約2與約8之間的pH值下穩(wěn)定至少1天；在其它實施例中，在約2到約6的pH值下穩(wěn)定至少1天；在其它實施例中，在約2到約4的pH值下穩(wěn)定至少1天。在其它實施例中，使用本發(fā)明中描述的策略、方法、組合物和技術，合成出分解半衰期被調節(jié)到即將發(fā)生的情形(例如，用于諸如持續(xù)釋放等治療用途，或診斷用途，或工業(yè)用途或軍事用途)的非天然氨基酸多肽的吲哚鍵聯。
上述非天然氨基酸多肽適用于(包括，但不限于)新穎治療劑、診斷劑、催化酶、工業(yè)酶、結合蛋白(包括(但不限于)抗體和抗體片段)以及(包括，但不限于)蛋白質結構和功能的研究。例如參見Dougherty，(2000)Unnatural AminoAcids as Probes of Protein Structure and Function，Current Opinion in ChemicalBiology，4645-652。上述非天然氨基酸多肽的其它用途包括(僅舉例來說)基于檢定的用途、化妝品用途、植物生物學用途、環(huán)境用途、能量產生用途和/或軍事用途。然而，上述非天然氨基酸多肽可經歷進一步修飾以并入新的官能團或經修飾的官能團，所述修飾包括操縱多肽的治療功效；改良多肽的安全性概況；調節(jié)多肽的藥物動力學、藥理學和/或藥效學(例如，增加水溶性、生物可用性；增加血清半衰期；增加治療半衰期；調節(jié)免疫原性；調節(jié)生物活性；或延長循環(huán)時間)；向多肽提供其它官能團；向多肽中并入標簽、標記或可檢測信號；易化多肽的分離性質；以及前述修飾的任何組合。
在某些實施例中為易化多肽的分離性質的方法，所述方法包含利用包含至少一個非天然氨基酸的同源非天然氨基酸多肽，所述非天然氨基酸是選自由含羰基的非天然氨基酸、含肼的非天然氨基酸組成的群組。在其它實施例中，已通過生物合成將這些非天然氨基酸并入如本發(fā)明中所述的多肽中。在其它或替代實施例中，這些非天然氨基酸多肽包含至少一個選自式I-XV的氨基酸的非天然氨基酸。在其它或替代實施例中，這些非天然氨基酸多肽包含至少一個選自具有結構1-4的化合物的氨基酸的非天然氨基酸。
本發(fā)明中描述的方法、組合物、策略和技術不限于多肽的特定類型、種類或家族。幾乎任何多肽都可包括至少一個本發(fā)明中描述的非天然氨基酸。僅舉例來說，多肽可與治療蛋白同源。非天然氨基酸多肽也可與生長激素超基因家族的任何多肽成員同源。
所述修飾包括將其它官能團并入到多肽的非天然氨基酸組分上，所述官能團包括(但不限于)所需官能團。
另外，非天然氨基酸多肽可含有可轉化為其它官能團(僅舉例來說，羰基或肼)的部分。圖23說明將非天然氨基酸多肽化學轉化為含羰基的非天然氨基酸多肽和含肼的非天然氨基酸多肽。所得含肼的非天然氨基酸多肽和含羰基的非天然氨基酸多肽可用于或并入用于制備、純化、表征和使用本發(fā)明中描述的非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和經修飾的非天然氨基酸多肽的任何方法、組合物、技術和策略中?？墒褂梦墨I所記載的方法來實現將化學部分化學轉化為其它官能團(僅舉例來說，羰基或肼)，所述方法諸如描述于(例如)March，ADVANCED ORGANICCHEMISTRY第5版，(Wiley 2001)；以及Carey和Sundberg，ADVANCED ORGANICCHEMISTRY第4版，A卷和B卷(Plenum 2000，2001)中。
此外，用含肼的試劑對含羰基的非天然氨基酸多肽進行的化學修飾可用于在適當激發(fā)下產生含有非天然氨基酸多肽的高熒光吲哚衍生物。圖19和圖21闡明用含肼的試劑對含羰基的非天然氨基酸多肽進行的化學修飾。另外，含肼的非天然氨基酸多肽可與含羰基的試劑發(fā)生化學反應以在適當激發(fā)下形成含有非天然氨基酸多肽的高熒光吲哚衍生物。圖20和圖22闡明用含羰基的試劑對含肼的非天然氨基酸多肽進行的化學修飾。
A-翻譯后修飾非天然氨基酸多肽的方法合成含吲哚的非天然氨基酸多肽 向多肽中并入含經取代羰基的非天然氨基酸和含經取代肼的非天然氨基酸通過形成吲哚鍵聯而提供位點特異性衍生?？捎靡言谘苌襟E之前或衍生步驟之后經純化的多肽來進行用于衍生和/或進一步修飾的方法。另外，可用已在所述修飾之前或所述修飾之后經純化的合成聚合物、多糖或多核苷酸來進行用于衍生和/或進一步修飾的方法。另外，衍生步驟可在適度酸性條件(包括(例如)介于約1到約6的pH值之間)下有效發(fā)生。
此外，某些吲哚鍵聯允許產生用于多種檢測方法中的熒光非天然氨基酸多肽。
圖21闡明用含肼的試劑對含羰基的非天然氨基酸多肽進行的位點特異性標記。圖22闡明用含羰基的試劑對含肼的非天然氨基酸多肽進行的位點特異性標記。
另外，可使用一端含有羰基或肼基并且另一端含有官能團的試劑來進行衍生。所得含吲哚的非天然氨基酸多肽可進一步經修飾以引入包括(僅舉例來說)聚合物、多糖或多核苷酸的分子。圖24B呈示含官能團的多肽與PEG衍生物的反應的說明性非限制性實施例。
僅舉例來說，式(XVI)的試劑是含羰基或含肼的試劑的類型，其可用于形成含吲哚的非天然氨基酸多肽并且可進一步經修飾以引入其它分子。在一個實施例中，式I到式IV的含肼的化合物可與含羰基的式XVI的試劑反應以形成含吲哚的非天然氨基酸多肽。在另一個實施例中，式V到式XIV的含羰基的化合物可與含肼基的式XVI的試劑反應以形成含吲哚的非天然氨基酸多肽。

其中 X各自獨立地為H、烷基、經取代烷基、烯基、經取代烯基、炔基、經取代炔基、烷氧基、經取代烷氧基、烷基烷氧基、經取代烷基烷氧基、聚氧化烯、經取代聚氧化烯、芳基、經取代芳基、雜芳基、經取代雜芳基、烷芳基、經取代烷芳基、芳烷基、經取代芳烷基、-(亞烷基或經取代亞烷基)-ON(R″)2、-(亞烷基或經取代亞烷基)-C(O)SR″、-(亞烷基或經取代亞烷基)-S-S-(芳基或經取代芳基)、-C(O)R″、-C(O)2R″或-C(O)N(R″)2，其中R″各自獨立地為氫、烷基、經取代烷基、烯基、經取代烯基、烷氧基、經取代烷氧基、芳基、經取代芳基、雜芳基、烷芳基、經取代烷芳基、芳烷基或經取代芳烷基； 或X各自獨立地為所需官能團； L是各自獨立地選自由以下各基團組成的群組亞烷基、經取代亞烷基、亞烯基、經取代亞烯基、-O-、-O-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-S-、-S-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-S(O)k-(其中k為1、2或3)、-S(O)k(亞烷基或經取代亞烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-(亞烷基或經取代亞烷基)NR′C(O)O-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-O-CON(R′)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-N(R′)CO-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-N(R′)C(O)O-、-N(R′)C(O)O-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、-N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-和-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-； L1是可選的，并且當存在時為-C(R′)p-NR′-C(O)O-(亞烷基或經取代亞烷基)-(其中p為0、1或2)； R′各自獨立地為H、烷基或經取代烷基； W為

和

R為H、烷基或經取代烷基。
在式(XVI)的化合物的某些實施例中，X為包含烷基、經取代烷基、烯基、經取代烯基、炔基、經取代炔基、烷氧基、經取代烷氧基、烷基烷氧基、經取代烷基烷氧基、聚氧化烯、經取代聚氧化烯、芳基、經取代芳基、雜芳基、經取代雜芳基、烷芳基、經取代烷芳基、芳烷基或經取代芳烷基的聚合物。在式(XVI)的化合物的某些實施例中，X為包含聚氧化烯或經取代聚氧化烯的聚合物。在式(XVI)的化合物的某些實施例中，X為包含-[(亞烷基或經取代亞烷基)-O-(氫、烷基或經取代烷基)]x的聚合物，其中x為約20到約10,000。在式(XVI)的化合物的某些實施例中，X為具有介于約2KDa到約40KDa范圍內的分子量的m-PEG。在式(XVI)的化合物的某些實施例中，X為選自由肽、蛋白質、酶、抗體、藥物、染料、脂質、核苷、寡核苷酸、細胞、病毒、脂質體、微粒和膠束組成的群組的生物活性劑。在式(XVI)的化合物的某些實施例中，X為選自由抗生素、殺真菌劑、抗病毒劑、消炎劑、抗腫瘤劑、心血管劑、抗焦慮劑、激素、生長因子和類固醇劑組成的群組的藥物。在式(XVI)的化合物的某些實施例中，X為選自由辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶和葡萄糖氧化酶組成的群組的酶。在式(XVI)的化合物的某些實施例中，X為選自由熒光部分、磷光部分、化學發(fā)光部分、螯合部分、電子致密部分、磁性部分、插入部分、放射性部分、發(fā)色團部分和能量轉移部分組成的群組的可檢測標記。在式(XVI)的化合物的某些實施例中，X為由含羰基部分和含肼部分組成的反應性基團。在式(XVI)的化合物的某些實施例中，X為吲哚衍生物。在式(XVI)的化合物的某些實施例中，L是選自由-N(R′)CO-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-CON(R′)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-N(R′)C(O)N(R′)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-O-CON(R′)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-O-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-C(O)N(R′)-和-N(R′)C(O)O-(亞烷基或經取代亞烷基)-組成的群組。
在式(XVI)的化合物的某些實施例中是具有式(XVII)的結構的化合物 X-L-W (XVII)， 其中 W為

和

R為H、烷基或經取代烷基。
在式(XVII)的化合物的某些實施例中是具有式(XVIII)的結構的化合物



其中在其它實施例中，所述m-PEG或PEG基團具有介于約5kDa到約30kDa范圍內的分子量。
在式(XVII)的化合物的某些實施例中是具有式(XIX)的結構的化合物
其中 W為

和

R為H、烷基或經取代烷基。
Y在存在時為烷基或經取代烷基。
L為-(亞烷基或經取代亞烷基)-N(R′)C(O)O-(亞烷基或經取代亞烷基)-。在式(XVII)的化合物的某些實施例中是具有式(XX)的結構的化合物
其中在式(XX)的化合物的某些實施例中，所述m-PEG基團具有介于約5kDa到約30kDa范圍內的分子量。
在式(XVII)的化合物的某些實施例中是具有式(XXI)的結構的化合物
其中 W為

和

R為H、烷基或經取代烷基。
Y在存在時為烷基或經取代烷基。
L為-(亞烷基或經取代亞烷基)-N(R′)C(O)O-(亞烷基或經取代亞烷基)-。在式(XXI)的化合物的某些實施例中是具有式(XXII)的結構的化合物
其中在式(XXII)的化合物的其它實施例中，所述m-PEG基團具有介于約5kDa到約30kDa范圍內的分子量。
在某些實施例中，式(XVII)的連接子可與含羰基或含肼的多肽在水溶液中在酸性條件下反應。在某些實施例中，所述酸性條件是pH值為約1到約6。
在式(XVII)的化合物的某些實施例中是具有式(XXIII)的結構的化合物
其中 Z為O或NH，并且n為1、2、3和4； W為

和

R為H、烷基或經取代烷基。在式(XXIII)的化合物的某些實施例中是具有式(XXIV)的結構的化合物
在式(XXIII)的化合物的其它實施例中是具有式(XXV)的結構的化合物
在某些實施例中是衍生包含式I-XV的氨基酸和具有結構1-4的化合物(包括在式I-XV的范圍內的任何子式或特定化合物)的多肽的方法，其中所述方法包含使包含至少一個式I-XV的氨基酸的多肽與式(XVI)的試劑接觸。在某些實施例中，多肽是在與式(XVI)的試劑接觸之前或之后經純化。在其它實施例中，所得多肽包含至少一個式I-XV的含羰基的氨基酸或至少一個式I-XV的含肼的氨基酸。在其它實施例中，所得多肽包含至少一個由式I-XV的化合物與式(XVI)的試劑偶合所產生的含吲哚的多肽。
圖26提供合成式(XXIV)的雙官能連接子的說明性實施例。其中所述方法包含使兩端都含有胺或羥基的間隔基試劑與含有經Boc保護的肼的酸偶合。Boc基團的裂解產生式(XXIV)的連接子。
圖27提供用式(XXIV)的試劑對含有羰基非天然氨基酸的多肽進行翻譯后修飾以形成含吲哚的多肽的圖示。
圖28提供用式XX和式XXII的試劑對含有羰基非天然氨基酸的多肽進行翻譯后修飾以形成含吲哚的多肽的圖示。
圖29提供用式XX和式XXII的試劑對含有肼非天然氨基酸的多肽進行翻譯后修飾以形成含吲哚的多肽的圖示。
圖30闡明式(XVIII)的試劑的實施例。
在某些實施例中是通過吲哚鍵聯產生多肽二聚物的方法，其中所述方法由式(XXIII)的連接子與含羰基或含肼的非天然氨基酸多肽的反應組成。圖27提供使用式(XXIV)的連接子與含羰基的非天然氨基酸多肽的縮合形成所述二聚物的代表性實施例。
在某些實施例中是通過使用雙官能連接子來制備含吲哚部分的多肽的方法，其中所述方法包含 (i)用雙官能連接子衍生包含式(I)的氨基酸的第一多肽，以及 (ii)使步驟(i)的所得衍生蛋白與諸如PEG等第二試劑接觸。在某些實施例中，多肽是在與雙官能連接子接觸之前或之后經純化。
圖24展示所述雙官能連接子的說明性實施例以及其用于制備與PEG基團連接的含吲哚的多肽的用途。
僅舉例來說，以下是式(XXVI)的雙官能連接子的代表性實施例。

其中 W為

和

R為H、烷基或經取代烷基；并且 L為-(亞烷基或經取代亞烷基)-N(R′)C(O)O-(亞烷基或經取代亞烷基)-。
在一個實施例中，多個連接子化學物質可與含羰基或含肼的非天然氨基酸多肽位點特異性地反應。在一個實施例中，本發(fā)明中描述的連接子方法利用在至少一個連接子末端含有肼官能團的連接子(單官能、雙官能或多官能)。肼衍生的連接子與經羰基取代的蛋白質的反應產生經吲哚取代的非天然蛋白質。在其它實施例中，本發(fā)明中描述的連接子方法利用在至少一個連接子末端含有羰基官能團的連接子(單官能、雙官能或多官能)。羰基衍生的連接子與經肼取代的蛋白質的反應產生經吲哚取代的非天然蛋白質。
在某些實施例中是衍生化學合成的多肽的方法，其包含使含羰基或含肼的非天然多肽與含羰基或肼的試劑反應形成吲哚衍生物。
圖19提供用含肼的試劑衍生含羰基的尾加壓素的說明性實施例。在此說明性實施例中，將含肼的試劑加入到含羰基的尾加壓素類似物的緩沖溶液(pH 1-5)中。反應在周圍溫度下進行數小時到數天。
圖20提供用含羰基的試劑衍生含肼的尾加壓素的說明性實施例。在此說明性實施例中，將含羰基的試劑加入到含肼的尾加壓素類似物的緩沖溶液(pH 1-5)中。反應在周圍溫度下進行數小時到數天。
在其它實施例中，所述衍生多肽在水溶液中在適度酸性條件下穩(wěn)定至少1個月。在其它實施例中，所述衍生多肽在適度酸性條件下穩(wěn)定至少2周。在其它實施例中，所述衍生多肽在適度酸性條件下穩(wěn)定至少5天。在其它實施例中，所述條件是pH值為約1到約6。在某些實施例中，保持衍生多肽的三級結構。在其它實施例中，所述多肽的衍生進一步包含將衍生多肽與另一多肽連接。在其它實施例中，所述衍生多肽與治療蛋白同源。
B.添加官能團的實施例與非天然氨基酸多肽偶合的大分子聚合物 可使用本發(fā)明中描述的組合物、方法、技術和策略來實現對本發(fā)明中描述的非天然氨基酸多肽的各種修飾。這些修飾包括使其它官能團結合到多肽的非天然氨基酸組分上，所述官能團包括(但不限于)所需官能團。作為本發(fā)明中描述的組合物、方法、技術和策略的說明性非限制性實施例，以下描述將集中在將大分子聚合物添加到非天然氨基酸多肽上，同時應了解另外描述的組合物、方法、技術和策略也可應用于添加其它官能團，包括(但不限于)上文列出的那些官能團。
多種大分子聚合物和其它分子可與本發(fā)明中描述的非天然氨基酸多肽偶合以調節(jié)非天然氨基酸多肽(或相應天然氨基酸多肽)的生物性質，和/或向非天然氨基酸多肽(或相應天然氨基酸多肽)提供新的生物性質。這些大分子聚合物可通過非天然氨基酸或非天然氨基酸的任何官能取代基或添加到非天然氨基酸上的任何取代基或官能團與非天然氨基酸多肽偶合。
水溶性聚合物可與本發(fā)明中描述的并入多肽(天然或合成)、多核苷酸、多糖或合成聚合物中的非天然氨基酸偶合。水溶性聚合物可通過并入多肽中的非天然氨基酸或非天然氨基酸的任何官能團或取代基，或添加到非天然氨基酸上的任何官能團或取代基進行偶合。在一些情況下，本發(fā)明中描述的非天然氨基酸多肽包含一個或一個以上與水溶性聚合物偶合的非天然氨基酸以及一個或一個以上與水溶性聚合物鍵聯的天然存在氨基酸。親水性聚合物與生物活性分子的共價連接代表一種增加生物活性分子(包括蛋白質、肽以及尤其疏水性分子)的水溶性(諸如在生理環(huán)境中)、生物可用性、增加血清半衰期、增加治療半衰期、調節(jié)免疫原性、調節(jié)生物活性或延長循環(huán)時間的方法。所述親水性聚合物的其它重要特征包括生物相容性、無毒性以及無免疫原性。對于最終產品制劑的治療用途，聚合物優(yōu)選應為醫(yī)藥學上可接受的。
親水性聚合物的實施例包括(但不限于)聚烷基醚和其烷氧基封端的類似物(例如，聚氧乙二醇、聚氧乙二醇/聚氧丙二醇，以及其甲氧基或乙氧基封端的類似物，尤其聚氧乙二醇，后者也被稱為聚乙二醇或PEG)；聚乙烯吡咯烷酮；聚乙烯基烷基醚；聚噁唑啉、聚烷基噁唑啉和聚羥烷基噁唑啉；聚丙烯酰胺、聚烷基丙烯酰胺和聚羥烷基丙烯酰胺(例如，聚羥基丙基甲基丙烯酰胺和其衍生物)；聚羥烷基丙烯酸酯；聚唾液酸和其類似物；親水性肽序列；多糖和其衍生物，包括葡聚糖和葡聚糖衍生物，例如，羧甲基葡聚糖、硫酸葡聚糖、氨基葡聚糖；纖維素和其衍生物，例如，羧甲基纖維素、羥烷基纖維素；甲殼質和其衍生物，例如，殼聚糖、丁二?；鶜ぞ厶?、羧甲基甲殼質、羧甲基殼聚糖；透明質酸和其衍生物；淀粉；海藻酸鹽；硫酸軟骨素；白蛋白；支鏈淀粉和羧甲基支鏈淀粉；聚氨基酸和其衍生物，例如，聚谷氨酸、聚賴氨酸、聚天冬氨酸、聚天冬酰胺；馬來酸酐共聚物，諸如苯乙烯馬來酸酐共聚物、二乙烯基乙基醚馬來酸酐共聚物；聚乙烯醇；其共聚物；其三元共聚物；其混合物；以及前述物質的衍生物。水溶性聚合物可為任何結構形式，包括(但不限于)線性、叉狀或分枝。在一些實施例中，具有2到約300個末端的水溶性聚合物主鏈尤其適用。多官能聚合物衍生物包括(但不限于)具有兩個末端的線性聚合物，其中每一末端都與可能相同或不同的官能團鍵結。在一些實施例中，水溶性聚合物包含聚乙二醇部分。聚合物的分子量可在所需聚合物分子量范圍內。關于實質上水溶性主鏈的前述列舉決非詳盡的并且僅具說明性，并且預期具有上述品質的所有聚合材料都適用于本發(fā)明中描述的方法和組合物中。
如上所述，親水性聚合物的一個實施例是聚乙二醇(縮寫為PEG)，其已廣泛用于藥物、人工植入物，以及生物相容性、無毒性和無免疫原性具有重要性的其它應用中。本發(fā)明中描述的聚合物多肽實施例將使用PEG作為例示性親水性聚合物，其中應了解其它親水性聚合物可類似地用于這些實施例中。
PEG為水溶性聚合物，其可購得或可根據文獻所記載的方法由乙二醇的開環(huán)聚合來制備(Sandler和Karo，Polymer Synthesis，Academic Press，New York，第3卷，第138-161頁)。PEG通常透明、無色、無味、可溶于水中、對熱穩(wěn)定、對許多化學劑呈惰性、不會水解或變質，并且一般無毒。認為聚乙二醇具有生物相容性，這就是說PEG能夠與活組織或生物體共存而不造成危害。更明確地說，PEG實質上具有非免疫原性，這就是說PEG在體內并不趨向于產生免疫反應。當連接到在體內具有一些所需功能的分子(諸如生物活性劑)上時，PEG趨向于掩蔽藥劑并且可減少或消除任何免疫反應以便生物體可耐受藥劑的存在。PEG接合物趨向于不會產生重大免疫反應或不會造成凝血或其它不需要的作用。
廣泛使用術語“PEG”來涵蓋任何聚乙二醇分子(不考慮大小或在PEG末端的修飾)，并且當與非天然氨基酸多肽鍵聯時，所述術語可由下式表示 XO-(CH2CH2O)n-CH2CH2-Y， 其中n為2到10,000，并且X為H或末端修飾，所述末端修飾包括(但不限于)C1-4烷基、保護基或末端官能團。術語PEG包括(但不限于)其任何形式的聚乙二醇，包括雙官能PEG、多臂PEG、衍生PEG、叉狀PEG、支化PEG(其中各鏈具有約1kDa到約100kDa、約1kDa到約50kDa或約1kDa到約20kDa的分子量)、側接PEG(即具有一個或一個以上與聚合物主鏈側接的官能團的PEG或相關聚合物)，或其中具有可降解鍵聯的PEG。在一個實施例中，n為約20到約2000的PEG適用于本發(fā)明中描述的方法和組合物中。在一些實施例中，水溶性聚合物包含聚乙二醇部分。PEG聚合物的分子量可具有寬泛范圍，包括(但不限于)介于約100Da與約100,000Da或100,000Da以上之間。PEG聚合物的分子量可在所需聚合物分子量范圍內。多種PEG分子描述于(包括，但不限于)Shearwater Polymers，Inc.目錄、Nektar Therapeutics目錄中，所述目錄是以引用的方式并入本發(fā)明中。
文獻中末端官能團的特定實施例包括(但不限于)碳酸N-丁二酰亞胺酯(例如參見美國專利第5,281,698號、第5,468,478號)、胺(例如參見Buckmann等人，Makromol.Chem.1821379(1981)；Zalipsky等人，Eur.Polym.J.191177(1983))、酰肼(例如參見Andresz等人，Makromol.Chem.179301(1978))、丙酸丁二酰亞胺酯和丁酸丁二酰亞胺酯(例如參見Olson等人，在Poly(ethylene glycol)Chemistry & Biological Applications中第170-181頁，Harris和Zalipsky編，ACS，Washington，D.C.，1997；也參見美國專利第5,672,662號)、丁二酸丁二酰亞胺酯(例如參見Abuchowski等人，Cancer Biochem.Biophys.7175(1984)以及Joppich等人，Makromol.Chem.1801381(1979))、丁二酰亞胺酯(例如參見美國專利第4,670,417號)、碳酸苯并三唑(例如參見美國專利第5,650,234號)、縮水甘油醚(例如參見Pitha等人，Eur.J Biochem.9411(1979)；Elling等人，Biotech.Appl.Biochem.13354(1991))、氧基羰基咪唑(例如參見Beauchamp等人，Anal.Biochem.13125(1983)；Tondelli等人，J.Controlled Release 1251(1985))、碳酸對硝基苯酯(例如參見Veronese等人，Appl.Biochem.Biotech.，11141(1985)；以及Sartore等人，Appl.Biochem.Biotech.，2745(1991))、醛(例如參見Harris等人，J.Polym.Sci.Chem.Ed.22341(1984)；美國專利第5,824,784號；美國專利第5,252,714號)、馬來酰亞胺(例如參見Goodson等人，Bio/Technology 8343(1990)；Romani等人，在Chemistry of Peptides and Proteins 229(1984)中；以及Kogan，Synthetic Comm.222417(1992))、鄰吡啶基二硫化物(例如參見Woghiren等人，Bioconj.Chem.4314(1993))、丙烯醇(例如參見Sawhney等人，Macromolecules，26581(1993))、乙烯基砜(例如參見美國專利第5,900,461號)。所有上述參考文獻和專利都是以全文引用的方式并入本發(fā)明中。
在一些情況下，PEG一端以羥基或甲氧基封端，即，X為H或CH3(“甲氧基PEG”)。或者，PEG可以反應性基團封端，從而形成雙官能聚合物。典型反應性基團可包括通常用于與20種常見氨基酸中存在的官能團(包括(但不限于)馬來酰亞胺基團、活化碳酸酯(包括(但不限于)對硝基苯酯)、活化酯(包括(但不限于)N-羥基丁二酰亞胺、對硝基苯酯)和醛)反應的那些反應性基團以及對20種常見氨基酸呈惰性但與非天然氨基酸中存在的互補官能團特異性反應的官能團(包括(但不限于)苯基肼和羰基)。
應注意，上式中由Y表示的PEG的另一端應通過非天然氨基酸與多肽(合成或天然)、多核苷酸、多糖或合成聚合物直接或間接地連接。如果Y為苯基肼基團，那么含苯基肼的PEG試劑可與多肽中含羰基的非天然氨基酸反應以通過吲哚鍵聯形成與多肽鍵聯的PEG基團。如果Y為羰基，那么含羰基的PEG試劑可與多肽中含苯基肼的非天然氨基酸反應以通過吲哚鍵聯形成與多肽鍵聯的PEG基團。圖30呈示含羰基和含肼的PEG試劑的非限制性實施例。
在一些實施例中，肼可與非天然氨基酸中存在的羰基反應以形成吲哚?；蛘撸驴赏ㄟ^非天然氨基酸并入多肽中并且用于優(yōu)先與水溶性聚合物中存在的羰基反應。一般來說，PEG分子的至少一個末端可用于與非天然氨基酸反應。
因此，在一些實施例中，包含非天然氨基酸的多肽是通過非天然氨基酸的側鏈與諸如聚乙二醇(PEG)等水溶性聚合物鍵聯。本發(fā)明中描述的非天然氨基酸方法和組合物提供用PEG衍生物對蛋白質進行選擇性修飾的高效方法，所述方法涉及回應選擇密碼子而將非天然氨基酸(包括(但不限于)含有20種天然并入氨基酸中不存在的官能團或取代基的那些氨基酸)選擇性并入蛋白質中以及用適當反應性PEG衍生物對那些氨基酸進行后續(xù)修飾。多種文獻所記載的方法適用于本發(fā)明中描述的非天然氨基酸方法和組合物以將水溶性聚合物并入蛋白質中。
聚合物主鏈可為線性或支化的。支化聚合物主鏈一般已為文獻所記載。通常，支化聚合物具有中心分枝核部分和多個與所述中心分枝核鍵聯的線性聚合物鏈。PEG是以支化形式使用，其可通過將環(huán)氧乙烷添加到各種多元醇(諸如丙三醇、丙三醇寡聚物、季戊四醇和山梨糖醇)上來制備。中心分枝部分也可衍生自諸如賴氨酸等多種氨基酸。支化聚乙二醇可以通用形式表示為R(-PEG-OH)m，其中R是衍生自諸如丙三醇、丙三醇寡聚物或季戊四醇等核部分，并且m表示臂的數目。多臂PEG分子(諸如美國專利第5,932,462號、第5,643,575號、第5,229,490號、第4,289,872號、美國專利申請案2003/0143596、WO 96/21469以及WO 93/21259中描述的那些PEG分子，所述文獻的每一個都是以引用的方式并入本發(fā)明中以揭示前述揭示內容)也可用作聚合物主鏈。
支化PEG也可呈由PEG(-YCHZ2)n表示的叉狀PEG的形式，其中Y為鍵聯基團，并且Z為通過確定長度的原子鏈鍵聯到CH上的活化末端基團。另一支化形式(側接PEG)沿PEG主鏈而非在PEG鏈的末端處具有諸如羧基等反應性基團。
除PEG的這些形式之外，也可制備在主鏈中具有弱鍵或可降解鍵的聚合物。舉例來說，可制備在聚合物主鏈中具有酯鍵的PEG，所述酯鍵可經歷水解。如本發(fā)明中所示，此水解使得聚合物裂解為較低分子量的片段 -PEG-CO2-PEG-+H2O→PEG-CO2H+HO-PEG-。
術語聚乙二醇或PEG表示或包括文獻所記載的所有形式，包括(但不限于)本發(fā)明中揭示的那些形式。聚合物的分子量可在寬泛范圍內，包括(但不限于)介于約100Da與約100,000Da或100,000Da以上之間。聚合物的分子量可在所需聚合物分子量范圍內。
為最大化PEG的所需性質，連接到生物活性分子上的一種或一種以上PEG聚合物的總分子量以及水合狀態(tài)應足夠高以賦予通常與PEG聚合物連接相關的有利特征(諸如增加的水溶性和循環(huán)半衰期)，而不會不利地影響母體分子的生物活性。
本發(fā)明中描述的方法和組合物可用于制備聚合物蛋白質接合物的實質上均質制劑。如本發(fā)明中所使用的“實質上均質”表示觀測到聚合物蛋白質接合物分子超出總蛋白質的一半。聚合物蛋白質接合物具有生物活性，并且本發(fā)明中所提供的本發(fā)明的“實質上均質”的PEG化多肽制劑為足夠均質以顯示均質制劑的優(yōu)點(例如，易于臨床應用于預測各批次之間的藥物動力學)的那些制劑。
也可選擇制備聚合物蛋白質接合物分子的混合物，并且本發(fā)明中所提供的優(yōu)點在于可選擇包括在混合物中的單聚合物蛋白質接合物的比例。因此，必要時，可制備各種蛋白質與所連接的各種數目的聚合物部分(即，二聚物部分、三聚物部分、四聚物部分等)的混合物并且將所述接合物與使用本發(fā)明中描述的方法制備的單聚合物蛋白質接合物組合，并且使混合物具有預定比例的單聚合物蛋白質接合物。
聚乙二醇分子與蛋白質分子的比例會隨著其在反應混合物中的濃度而改變。一般來說，最佳比率(就反應效率來說在于存在最小過量的未反應蛋白質或聚合物)可由所選聚乙二醇的分子量和可用的可用反應性基團的數目來確定。就分子量來說，通常聚合物的分子量越高，可連接到蛋白質上的聚合物分子的數目越少。類似地，當優(yōu)化這些參數時，應考慮到聚合物的支化。通常，分子量越高(或分枝越多)，聚合物蛋白質比率越高。
如本發(fā)明中所使用，并且當涵蓋親水性聚合物多肽/蛋白質接合物時，術語“治療有效量”進一步指代向患者提供所需益處的增加的量。所述量會隨著不同個體而改變并且應取決于多種因素，所述因素包括患者的整體身體狀態(tài)和所欲治療的疾病、病癥或病狀的潛在病因。
可調節(jié)本發(fā)明中描述的鍵聯到經修飾或未經修飾的非天然氨基酸多肽上的水溶性聚合物的數目(即，PEG化或糖基化的程度)以提供改變的(包括(但不限于)增加的或降低的)藥理學、藥物動力學或藥效學特征，諸如活體內半衰期。在一些實施例中，多肽的半衰期比未經修飾的多肽增加至少約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、兩倍、五倍、10倍、50倍或至少約100倍。
在一個實施例中，用含有與PEG主鏈直接鍵聯的末端芳基肼部分的PEG衍生物修飾包含含羰基的非天然氨基酸的多肽。
在一個實施例中，用含有與PEG主鏈直接鍵聯的末端肼部分的PEG衍生物修飾包含含羰基的非天然氨基酸的多肽。
在另一個實施例中，用含有與PEG主鏈直接鍵聯的末端羰基部分的PEG衍生物修飾包含含肼的氨基酸的多肽。
在一些實施例中，羰基末端PEG衍生物具有以下結構 RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)m-C(O)-R， 其中R為簡單烷基(甲基、乙基、丙基等)，m為2-10，并且n為100-1,000(即，平均分子量介于5kDa-40kDa之間)。聚合物的分子量可在寬泛范圍內，包括(但不限于)介于約100Da與約100,000Da或100,000Da以上之間。聚合物的分子量可在所需聚合物分子量范圍內。
可獲得關于PEG的官能化和接合的若干評述和專論。例如，參見Harris，Macromol.Chem.Phys.C25325-373(1985)；Scouten，Methods in Enzymology 13530-65(1987)；Wong等人，Enzyme Microb.Technol.14866-874(1992)；Delgado等人，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9249-304(1992)；Zalipsky，Bioconjugate Chem.6150-165(1995)。
關于聚合物活化的方法也可見于WO 94/17039、美國專利第5,324,844號、WO 94/18247、WO 94/04193、美國專利第5,219,564號、美國專利第5,122,614號、WO 90/13540、美國專利第5,281,698號以及WO 93/15189中，并且用于活化聚合物與酶之間的接合的方法包括(但不限于)凝血因子VIII(WO 94/15625)、血紅蛋白(WO 94/09027)、載氧分子(美國專利第4,412,989號)、核糖核酸酶和超氧化物歧化酶(Veronese等人，App.Biochem.Biotech.11141-152(1985))，所有這些文獻都是以引用的方式并入本發(fā)明中以揭示前述揭示內容。
必要時，可通過文獻所記載的方法進一步純化從疏水性色譜獲得的本發(fā)明中描述的PEG化非天然氨基酸多肽，所述方法包括(但不限于)親和色譜；陰離子或陽離子交換色譜(使用(包括，但不限于)DEAE SEPHAROSE)；二氧化硅色譜；反相HPLC；凝膠過濾(使用(包括，但不限于)SEPHADEX G-75)；疏水性相互作用色譜；尺寸排阻色譜；金屬螯合物色譜；超濾/滲濾；乙醇沉淀；硫酸銨沉淀；色譜聚焦；置換色譜；電泳程序(包括(但不限于)制備型等電聚焦)、差異溶解性(包括(但不限于)硫酸銨沉淀)或萃取?？赏ㄟ^GPC經由與球狀蛋白質標準物進行比較來估算表觀分子量(Preneta AZ，PROTEIN PURIFICATIONMETHODS，A PRACTICAL APPROACH(Harris和Angal編)IRL Press 1989，293-306)。可通過蛋白水解降解(包括(但不限于)胰蛋白酶裂解)、接著質譜分析來分析(非天然氨基酸多肽)PEG接合物的純度。Pepinsky RB.等人，J.Pharmacol.& Exp.Ther.297(3)1059-66(2001)。
與本發(fā)明中描述的多肽的非天然氨基酸鍵聯的水溶性聚合物可不加限制地進一步進行衍生或經取代。
C.增強對血清白蛋白的親和性 也可將多種分子與本發(fā)明中描述的非天然氨基酸多肽融合以調節(jié)血清中的半衰期。在一些實施例中，將分子與本發(fā)明中描述的經修飾或未經修飾的非天然氨基酸多肽鍵聯或融合以增強對動物中的內源血清白蛋白的親和性。
舉例來說，在一些情況下，進行多肽與白蛋白結合序列的重組融合。例示性白蛋白結合序列包括(但不限于)來自鏈球菌蛋白G的白蛋白結合域(例如參見Makrides等人，J.Pharmacol Exp.Ther.277(1)534-542(1996)以及sjolander等人，J，Immunol.Methods 201115-123(1997))，或白蛋白結合肽，諸如描述于(例如)Dennis等人，J.Biol.Chem.277(38)35035-35043(2002)中的那些白蛋白結合肽。
在其它實施例中，用脂肪酸使本發(fā)明中描述的經修飾或未經修飾的非天然氨基酸多肽?；Ｔ谝恍┣闆r下，脂肪酸促進與血清白蛋白的結合。例如參見Kurtzhals等人，Biochem.J.312725-731(1995)。
在其它實施例中，使本發(fā)明中描述的經修飾或未經修飾的非天然氨基酸多肽直接與血清白蛋白(包括(但不限于)人類血清白蛋白)融合。也可使多種其它分子與如本發(fā)明中所述的經修飾或未經修飾的非天然氨基酸多肽鍵聯以調節(jié)與血清白蛋白或其它血清組分的結合。
A.本發(fā)明中描述的非天然氨基酸多肽的糖基化 本發(fā)明中描述的方法和組合物包括結合有一個或一個以上帶有糖殘基的非天然氨基酸的多肽。糖殘基可為天然(包括(但不限于)N-乙?；咸前?或非天然的(包括(但不限于)3-氟半乳糖)。所述糖可通過N或O鍵聯的糖苷鍵(包括(但不限于)N-乙?；肴樘?L-絲氨酸)或非天然鍵(包括(但不限于)雜環(huán)(包括含氮雜環(huán))鍵聯或相應C或S鍵聯的糖苷)鍵聯到非天然氨基酸上。
可在活體內或活體外將糖(包括(但不限于)糖基)部分添加到非天然氨基酸多肽上。在一些實施例中，用由芳基肼基團衍生的糖修飾包含含羰基的非天然氨基酸的多肽以產生通過吲哚鍵聯所鍵聯的相應糖基化多肽。在其它實施例中，用由羰基衍生的糖修飾包含含芳基肼的非天然氨基酸的多肽以產生通過鍵聯所鍵聯的相應糖基化多肽。一旦將糖連接到非天然氨基酸上，就可通過用糖基轉移酶和其它酶處理來進一步精制所述糖以產生結合到非天然氨基酸多肽上的寡糖。例如參見H.Liu等人，J.Am.Chem.Soc.1251702-1703(2003)。
圖26呈示合成雙官能同型連接子(其中所述連接子具有兩個相同末端，即肼基)的說明性實施例。此類連接子可用于形成含羰基的非天然氨基酸多肽的同型二聚物以形成兩個吲哚鍵聯?；蛘?，如果此類連接子的一個末端經保護，那么此部分經保護的連接子可用于通過吲哚鍵聯使未經保護的肼末端與含羰基的非天然氨基酸多肽結合，而留下另一個經保護的末端在脫保護之后用于其它鍵聯反應?；蛘撸瑢υ噭┑幕瘜W計量的仔細操作可提供類似的結果(異質二聚物)，即使在所述結果中所需異質二聚物可能會受到一些同型二聚物污染。
圖27呈示通過經由雙官能同型連接子偶合兩個蛋白質來進行蛋白質二聚化的說明性實施例。
圖25呈示使用異型雙官能連接子的說明性實施例，其中所述連接子具有兩個不同末端，僅舉例來說，羰基和反應性基團。另外，圖25呈示在多步合成中使用異型雙官能連接子來連接PEG基團與非天然氨基酸多肽的說明性實施例。在第一步中，如此說明性圖式中所示，含肼的非天然氨基酸多肽與含羰基的雙官能連接子反應形成含吲哚的非天然氨基酸多肽。然而，雙官能連接子仍保留反應性官能團，所述官能團在第二步中與PEG試劑反應以通過雜環(huán)鍵聯形成PEG化非天然氨基酸多肽。
本發(fā)明中描述的方法和組合物也提供多肽組合，諸如同型二聚物、異質二聚物、同型多聚物或異質多聚物(即，三聚物、四聚物等)。僅舉例來說，以下描述著重于GH超基因家族成員，但這個部分中所描述的方法、技術和組合物也可應用于呈二聚物和多聚物形式的幾乎任何其它可提供益處的多肽，包括(僅舉例來說)治療蛋白。
因此，本發(fā)明中描述的方法、技術和組合物中涵蓋直接結合到多肽主鏈上或通過連接子結合到另一GH超基因家族成員或其變異體或非GH超基因家族成員的任何其它多肽或其變異體上的含有一個或一個以上非天然氨基酸的GH超基因家族成員多肽。由于與單體相比分子量有所增大，所以GH超基因家族成員二聚物或多聚物接合物可展現新穎或需要的性質，包括(但不限于)相對于單體GH超基因家族成員展現不同的藥理學、藥物動力學、藥效學、經調節(jié)的治療半衰期或經調節(jié)的血漿半衰期。在一些實施例中，本發(fā)明中描述的GH超基因家族成員二聚物將調節(jié)GH超基因家族成員受體的二聚化。在其它實施例中，本發(fā)明中描述的GH超基因家族成員二聚物或多聚物將充當GH超基因家族成員受體拮抗劑、激動劑或調節(jié)劑。
在一些實施例中，GH超基因家族成員多肽是(包括，但不限于)通過Asn-Lys酰胺鍵或Cys-Cys二硫鍵直接鍵聯。在一些實施例中，鍵聯的GH超基因家族成員多肽和/或鍵聯的非GH超基因家族成員將包含不同的非天然氨基酸來促進二聚化，其包括(但不限于)第一GH超基因家族成員，和/或鍵聯的非GH超基因家族成員，包含與包含含肼的非天然氨基酸的第二GH超基因家族成員多肽接合的含羰基的非天然氨基酸的多肽，并且所述多肽是通過形成相應吲哚來進行反應。
或者，兩種GH超基因家族成員多肽和/或鍵聯的非GH超基因家族成員是通過連接子鍵聯?？墒褂萌魏萎愋碗p官能連接子或同型雙官能連接子來連接兩種GH超基因家族成員，和/或鍵聯的非GH超基因家族成員、多肽，這些多肽可具有相同或不同的一級序列。在一些情況下，用于將GH超基因家族成員和/或鍵聯的非GH超基因家族成員、多肽束縛在一起的連接子可為雙官能PEG試劑。
在一些實施例中，本發(fā)明中描述的方法和組合物提供具有啞鈴結構的水溶性雙官能連接子，所述結構包括a)在聚合物主鏈的至少第一末端上的疊氮化物、炔、肼、二胺、酰肼、羥胺或含有羰基(包括二羰基)的部分；以及b)至少一個在聚合物主鏈的第二末端上的第二官能團。第二官能團可與第一官能團相同或不同。在一些實施例中，第二官能團不與第一官能團反應。在一些實施例中，本發(fā)明中描述的方法和組合物提供包含支化分子結構的至少一個臂的水溶性化合物。舉例來說，支化分子結構可為樹枝狀。
在一些實施例中，本發(fā)明中描述的方法和組合物提供通過與具有以下結構的水溶性活化聚合物反應而形成的包含一種或一種以上GH超基因家族成員的多聚物 R-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-X， 其中n為約5到約3,000，m為2-10，X可為疊氮化物、炔、肼、二胺、酰肼、羥胺、乙?；?，或含有羰基(包括二羰基)的部分，并且R為封端基團、官能團，或可與X相同或不同的離去基團。R可為(例如)選自由以下各基團組成的群組的官能團羥基、經保護羥基、烷氧基、N-羥基丁二醯亞胺酯、1-苯并三唑基酯、碳酸N-羥基丁二醯亞胺酯、碳酸1-苯并三唑基酯、縮醛、醛、水合醛、烯基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、活性砜、胺、氨基氧基、經保護胺、酰肼、經保護酰肼、經保護硫醇、羧酸、經保護羧酸、異氰酸酯、異硫氰酸酯、馬來酰亞胺、乙烯基砜、二硫代吡啶、乙烯基吡啶、碘乙酰胺、環(huán)氧化物、乙二醛、二酮、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯，以及三氟乙基磺酸酯、烯和酮。在另一個實施例中，連接子基團可用于鍵聯轉錄因子?；蛐枰鄠€轉錄因子以有效地起始編碼蛋白質的表達。用非天然氨基酸合成的轉錄因子可通過如上所述的連接子進行鍵聯，并且用于增強靶向基因的人工活化。所鍵聯的轉錄因子可在不存在正?；罨盘柤壜摰那闆r下結合標靶DNA并促進RNA聚合酶的募集，因而在無所需信號的情況下表達基因。在另一個實施例中，細胞受體的配體可經鍵聯以有效活化受體。血小板衍生生長因子(PDGF)形成二聚物以結合其受體。含有非天然氨基酸的PDGF可在二聚物形成時通過如上所述的連接子進行鍵聯，并且經投與以提供與PDGF受體的有效結合。鍵聯蛋白質的其它實施例包括鍵聯抗體。兩種不同抗體(各自對相同或相鄰標靶上的唯一抗原決定基具特異性)可經鍵聯以增強刺激、結合或中和作用。舉例來說，對HIV的gp120和相締合gp40上存在的兩種不同抗原決定基具特異性的抗體可經鍵聯以提供更有效的標靶中和作用。類似地，所鍵聯抗體可用于刺激細胞表面受體。舉例來說，T細胞受體的CD3抗體以及CD4抗體可經鍵聯以提供對受體活化的必要刺激。另一實施例包括與核酸鍵聯的肽。舉例來說，可將結合細胞表面的細胞受體或蛋白質的配體與投與所需標靶的治療性核酸鍵聯。所鍵聯配體促進核酸的攝取，所述核酸隨后在細胞中表達以發(fā)揮其治療作用。類似地，可將肽與核酸鍵聯以促進核酸的包裝或濃縮。
連接子上的官能團不必一致，其也不需為苯基肼基。本說明書中詳述的化學允許設計至少一個官能團可與非天然氨基酸多肽反應形成吲哚基團的連接子；在一些實施例中，連接子上的其它官能團利用文獻所記載的其它方法，包括基于親核試劑/親電子試劑的化學。
C.添加官能團的實施例易化多肽的分離性質 天然存在或非天然氨基酸多肽可能因包括(但不限于)多肽的溶解性或結合特征的多種原因而難以從樣本中分離。舉例來說，在制備用于治療用途的多肽時，可能從已經工程化設計以過度生產此類多肽的重組系統中分離所述多肽。然而，由于多肽的溶解性或結合特征，通常證實難以達到所需程度的純度。本發(fā)明中描述的方法、組合物、技術和策略提供這種情形的解決辦法。
本發(fā)明中描述的方法、組合物、技術和策略允許制備與所需多肽同源的含雜環(huán)(包括含氮雜環(huán))的非天然氨基酸多肽，其中所述含雜環(huán)(包括含氮雜環(huán))的非天然氨基酸多肽具有改良的分離特征。在一個實施例中，通過生物合成制備同源非天然氨基酸多肽。在另一個或另外的實施例中，非天然氨基酸已將其結構并入本發(fā)明中描述的一種非天然氨基酸中。在另一個或另外的實施例中，在末端或內部位置處并入非天然氨基酸并且進一步位點特異性并入非天然氨基酸。
在一個實施例中，如通過生物合成所制備的所得非天然氨基酸已經具有所需的改良分離特征。在其它或另外的實施例中，所述非天然氨基酸包含與提供改良分離特征的基團鍵聯的雜環(huán)(包括含氮雜環(huán))鍵聯。在其它或另外的實施例中，進一步修飾非天然氨基酸以形成含有經修飾的雜環(huán)(包括含氮雜環(huán))的非天然氨基酸多肽，其中所述修飾提供與提供改良分離特征的基團鍵聯的雜環(huán)(包括含氮雜環(huán))。在一些實施例中，所述基團是直接鍵聯到非天然氨基酸上，并且在其它實施例中，所述基團是通過連接子基團與非天然氨基酸鍵聯。在某些實施例中，所述基團是通過單一化學反應連接到非天然氨基酸上，在其它實施例中，需要一系列化學反應將所述基團連接到非天然氨基酸上。優(yōu)選在所利用的反應條件下將賦予改良分離特征的基團位點特異性地鍵聯到非天然氨基酸多肽中的非天然氨基酸上，而并非鍵聯到天然存在氨基酸上。
在其它或另外的實施例中，所得非天然氨基酸多肽與GH超基因家族成員同源，然而，這個部分中所描述的方法、技術和組合物也可應用于可從改良分離特征獲益的幾乎任何其它多肽，所述多肽包括(僅舉例來說)治療蛋白。
在其它或另外的實施例中，賦予改良分離特征的基團改良多肽的水溶性；在其它實施例中，所述基團改良多肽的結合性質；在其它實施例中，所述基團向多肽提供新的結合性質(包括(僅舉例來說)生物素基團或生物素結合基團)。在所述基團改良多肽的水溶性的實施例中，所述基團是選自本發(fā)明中描述的水溶性聚合物，包括(僅舉例來說)本發(fā)明中描述的任何PEG聚合物基團。
B.添加官能團的實施例檢測多肽的存在 天然存在或非天然氨基酸多肽在樣本(包括活體內樣本和活體外樣本)中可能因包括(但不限于)缺乏可易于與多肽結合的試劑或標記的多種原因而難以檢測。本發(fā)明中描述的方法、組合物、技術和策略提供這種情形的解決辦法。
本發(fā)明中描述的方法、組合物、技術和策略允許制備與所需多肽同源的含有雜環(huán)(包括含氮雜環(huán))的非天然氨基酸多肽，其中所述含有雜環(huán)(包括含氮雜環(huán))的非天然氨基酸多肽允許檢測在活體內樣本和活體外樣本中的多肽。在一個實施例中，通過生物合成制備同源非天然氨基酸多肽。在另一個或另外的實施例中，非天然氨基酸已將其結構并入本發(fā)明中描述的一種非天然氨基酸中。在另一個或另外的實施例中，在末端或內部位置處并入非天然氨基酸并且進一步位點特異性并入非天然氨基酸。
在一個實施例中，如通過生物合成所制備的所得非天然氨基酸多肽已經具有所需的檢測特征。在其它或另外的實施例中，所述非天然氨基酸多肽包含至少一個選自由含羰基的非天然氨基酸、含肼的非天然氨基酸(包括含吲哚的氨基酸)組成的群組的非天然氨基酸以提供改良的檢測特征。在其它實施例中，這些非天然氨基酸已如本發(fā)明中所述通過生物合成并入多肽中。在其它或替代實施例中，非天然氨基酸多肽包含至少一個選自式I-XV的氨基酸的非天然氨基酸。在其它或替代實施例中，非天然氨基酸多肽包含至少一個選自結構1-4的化合物的氨基酸的非天然氨基酸。在其它或另外的實施例中，非天然氨基酸包含提供改良的檢測特征的吲哚鍵聯。在其它或另外的實施例中，進一步修飾非天然氨基酸以形成經修飾的含吲哚的非天然氨基酸多肽，其中所述修飾提供與提供改良檢測特征的基團鍵聯的含吲哚的鍵聯。在一些實施例中，所述基團是直接鍵聯到非天然氨基酸上，并且在其它實施例中，所述基團是通過連接子基團與非天然氨基酸鍵聯。在某些實施例中，所述基團是通過單一化學反應連接到非天然氨基酸上，在其它實施例中，需要一系列化學反應將所述基團連接到非天然氨基酸上。優(yōu)選在所利用的反應條件下將賦予改良檢測特征的基團位點特異性地鍵聯到非天然氨基酸多肽中的非天然氨基酸上，而并非鍵聯到天然存在氨基酸上。
在其它或另外的實施例中，所得非天然氨基酸多肽與GH超基因家族成員同源，然而，這個部分中所描述的方法、技術和組合物也可應用于在活體內樣本和活體外樣本中需要檢測的幾乎任何其它多肽，所述多肽包括(僅舉例來說)治療蛋白。
在其它或另外的實施例中，賦予改良檢測特征的基團是選自由以下各物組成的群組標記；染料；親和性標記；光親和性標記；自旋標記；熒光團；放射性部分；結合有重原子的部分；經同位素標記的部分；生物物理探針；磷光基團；化學發(fā)光基團；電子致密基團；磁性基團；發(fā)色團；能量轉移劑；可檢測標記；以及其任何組合。
在一個實施例中，使抗體經工程化設計以含有吲哚非天然氨基酸，并且所述抗體識別癌細胞上的獨特抗原。在通過本發(fā)明中描述的方法用吲哚標記或修飾抗體并且純化經標記抗體后，將其投與到疑似患有可由經標記抗體識別的癌癥的個體中。在投與經標記抗體后，經標記抗體在患者體內的存在和位置可鑒別癌組織的存在。投與經標記抗體允許檢測患者內的癌癥，個體內的轉移和/或個體內癌癥治療的功效。
在另一個實施例中，使與細胞表面上的抗原結合的肽經工程化設計以含有染料(包括(但不限于)熒光染料)，其可用于在將肽投與到個體后追蹤所述肽。染料是通過位于肽內的非天然氨基酸與肽連接，并且將肽投與到個體。利用文獻所記載的成象或檢測技術來實現肽與其配體的結合的定位。
在另一個實施例中是檢測患者中多肽的存在的方法，所述方法包含投與有效量的同源非天然氨基酸多肽，所述非天然氨基酸多肽包含至少一個具有化合物1-4的結構的非天然氨基酸

其中 A是可選的，并且當存在時為低碳亞烷基、經取代低碳亞烷基、低碳亞環(huán)烷基、經取代低碳亞環(huán)烷基、低碳亞烯基、經取代低碳亞烯基、亞炔基、經取代亞炔基、低碳亞雜烷基、經取代亞雜烷基、低碳亞雜環(huán)烷基、經取代低碳亞雜環(huán)烷基、亞芳基、經取代亞芳基、亞雜芳基、經取代亞雜芳基、亞烷芳基、經取代亞烷芳基、亞芳烷基或經取代亞芳烷基； B是可選的，并且當存在時為在一端處與含吲哚的部分鍵聯的連接子，所述連接子選自由以下各基團組成的群組低碳亞烷基、經取代低碳亞烷基、低碳亞烯基、經取代低碳亞烯基、低碳亞雜烷基、經取代低碳亞雜烷基、-亞芳基、經取代亞芳基、亞雜芳基、經取代亞雜芳基、-O-、-O-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-S-、-S-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-S(O)k-(其中k為1、2或3)、-S(O)k(亞烷基或經取代亞烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、-C(O)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-N(R′)CO-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)C(NCN)N(R′)-、-N(R′)C(NNO2)N(R′)-、-N(R′)C(NCOOR′)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)2-N＝N-和-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，并且R′各自獨立地為H、烷基或經取代烷基； R1為H、氨基保護基、樹脂、至少一個氨基酸、多肽或多核苷酸；并且 R2為OH、酯保護基、樹脂、至少一個氨基酸、多肽或多核苷酸； n為0、1、2或3，并且m為0、1、2或3，條件是n或m中的至少一個不為0； 其中，具有相締合Ra基團的結構1、2、3和4中的各環(huán)可含有0、1或2個Ra基團，并且Ra是各自獨立地選自由H、鹵素、烷基、經取代烷基、-N(R″)2、-C(O)R″、-C(O)N(R″)2、-OR″和-S(O)kR″(其中k為1、2或3)組成的群組，其中R″各自獨立地為H、烷基或經取代烷基；或當存在一個以上Ra基團時，兩個Ra可視情況形成芳基、環(huán)烷基或雜環(huán)烷基； R3與R4各自獨立地為H、鹵素、低碳烷基或經取代低碳烷基，或R3與R4或兩個R3基團視情況形成環(huán)烷基或雜環(huán)烷基； R5各自獨立地為H、鹵素、烷基、經取代烷基、烯基、經取代烯基、炔基、經取代炔基、烷氧基、經取代烷氧基、烷基烷氧基、經取代烷基烷氧基、聚氧化烯、經取代聚氧化烯、芳基、經取代芳基、雜芳基、經取代雜芳基、烷芳基、經取代烷芳基、芳烷基、經取代芳烷基、-(亞烷基或經取代亞烷基)-ON(R″)2、OH、NH2、CN、NO2、-(亞烷基或經取代亞烷基)-C(O)SR″、-(亞烷基或經取代亞烷基)-S-S-(芳基或經取代芳基)、-C(O)R″、-C(O)2R″或-C(O)N(R″)2，其中R″各自獨立地為氫、烷基、經取代烷基、烯基、經取代烯基、烷氧基、經取代烷氧基、芳基、經取代芳基、雜芳基、烷芳基、經取代烷芳基、芳烷基或經取代芳烷基，或當存在一個以上R″基團時，兩個R″視情況形成雜環(huán)烷基； 或R5為L-X，其中，X是選自由以下各物組成的群組標記；染料；聚合物；水溶性聚合物；聚乙二醇的衍生物；光交聯劑；細胞毒性化合物；藥物；親和性標記；光親和性標記；反應性化合物；樹脂；第二蛋白質或多肽或多肽類似物；抗體或抗體片段；金屬螯合劑；輔因子；脂肪酸；碳水化合物；多核苷酸；DNA；RNA；反義多核苷酸；糖類、水溶性樹枝狀聚合物、環(huán)糊精、生物材料；納米粒子；自旋標記；熒光團、含金屬的部分；放射性部分；新穎官能團；與其它分子共價或非共價相互作用的基團；光籠化部分；光化輻射可激發(fā)的部分；配體；可光致異構化部分；生物素；生物素類似物；結合有重原子的部分；可化學裂解的基團；可光裂解的基團；延長的側鏈；碳鍵聯的糖；氧化還原活性劑；氨基硫代酸；毒性部分；經同位素標記的部分；生物物理探針；磷光基團；化學發(fā)光基團；電子致密基團；磁性基團；插入基團；發(fā)色團；能量轉移劑；生物活性劑；可檢測標記；小分子；抑制性核糖核酸；放射性核苷酸；中子俘獲劑；生物素的衍生物；量子點；納米傳遞素；放射性傳遞素；抗體酶、活化復合激活劑、病毒、佐劑、糖苷配基、過敏原、血管抑素、抗激素、抗氧化劑、適體、向導RNA、皂角苷、穿梭載體、大分子、擬抗原決定基、受體、反膠束和其任何組合；并且L是可選的，并且當存在時為選自由以下各基團組成的群組的連接子亞烷基、經取代亞烷基、亞烯基、經取代亞烯基、-O-、-O-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-S-、-S-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-S(O)k-(其中k為1、2或3)、-S(O)k(亞烷基或經取代亞烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-N(R′)CO-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-N(R′)C(O)O-、-(亞烷基或經取代亞烷基)-O-N＝CR′-、-(亞烷基或經取代亞烷基)-C(O)NR′-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-(亞烷基或經取代亞烷基)-S(O)k-(亞烷基或經取代亞烷基)-S-、-(亞烷基或經取代亞烷基)-S-S-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、-N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-和-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自獨立地為H、烷基或經取代烷基； 當存在一個以上R5基團時，兩個鄰位R5基團可視情況形成雜環(huán)烷基或芳香族雜環(huán)烷基； 或含-B-吲哚的部分合起來形成包含至少一個吲哚部分的雙環(huán)或三環(huán)環(huán)烷基或雜環(huán)烷基； 或其活性代謝物、鹽或醫(yī)藥學上可接受的前藥或溶劑化物。
在另一個實施例中是檢測患者中多肽的存在的方法，所述方法包含投與有效量的同源非天然氨基酸多肽，所述非天然氨基酸多肽包含至少一個具有化合物1-4的結構的非天然氨基酸，其中在多肽內的特定位點處并入所述至少一個非天然氨基酸。在另一個實施例中是檢測患者中多肽的存在的方法，所述方法包含投與有效量的同源非天然氨基酸多肽，所述非天然氨基酸多肽包含至少一個具有化合物1-4的結構的非天然氨基酸，其中使用翻譯系統并入所述非天然氨基酸。在另一個實施例中是檢測患者中多肽的存在的方法，所述方法包含投與有效量的同源非天然氨基酸多肽，所述非天然氨基酸多肽包含至少一個具有化合物1-4的結構的非天然氨基酸，其中使用翻譯系統和翻譯后修飾系統將所述非天然氨基酸并入多肽中。在另一個實施例中是檢測患者中多肽的存在的方法，所述方法包含投與有效量的同源非天然氨基酸多肽，所述非天然氨基酸多肽包含至少一個具有化合物1-4的結構的非天然氨基酸，其中所述至少一個非天然氨基酸在水溶液中穩(wěn)定至少1個月。在另一個實施例中是檢測患者中多肽的存在的方法，所述方法包含投與有效量的同源非天然氨基酸多肽，所述非天然氨基酸多肽包含至少一個具有化合物1-4的結構的非天然氨基酸，其中所述至少一個非天然氨基酸穩(wěn)定至少2周。在另一個實施例中是檢測患者中多肽的存在的方法，所述方法包含投與有效量的同源非天然氨基酸多肽，所述非天然氨基酸多肽包含至少一個具有化合物1-4的結構的非天然氨基酸，其中所述至少一個非天然氨基酸穩(wěn)定至少5天。
在另一個實施例中是檢測患者中多肽的存在的方法，所述方法包含投與有效量的同源非天然氨基酸多肽，所述非天然氨基酸多肽包含至少一個具有化合物1-4的結構的非天然氨基酸，其中所述多肽是與選自由以下各物組成的群組的治療蛋白同源的蛋白質α-1抗胰蛋白酶、血管抑素、抗溶血因子、抗體、載脂蛋白、脫輔基蛋白、心房利鈉因子、心房利鈉多肽、心房肽、C-X-C趨化因子、T39765、NAP-2、ENA-78、gro-a、gro-b、gro-c、IP-10、GCP-2、NAP-4、SDF-1、PF4、MIG、降血鈣素、c-kit配體、細胞因子、CC趨化因子、單核細胞趨化蛋白-1、單核細胞趨化蛋白-2、單核細胞趨化蛋白-3、單核細胞炎性蛋白-1α、單核細胞炎性蛋白-iβ、RANTES、1309、R83915、R91733、HCC1、T58847、D31065、T64262、CD40、CD40配體、c-kit配體、膠原蛋白、菌落刺激因子(CSF)、補體因子5a、補體抑制劑、補體受體1、細胞因子、上皮中性粒細胞激活肽-78、MIP-16、MCP-1、表皮生長因子(EGF)、上皮中性粒細胞激活肽、紅細胞生成素(EPO)、剝脫性毒素、因子IX、因子VII、因子VIII、因子X、成纖維細胞生長因子(FGF)、纖維蛋白原、纖維粘連蛋白、四螺旋束蛋白、G-CSF、glp-1、GM-CSF、葡糖腦苷脂酶、促性腺激素、生長因子、生長因子受體、grf、刺猬蛋白、血紅蛋白、肝細胞生長因子(hGF)、水蛭素、人類生長激素(hGH)、人類血清白蛋白、ICAM-1、ICAM-1受體、LFA-1、LFA-1受體、胰島素、類胰島素生長因子(IGF)、IGF-I、IGF-II、干擾素(IFN)、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、白細胞介素(IL)、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、角質細胞生長因子(KGF)、乳鐵蛋白、白血病抑制因子、熒光素酶、神經素、中性粒細胞抑制因子(NIF)、抑瘤素M、成骨蛋白、癌基因產物、paracitonin、甲狀旁腺激素、PD-ECSF、PDGF、肽激素、多效營養(yǎng)因子、蛋白質A、蛋白質G、pth、致熱外毒素A、致熱外毒素B、致熱外毒素C、pyy、松弛素、腎素、SCF、小生物合成蛋白、可溶性補體受體I、可溶性I-CAM1、可溶性白細胞介素受體、可溶性TNF受體、生長調節(jié)素、生長抑素、生長激素、鏈激酶、超抗原、葡萄球菌腸毒素、SEA、SEB、SEC1、SEC2、SEC3、SED、SEE、類固醇激素受體、超氧化物歧化酶、中毒性休克綜合癥毒素、胸腺素α1、組織型纖溶酶原激活劑、腫瘤生長因子(TGF)、腫瘤壞死因子、腫瘤壞死因子α、腫瘤壞死因子β、腫瘤壞死因子受體(TNFR)、VLA-4蛋白、VCAM-1蛋白、血管內皮生長因子(VEGF)、尿激酶、mos、ras、raf、met、p53、tat、fos、myc、jun、myb、rel、雌激素受體、孕酮受體、睪丸激素受體、醛固酮受體、LDL受體和皮質酮。
在另一個實施例中，含吲哚的部分是通過位于肽、多肽或蛋白質內的非天然氨基酸與所述肽、多肽或蛋白質連接。通過文獻所記載的方法將經適當標記的肽、多肽或蛋白質投與到所需個體以進行檢測和成象。通過這些經標記肽、多肽或蛋白質，可使多種疾病、代謝途徑、生理結構或細胞組分成象。舉例來說，可使用熒光成象顯微術來檢測個體內經標記肽、多肽或蛋白質的存在。
C.添加官能團的實施例改良多肽的治療性質 天然存在或非天然氨基酸多肽應能夠向患有特定病癥、疾病或病狀的患者提供某種治療益處。此治療益處應取決于多種因素，包括(僅舉例來說)多肽的安全性概況，以及多肽的藥物動力學、藥理學和/或藥效學(例如，水溶性、生物可用性、血清半衰期、治療半衰期、免疫原性、生物活性或循環(huán)時間)。另外，向諸如連接的細胞毒性化合物或藥物等多肽提供其它官能團可為有利的，或可能需要與其它多肽連接以形成本發(fā)明中描述的同型多聚物和異型多聚物。優(yōu)選這些修飾不破壞原始多肽的活性和/或三級結構。本發(fā)明中描述的方法、組合物、技術和策略提供這些問題的解決辦法。
所描述的方法、組合物、技術和策略允許制備與所需多肽同源的含雜環(huán)(包括含氮雜環(huán))的非天然氨基酸多肽，其中所述含雜環(huán)(包括含氮雜環(huán))的非天然氨基酸多肽具有改良的治療特征。在一個實施例中，通過生物合成制備同源非天然氨基酸多肽。在另一個或另外的實施例中，非天然氨基酸已將其結構并入本發(fā)明中描述的一種非天然氨基酸中。在另一個或另外的實施例中，在末端或內部位置處并入非天然氨基酸并且進一步位點特異性并入非天然氨基酸。
在一個實施例中，如通過生物合成所制備的所得非天然氨基酸已經具有所需的改良治療特征。在其它或另外的實施例中，非天然氨基酸包含與提供改良治療特征的基團鍵聯的雜環(huán)(包括含氮雜環(huán))鍵聯。在其它或另外的實施例中，進一步修飾非天然氨基酸以形成經修飾的含雜環(huán)(包括含氮雜環(huán))的非天然氨基酸多肽，其中所述修飾提供與提供改良治療特征的基團鍵聯的雜環(huán)(包括含氮雜環(huán))鍵聯。在一些實施例中，所述基團是直接鍵聯到非天然氨基酸上，并且在其它實施例中，所述基團是通過連接子基團與非天然氨基酸鍵聯。在某些實施例中，所述基團是通過單一化學反應連接到非天然氨基酸上，在其它實施例中，需要一系列化學反應將所述基團連接到非天然氨基酸上。優(yōu)選在所利用的反應條件下將賦予改良治療特征的基團位點特異性地鍵聯到非天然氨基酸多肽中的非天然氨基酸上，而并非鍵聯到天然存在氨基酸上。
在其它或另外的實施例中，所得非天然氨基酸多肽與GH超基因家族成員同源，然而，這個部分中所描述的方法、技術和組合物也可應用于可從改良治療特征獲益的幾乎任何其它多肽，所述多肽包括(僅舉例來說)治療蛋白。
在其它或另外的實施例中，賦予改良治療特征的基團改良多肽的水溶性；在其它實施例中，所述基團改良多肽的結合性質；在其它實施例中，所述基團向多肽提供新的結合性質(包括(僅舉例來說)生物素基團或生物素結合基團)。在所述基團改良多肽的水溶性的實施例中，所述基團是選自本發(fā)明中描述的水溶性聚合物，包括(僅舉例來說)PEG聚合物基團。在其它或另外的實施例中，所述基團為細胞毒性化合物，而在其它實施例中，所述基團為藥物。在其它實施例中，所鍵聯的藥物或細胞毒性化合物可從非天然氨基酸多肽上裂解以將藥物或細胞毒性化合物傳遞到所需治療位置。在其它實施例中，所述基團為第二多肽，其包括(舉例來說)含雜環(huán)(包括含氮雜環(huán))的非天然氨基酸多肽，其進一步包括(例如)具有與第一非天然氨基酸多肽相同的氨基酸結構的多肽。
在其它或另外的實施例中，含雜環(huán)(包括含氮雜環(huán))的非天然氨基酸多肽為經修飾的含雜環(huán)(包括含氮雜環(huán))的非天然氨基酸多肽。在其它或另外的實施例中，相對于同源天然存在氨基酸多肽來說，含雜環(huán)(包括含氮雜環(huán))的非天然氨基酸多肽增加多肽的生物可用性。在其它或另外的實施例中，相對于同源天然存在氨基酸多肽來說，含雜環(huán)(包括含氮雜環(huán))的非天然氨基酸多肽增加多肽的安全性概況。在其它或另外的實施例中，相對于同源天然存在氨基酸多肽來說，含雜環(huán)(包括含氮雜環(huán))的非天然氨基酸多肽增加多肽的水溶性。在其它或另外的實施例中，相對于同源天然存在氨基酸多肽來說，含雜環(huán)(包括含氮雜環(huán))的非天然氨基酸多肽增加多肽的治療半衰期。在其它或另外的實施例中，相對于同源天然存在氨基酸多肽來說，含雜環(huán)(包括含氮雜環(huán))的非天然氨基酸多肽增加多肽的血清半衰期。在其它或另外的實施例中，相對于同源天然存在氨基酸多肽來說，含雜環(huán)(包括含氮雜環(huán))的非天然氨基酸多肽延長多肽的循環(huán)時間。在其它或另外的實施例中，相對于同源天然存在氨基酸多肽來說，含雜環(huán)(包括含氮雜環(huán))的非天然氨基酸多肽調節(jié)多肽的生物活性。在其它或另外的實施例中，相對于同源天然存在氨基酸多肽來說，含雜環(huán)(包括含氮雜環(huán))的非天然氨基酸多肽調節(jié)多肽的免疫原性。
XI.經修飾多肽的治療用途 為方便起見，這個部分中所描述的經修飾或未經修飾的非天然氨基酸多肽已經一般性描述和/或用特定實施例加以描述。然而，這個部分中所描述的經修飾或未經修飾的非天然氨基酸多肽不應僅限于這個部分中所提供的一般描述或特定實施例，而是這個部分中所描述的經修飾或未經修飾的非天然氨基酸多肽同樣良好適用于處于式I-XV的范圍內的所有經修飾或未經修飾的包含至少一個非天然氨基酸的非天然氨基酸多肽和具有結構1-4的化合物，包括處于本發(fā)明中的說明書、權利要求以及圖式中所描述的式I-LXV的范圍內的任何子式或特定化合物。
本發(fā)明中描述的經修飾或未經修飾的非天然氨基酸多肽(包括其同型多聚物和異型多聚物)存在多種用途，包括(但不限于)治療用途、診斷用途、基于檢定的用途、工業(yè)用途、化妝品用途、植物生物學用途、環(huán)境用途、能量產生用途、消費品用途和/或軍事用途。作為非限制性說明，提供經修飾或未經修飾的非天然氨基酸多肽的以下治療用途。
本發(fā)明中描述的經修飾或未經修飾的非天然氨基酸多肽適用于治療多種病癥、病狀或疾病。投與本發(fā)明中描述的經修飾或未經修飾的非天然氨基酸多肽產品在人類中產生由市售多肽制劑所顯示的任何活性。經修飾或未經修飾的非天然氨基酸多肽產品的平均量可改變，并且尤其應根據合格醫(yī)師的建議和處方而改變。經修飾或未經修飾的非天然氨基酸多肽的確切量應優(yōu)先根據以下因素進行選擇諸如所治療病狀的確切類型、所治療患者的病狀，以及組合物中的其它成分。所欲給予的量可根據使用經修飾或未經修飾的非天然氨基酸多肽的療法來確定。
A.投藥和醫(yī)藥組合物 如本發(fā)明中所述的經修飾或未經修飾的非天然氨基酸多肽(包括(但不限于)合成酶、包含一個或一個以上非天然氨基酸的蛋白質等)視情況用于治療用途，包括(但不限于)與合適醫(yī)藥載劑組合。這些組合物(例如)包含治療有效量的如本發(fā)明中所述的經修飾或未經修飾的非天然氨基酸多肽，以及醫(yī)藥學上可接受的載劑或賦形劑。所述載劑或賦形劑包括(但不限于)生理食鹽水、緩沖生理食鹽水、右旋糖、水、丙三醇、乙醇和/或其組合。進行調配以適應投藥模式。一般來說，投與蛋白質的方法可應用于投與如本發(fā)明中所述的經修飾或未經修飾的非天然氨基酸多肽。
根據文獻所記載的方法，視情況在一種或一種以上患病的適當活體外和/或活體內動物模型中測試包含一種或一種以上如本發(fā)明中所述的經修飾或未經修飾的非天然氨基酸多肽的治療組合物，以確定功效、組織代謝并估算劑量。具體來說，最初可通過非天然氨基酸相對于天然氨基酸同源物(包括(但不限于)將經修飾以包括一個或一個以上非天然氨基酸的多肽與天然氨基酸多肽加以比較)的活性、穩(wěn)定性或其它合適量度(即，在相關檢定中)來確定劑量。
通過通常用于引入分子以最終與血液或組織細胞接觸的任何途徑來進行投藥。如本發(fā)明中所述的經修飾或未經修飾的非天然氨基酸多肽是視情況與一種或一種以上醫(yī)藥學上可接受的載劑一起以任何合適方式投與?？色@得向患者投與如本發(fā)明中所述的經修飾或未經修飾的非天然氨基酸多肽的合適方法，并且盡管可使用一種以上的途徑來投與特定組合物，但特定途徑通常可比另一種途徑提供更直接并且更有效的作用或反應。
醫(yī)藥學上可接受的載劑在某種程度上由所投與的特定組合物以及由用于投與所述組合物的特定方法確定。因此，存在多種本發(fā)明中描述的醫(yī)藥組合物的合適調配物。
可通過適用于蛋白質或肽的任何途徑來投與本發(fā)明中描述的非天然氨基酸多肽和包含這些多肽的組合物，所述途徑包括(但不限于)不經腸投與，例如注射，其包括(但不限于)經皮下注射或經靜脈內注射或注射或輸注的任何其它形式?？赏ㄟ^眾多途徑來投與多肽醫(yī)藥組合物(包括本發(fā)明中描述的各種非天然氨基酸多肽)，所述途徑包括(但不限于)經口、靜脈內、腹膜內、肌肉內、經皮、皮下、局部、舌下或直腸方式。也可通過脂質體來投與包含如本發(fā)明中所述的經修飾或未經修飾的非天然氨基酸多肽的組合物。本發(fā)明中描述的非天然氨基酸多肽也可單獨使用或與其它合適組分(包括(但不限于)醫(yī)藥載劑)組合使用。
也可將單獨或與其它合適組分組合的如本發(fā)明中所述的經修飾或未經修飾的非天然氨基酸多肽制成可通過吸入投與的氣霧劑調配物(即，其可“霧化”)。可將氣霧劑調配物置入加壓的可接受推進劑(諸如二氯二氟甲烷、丙烷、氮氣等)中。
適用于不經腸投與(舉例來說，通過關節(jié)內(在關節(jié)內)、靜脈內、肌肉內、皮內、腹膜內和皮下途徑)的調配物包括水性和非水性等張無菌注射溶液，其可含有抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑以及使調配物與預期接受者的血液等張的溶質；以及水性和非水性無菌懸浮液，其可包括懸浮劑、增溶劑、增稠劑、穩(wěn)定劑和防腐劑。經包裝核酸的調配物可以單位劑量或多劑量密封容器(諸如安瓿和小瓶)呈遞。
不經腸投藥和靜脈內投藥為優(yōu)選投藥方法。具體來說，已用于天然氨基酸同源物治療劑的投藥途徑(包括(但不限于)通常用于EPO、IFN、GH、G-CSF、GM-CSF、IFN、白細胞介素、抗體和/或任何其它醫(yī)藥傳遞蛋白質的那些投藥途徑)以及目前使用的調配物提供用于如本發(fā)明中所述的經修飾或未經修飾的非天然氨基酸多肽的優(yōu)選投藥途徑和調配物。
在本發(fā)明中描述的組合物和方法的情形下，投與到患者中的劑量足以隨時間在患者中產生有益治療反應。劑量由特定調配物的功效和所使用的經修飾或未經修飾的非天然氨基酸多肽的活性、穩(wěn)定性或血清半衰期和患者的病狀，以及所欲治療的患者的體重或表面積來確定。也通過在特定患者中投與特定調配物等所伴隨的任何不良副作用的存在、性質和程度來確定劑量大小。
在確定在治療或預防疾病(包括(但不限于)癌癥、遺傳疾病、糖尿病、AIDS等)時所欲投與的調配物的有效量時，醫(yī)師評估循環(huán)血漿水平、調配物毒性、疾病的進展和/或(如果相關)抗非天然氨基酸多肽抗體的產生。
投與到(例如)70公斤的患者中的劑量通常在等效于關于相關組合物的改變的活性或血清半衰期所調節(jié)的目前所用治療蛋白的劑量的范圍內。本發(fā)明中描述的醫(yī)藥調配物可補充多種療法(包括抗體投與，疫苗投與，細胞毒性劑、天然氨基酸多肽、核酸、核苷酸類似物、生物反應調節(jié)劑等的投與)。
對于投藥來說，本發(fā)明中描述的醫(yī)藥調配物是以由相關調配物的LD-50或ED-50和/或對在各種濃度(包括(但不限于)當應用于患者的質量和總體健康狀況時)下經修飾或未經修飾的非天然氨基酸多肽的任何副作用的觀測所確定的速率來投與?？赏ㄟ^單次給藥或分次給藥來實現投藥。
如果經歷調配物輸注的患者出現發(fā)熱、發(fā)冷或肌肉痛，那么就使其接受適當劑量的阿斯匹林(aspirin)、布洛芬(ibuprofen)、醋氨酚(acetaminophen)或其它疼痛/發(fā)熱控制藥物。使經歷輸注反應(諸如發(fā)熱、肌肉痛以及發(fā)冷)的患者在未來輸注之前30分鐘服用阿斯匹林、醋氨酚或(包括，但不限于)苯海拉明(diphenhydramine)。對于對退熱劑和抗組胺劑無迅速反應的更嚴重的發(fā)冷和肌肉痛，使用度冷丁(Meperidine)。根據反應的嚴重性來減緩或停止細胞輸注。
可直接將如本發(fā)明中所述的經修飾或未經修飾的非天然氨基酸多肽投與到哺乳動物個體。通過通常用于將多肽引入個體中的任何途徑進行投藥。如本發(fā)明中所述的經修飾或未經修飾的非天然氨基酸多肽包括適于經口、經直腸、局部、吸入(包括(但不限于)通過氣霧劑)、口腔(包括(但不限于)舌下)、經陰道、不經腸(包括(但不限于)皮下、肌肉內、皮內、關節(jié)內、胸膜內、腹膜內、大腦內、動脈內或靜脈內)、局部(即，皮膚與粘膜表面(包括氣管表面))以及經皮投與的多肽，盡管在任何給定情況下最合適的途徑應視所治療病狀的性質和嚴重性而定。投藥可為局部或全身性的。調配物可以單位劑量或多劑量密封容器(諸如安瓿和小瓶)呈遞。如本發(fā)明中所述的經修飾或未經修飾的非天然氨基酸多肽可與醫(yī)藥學上可接受的載劑一起制成呈單位劑量可注射形式(包括(但不限于)溶液、懸浮液或乳液)的混合物。也可通過連續(xù)輸注(使用(包括，但不限于)諸如滲透泵等微型真空泵)、單一大丸劑或緩慢釋放儲槽式調配物來投與如本發(fā)明中所述的經修飾或未經修飾的非天然氨基酸多肽。
適于投與的調配物包括水性和非水性溶液、等張無菌溶液，其可含有抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑以及使調配物等張的溶質；以及水性和非水性無菌懸浮液，其可包括懸浮劑、增溶劑、增稠劑、穩(wěn)定劑和防腐劑?？捎蔁o菌粉末、顆粒以及先前描述種類的片劑來制備溶液和懸浮液。
冷凍干燥(Freeze-drying)是通常使用的用于呈遞蛋白質的技術，其用于從所關注的蛋白質制劑中去除水。冷凍干燥或凍干(lyophilization)是首先將所欲干燥的物質冷凍并且隨后通過在真空環(huán)境中升華來去除冰或冷凍溶劑的過程。在預先凍干的調配物中可包括賦形劑以增強冷凍干燥過程中的穩(wěn)定性和/或改良凍干產物在儲存時的穩(wěn)定性。Pikal，M.Biopharm.3(9)26-30(1990)和Arakawa等人，Pharm.Res.8(3)285-291(1991)。
藥物的噴霧干燥已為文獻所記載。舉例來說，參見Broadhead，J.等人，″TheSpray Drying of Pharmaceuticals，″Drug Dev.Ind.Pharm，18(11和12)，1169-1206(1992)。除小分子藥物之外，多種生物材料也已經噴霧干燥并且這些材料包括酶、血清、血漿、微生物和酵母。噴霧干燥是一種有用的技術，因為其可以一步法將液體醫(yī)藥制劑轉化為精細、無塵或凝聚的粉末?；炯夹g包含以下四個步驟a)將原料溶液霧化成噴霧；b)噴霧-空氣接觸；c)使噴霧干燥；以及d)將經干燥的產物與干燥空氣分離。美國專利第6,235,710號和第6,001,800號(其都是以引用的方式并入本發(fā)明中以揭示前述揭示內容)描述通過噴霧干燥來制備重組紅細胞生成素。
本發(fā)明中描述的醫(yī)藥組合物可包含醫(yī)藥學上可接受的載劑、賦形劑或穩(wěn)定劑。醫(yī)藥學上可接受的載劑在某種程度上由所投與的特定組合物以及用于投與所述組合物的特定方法確定。因此，存在多種本發(fā)明中描述的經修飾或未經修飾的非天然氨基酸多肽的醫(yī)藥組合物(包括可選的醫(yī)藥學上可接受的載劑、賦形劑或穩(wěn)定劑)的合適調配物(例如參見RemingtonThe Science and Practice of Pharmacy，第19版(Easton，Pa.Mack Publishing Company，1995)；Hoover，John E.，Remington′sPharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.，Easton，Pennsylvania 1975；Liberman，H.A.和Lachman，L.編，Pharmaceutical Dosage Forms，Marcel Decker，New York，N.Y.，1980；以及Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems，第7版(Lippincott Williams & Wilkins，1999))。合適的載劑包括緩沖劑，其含有丁二酸鹽、磷酸鹽、硼酸鹽、HEPES、檸檬酸鹽、咪唑、乙酸鹽、碳酸氫鹽和其它有機酸；抗氧化劑，包括(但不限于)抗壞血酸；低分子量多肽，包括(但不限于)小于約10個殘基的那些多肽；蛋白質，包括(但不限于)血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，包括(但不限于)聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，包括(但不限于)甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸、組氨酸或組氨酸衍生物、蛋氨酸、谷氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其它碳水化合物，包括(但不限于)海藻糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，包括(但不限于)EDTA和乙二胺四乙酸二鈉；二價金屬離子，包括(但不限于)鋅、鈷或銅；糖醇，包括(但不限于)甘露糖醇或山梨糖醇；成鹽抗衡離子，包括(但不限于)鈉；和/或非離子表面活性劑，包括(但不限于)TweenTM(包括(但不限于)Tween 80(聚山梨醇酯80)和Tween 20(聚山梨醇酯20))、PluronicsTM和其它普洛尼克酸(pluronic acid)(包括(但不限于)普洛尼克酸F68(帕洛沙姆188(poloxamer 188)))或PEG。合適的表面活性劑包括(例如，但不限于)基于聚氧化乙烯-聚氧化丙烯-聚氧化乙烯(即，(PEO-PPO-PEO))，或聚氧化丙烯-聚氧化乙烯-聚氧化丙烯(即，(PPO-PEO-PPO))，或其組合的聚醚。PEO-PPO-PEO和PPO-PEO-PPO是以商標名PluronicsTM、R-PluronicsTM、TetronicsTM和R-TetronicsTM(BASF WyandotteCorp.，Wyandotte，Mich.)市售，并且進一步描述于美國專利第4,820,352號(其是以全文引用的方式并入本發(fā)明中)中。其它乙烯/聚丙烯嵌段聚合物也可為合適的表面活性劑。表面活性劑或表面活性劑的組合可用于使PEG化非天然氨基酸多肽穩(wěn)定對抗一種或一種以上應力(包括(但不限于)來自攪拌的應力)。一些上述表面活性劑可稱作“膨脹劑”。一些也可稱作“張力調節(jié)劑”。也可將抗菌防腐劑應用于產品穩(wěn)定性和抗菌效力；合適的防腐劑包括(但不限于)芐醇、苯扎氯銨(benzalkonium chloride)、間甲酚、對羥基苯甲酸甲酯/對羥基苯甲酸丙酯、甲酚和苯酚或其組合。
也可通過持續(xù)釋放系統或作為持續(xù)釋放系統的一部分來投與如本發(fā)明中所述的經修飾或未經修飾的非天然氨基酸多肽(包括鍵聯到諸如PEG等水溶性聚合物上的非天然氨基酸多肽)。持續(xù)釋放組合物包括(包括，但不限于)呈成形物品(包括(但不限于)薄膜或微膠囊)形式的半滲透性聚合物基質。持續(xù)釋放基質包括生物相容性材料，諸如聚(2-羥乙基甲基丙烯酸酯)(Langer等人，J.Biomed.Mater.Res.，15167-277(1981)；Langer，Chem.Tech.，1298-105(1982))、乙烯乙酸乙烯酯(Langer等人，同上)或聚-D-(-)-3-羥基丁酸(EP 133,988)、聚交酯(聚乳酸)(美國專利第3,773,919號；EP 58,481)、聚乙交酯(乙醇酸的聚合物)、聚交酯-共-乙交酯(乳酸與乙醇酸的共聚物)、聚酐、L-谷氨酸與γ-乙基-L-谷氨酸酯的共聚物(U.Sidman等人，Biopolymers，22，547-556(1983))、聚(原酸)酯、多肽、透明質酸、膠原蛋白、硫酸軟骨素、羧酸、脂肪酸、磷脂、多糖、核酸、聚氨基酸、氨基酸(諸如苯丙氨酸、酪氨酸、異亮氨酸)、多核苷酸、聚乙烯基丙烯、聚乙烯吡咯烷酮以及聚硅氧。持續(xù)釋放組合物也包括脂質體包封的化合物。含有化合物的脂質體是通過諸如以下方法制備DE 3,218,121；Epstein等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，823688-3692(1985)；Hwang等人，Proc.Natl Acad.Sci.U.S.A.，774030-4034(1980)；EP 52,322；EP 36,676；EP 143,949；EP 142,641；日本專利申請案83-118008；美國專利第4,485,045號、第4,619,794號和第4,544,545號；以及EP 102,324。
可通過以下文獻中描述的方法來制備脂質體包封的多肽例如，DE 3,218,121；Epstein等人，Proc.Natl Acad.Sci.U.S.A.，823688-3692(1985)；Hwang等人，Proc.Natl Acad.Sci.U.S.A.，774030-4034(1980)；EP 52,322；EP 36,676；EP 88,046；EP 143,949；日本專利申請案83-118008；美國專利第4,485,045號、第5,021,234號和第4,544,545號；以及EP 102,324。脂質體的組成和大小是文獻所記載的方法。。脂質體的一些實施例描述于(例如)Park JW等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA921327-1331(1995)；Lasic D和Papahadjopoulos D(編)MEDICAL APPLICATIONSOF LIPOSOMES(1998)；Drummond DC等人，Liposomal drug delivery systems forcancer therapy，Teicher B(編)CANCER DRUG DISCOVERY ANDDEVELOPMENT(2002)；Park JW等人，Clin.Cancer Res.81172-1181(2002)；Nielsen UB等人，Biochim.Biophys.Acta 1591(1或2)109-118(2002)；Mamot C等人，Cancer Res.633154-3161(2003)中。
在本發(fā)明中描述的組合物、調配物和方法的情形下投與到患者的劑量應足以隨時間在個體中產生有益的反應。一般來說，每一劑量不經腸投與的如本發(fā)明中所述的經修飾或未經修飾的非天然氨基酸多肽的總醫(yī)藥有效量在每天每公斤患者體重約0.01μg到約100μg，或約0.05mg到約1mg的范圍內，但其應經受治療判斷。給藥頻率也應經受治療判斷，并且可比經批準用于人類的市售產品的頻率更高或頻率更低。通常，可通過上述任一種投藥途徑來投與聚合物多肽接合物(包括(僅舉例來說)如本發(fā)明中所述的PEG化多肽)。
XII.經修飾多肽的結構-功能關系 如本發(fā)明中所述的經修飾或未經修飾的非天然氨基酸多肽(包括(但不限于)合成酶、包含一個或一個以上非天然氨基酸的蛋白質等)將對其所歸屬的多肽賦予不同的物理和化學特征。所述特征的有用性將視非天然氨基酸的結構、非天然氨基酸上修飾的結構或兩者而定，并且可通過分析測試多肽的結構-功能關系的實驗模型進行評估。
在任何給定的實驗模型中，非天然氨基酸將取代所需多肽或蛋白質中的天然氨基酸。在含有非天然氨基酸的肽或蛋白質表達后，用替代R基團庫衍生蛋白質。使這些R基團與多肽或蛋白質中所包含的非天然氨基酸反應。通過其與所置換氨基酸的R基團的結構或化學相似性來選擇R基團庫。在將新穎R基團添加到蛋白質內的非天然氨基酸上之后，接著關于適當測試系統內的功能或活性來篩檢蛋白質。舉例來說，用非天然氨基酸置換蛋白質內的苯丙氨酸。然后，將與苯丙氨酸的R基團具有類似特征的替代R基團庫添加到非天然氨基酸上。將單一替代R基團添加到非天然R基團上，所添加的R基團包括環(huán)、雜環(huán)、共軛環(huán)或賦予(但不限于)類似化學和結構特征的其它化學部分。隨后，通過在適當實驗模型中進行測試而關于一種或一種以上與新取代的非天然氨基酸的添加有關的功能來篩檢衍生蛋白質。實驗模型的實施例包括(但不限于)基礎檢定、無細胞檢定、基于細胞的檢定、組織培養(yǎng)物模型和動物模型。
在另一個實施例中，使吲哚在非天然氨基酸上進行取代以獲得藥物發(fā)現中的藥效團活性或作為檢測中有用的熒光核。為促進所述添加，通過在水性緩沖液中在室溫下用優(yōu)化的兩步反應進行吲哚形成而將基于吲哚的R基團或適于吲哚合成的R基團添加到非天然氨基酸上。在此反應后，關于所需活性來篩檢衍生蛋白。
舉例來說，可在患有龐倍氏病(Pompe disease)的小鼠模型中評估酸性α-葡糖苷酶(GAA)中非天然氨基酸取代對緩解龐倍氏病的影響?？僧a生在酶內的所選位點處含有多個氨基酸取代的GAA分子庫，并且通過本發(fā)明中所揭示的方法和組合物進行表達。接著，可評估含有非天然氨基酸的酶在患有龐倍氏病的小鼠模型(經飼養(yǎng)到關于GAA(GAA-/-)遺傳失效的小鼠)中的活性，所述酶呈未經修飾形式或如本發(fā)明中所揭示的翻譯后修飾形式。可通過靜脈內、經口或允許有效的蛋白質轉運和吸收的任何其它投藥途徑來投與含有非天然氨基酸的酶。舉例來說，可通過小鼠中糖原降解和/或清除的測量結果、血清GAA水平的分析、心臟擴大癥、心肌病、骨骼肌病變的改變或降低來評估投藥功效、酶半衰期和龐倍氏病的緩解。
本發(fā)明中描述的經修飾或未經修飾的非天然氨基酸多肽適用于多種工業(yè)應用。使用本發(fā)明中描述的經修飾或未經修飾的非天然氨基酸多肽產品在工業(yè)應用中產生市售多肽制劑所展現的任何活性。
舉例來說，可用非天然氨基酸修飾用于制備乙醇的酶，并且檢定所述酶的功能變化?？僧a生含有多個非天然氨基酸取代的醇脫氫酶II和丙酮酸脫羧酶的庫，并通過本發(fā)明中所揭示的方法和組合物進行表達。接著，可關于由非天然氨基酸取代所賦予或由非天然氨基酸取代所產生的乙醇產生效率的變化來篩檢經非天然氨基酸修飾的酶。可通過文獻所記載的方法來篩檢(但不限于)對底物的親和性以及轉化率的增加，并且將所述增加應用到乙醇的工業(yè)制造中。
本發(fā)明中所揭示的方法和組合物的工業(yè)應用的其它實施例包括除草劑和殺蟲劑的環(huán)境清除。通過使阿特拉津(atrazine)代謝的酶來促進從受污染的土壤中去除常用的除草劑阿特拉津，從而使土壤無毒?？僧a生含有非天然氨基酸取代的經修飾的阿特拉津氯水解酶的庫，并通過本發(fā)明中所揭示的方法和組合物進行表達。接著，可關于環(huán)境中所見的使阿特拉津脫氯的能力的變化以及由非天然氨基酸取代所賦予或由非天然氨基酸取代所產生的阿特拉津的任何新穎代謝模式來篩檢經非天然氨基酸修飾的阿特拉津氯水解酶的庫。如先前所述，可通過文獻所記載的方法來分析酶效率的變化，包括(但不限于)阿特拉津或中間物的代謝的增加。
實施例 實施例1

的合成 所用合成是描述于以下反應流程中
a)

的合成 在0℃下，向1-對甲苯基肼(5.0g，31mmol)在吡啶(50mL)中的溶液中加入Ac2O(30mL，318mmol)。將混合物在室溫下攪拌整夜，并用MeOH(100mL)中止反應。在真空中去除溶劑后，通過快速色譜(二氧化硅，20％-50％EtOAc/己烷)純化殘余物，得到無色油狀物(6.72g，87％)1H NMR(500MHz，CDCl3)δ7.28(d，J＝8.4Hz，2H)，7.24(d，J＝8.4Hz，2H)，2.47(s，6H)，2.40(s，3H)，2.14(s，3H)；13C NMR(125MHz，CDCl3)δ171.8，169.5，139.1，138.8，130.4，126.4，25.4，22.3，21.3。
b)

的合成 向N′，N′-二乙?；?N-對甲苯基乙酰肼(6.4g，25.8mmol)在CCl4(300mL)中的溶液中加入N-溴代丁二酰亞胺(5.1g，28.7mmol)。將混合物在回流下加熱。加入2，2′-偶氮二異丁腈(AIBN，0.2g，1.2mmol)。將所得混合物在回流下攪拌36小時并冷卻到室溫。將混合物用H2O和鹽水洗滌，經無水Na2SO4干燥，過濾并濃縮，得到呈棕色油狀的溴化物(8.62g)。粗產物無需純化而直接用于下一步驟。
c)

的合成 向EtONa(2.3g，32.1mmol)在EtOH(80mL)中的溶液中加入2-乙酰胺基丙二酸二乙酯(6.3g，29.0mmol)。將所得混合物在0℃下攪拌20分鐘。以整份加入N′，N′-二乙?；?N-(4-(溴甲基)苯基)乙酰肼(8.62g，26.4mmol)。將混合物在80℃下加熱整夜并冷卻到室溫。將檸檬酸(10g，50mmol)加入反應混合物中。在去除大部分溶劑后，用EtOAc(500mL)稀釋殘余物。將混合物用H2O和鹽水洗滌，經無水Na2SO4干燥，過濾并濃縮。通過快速色譜(二氧化硅，15％-80％EtOAc/己烷)純化殘余物，得到呈黃色油狀的2-(4-(乙酰胺基)芐基)-2-乙酰胺基丙二酸二乙酯(4.17g，對于兩個步驟為35％)1H NMR(500MHz，CDCl3)δ7.23(d，J＝8.0Hz.2H)，7.03(d，J＝8.0Hz，2H)，6.57(s，1H)，4.29-4.20(m，4H)，3.65(m，2H)，2.41(s，6H)，2.08(s，3H)，2.01(s，3H)，1.27(t，J＝3.6Hz，6H)；13C NMR(125MHz，CDCl，)δ171.7，169.3，169.2，167.4，140.3，136.4，131.3，126.2，67.2，63.0，37.4，25.3，23.2，22.3，14.2。
d)

的合成 向2-(4-(乙酰胺基)芐基)-2-乙酰胺基丙二酸二乙酯(572mg，1.24mmol)在二噁烷(15mL)中的溶液中加入HCl(12N，15mL)。將所得混合物在回流下加熱整夜，并在真空中濃縮。向殘余物中加入MeOH(1mL)。加入乙醚(200mL)以沉淀出呈固體狀的產物(231mg，81％)1H NMR(500MHz，D2O)δ7.28(d，J＝8.5Hz，2H)，7.00(d，J＝8.5Hz，2H)，4.21(dd，J＝7.4，5.7Hz，1H)，3.26(dd，J＝9.2，5.7Hz，1H)，3.15(dd，J＝14.7，7.4Hz，1H)；13C NMR(125MHz，D2O)δ171.5，142.9，130.3，129.0，115.7，54.1，34.7。
實施例2 此含羰基的氨基酸的合成遵循標準方法。

實施例3 此含羰基的氨基酸的合成遵循標準方法。

實施例4芳基肼與醛之間的反應 圖3、圖4、圖5、圖6和圖7中呈示兩個分子之間形成吲哚的典型反應。兩種起始物質中的任一種都可以側鏈形式呈現于非天然氨基酸多肽上，條件是另一種試劑表示用于衍生前述側鏈的化合物上的官能團。也就是說，非天然氨基酸多肽上的側鏈可為芳基肼基，并且反應性部分為與水溶性聚合物、至少一個氨基酸或可檢測標記連接的醛。相反地，非天然氨基酸多肽上的側鏈可為醛基，并且反應性部分為與水溶性聚合物、至少一個氨基酸或可檢測標記連接的芳基肼。

實施例5芳基肼與酮之間的反應 圖8、圖9、圖10、圖11、圖13和圖14中呈示兩個分子之間形成吲哚的典型反應。兩種起始物質中的任一種都可以側鏈形式呈現于非天然氨基酸多肽上，條件是另一種試劑表示用于衍生前述側鏈的化合物上的官能團。也就是說，非天然氨基酸多肽上的側鏈可為芳基肼基，并且反應性部分為與水溶性聚合物、至少一個氨基酸或可檢測標記連接的酮。相反地，非天然氨基酸多肽上的側鏈可為酮基，并且反應性部分為與水溶性聚合物、至少一個氨基酸或可檢測標記連接的芳基肼。
實施例6含有芳基肼非天然氨基酸的尾加壓素類似物 圖20中呈示在“X”位置處包括具有芳基肼側鏈的非天然氨基酸的尾加壓素類似物。使用標準技術來化學合成所述化合物。應了解，側鏈或者可包括酮、醛或經保護羰基側鏈(示意性展示于圖21中)。
實施例7用于衍生非天然氨基酸的吲哚形成 圖20、圖21、圖22、圖24、圖28和圖29中呈示如何由可用于衍生非天然氨基酸多肽的芳基肼與羰基的反應形成吲哚部分的實施例。這些圖中所示的蛋白質“草圖”可為尾加壓素、人類生長激素、胰島素、抗體、激酶、紅細胞生成素或本發(fā)明中描述或文獻中可用的任何其它多肽或蛋白質。
實施例8 這個實施例詳述經修飾多肽在大腸桿菌中的克隆和表達。使用包含正交tRNA(O-tRNA)和正交氨酰基tRNA合成酶(O-RS)的所引入的翻譯系統來表達含有非天然氨基酸的多肽。O-RS優(yōu)先用非天然氨基酸使O-tRNA氨酰基化。接下來，翻譯系統回應編碼的選擇密碼子而將非天然氨基酸插入多肽中。氨基酸和適用于并入非天然氨基酸的O-tRNA和O-RS的多核苷酸序列描述于標題為“In vivoIncorporation of Unnatural Amino Acids”的美國專利申請案第10/126,927號以及標題為“Methods and Compositions for the Production of Orthogonal tRNA-AminoacyltRNA Synthetase Pairs”的美國專利申請案第10/126,931中，所述專利申請案是以引用的方式并入本發(fā)明中。
用含有經修飾基因和正交氨?；鵷RNA合成酶/tRNA對(對所需非天然氨基酸具有特異性)的質粒轉化大腸桿菌允許將非天然氨基酸位點特異性并入多肽中。在37℃下在含有介于0.01mM-100mM之間的特定非天然氨基酸的培養(yǎng)基中生長的經轉化的大腸桿菌以高保真性和效率表達經修飾的多肽。經His標記的含有非天然氨基酸的多肽是由大腸桿菌宿主細胞以包涵體或聚集體形式產生。這些聚集體在變性條件下在6M鹽酸胍中溶解并經親和性純化。通過在50mM TRIS-HCl(pH 8.0)、40μM CuSO4和2％(w/v)N-十二烷基肌氨酸鈉(Sarkosyl)中在4℃下透析整夜來進行再折疊。隨后，用20mM TRIS-HCl(pH 8.0)、100mM NaCl、2mM CaCl2對所述物質進行透析，接著去除His標簽。參見Boissel等人，J.Biol.Chem.，(1993)26815983-93。通過SDS-PAGE、Western Blot分析或電噴霧電離離子阱質譜等證實純化多肽的方法。
以下實施例描述測量并比較經修飾的治療活性非天然氨基酸多肽的活體外和活體內活性與治療活性天然氨基酸多肽的活體外和活體內活性的方法。
實施例9細胞結合檢定 在0℃下，在不存在或存在各種濃度(體積10μl)的未經標記GH、hGH或GM-CSF的情況下和在存在125I-GH(約100,000cpm或1ng)的情況下將細胞(3×106)在PBS/1％BSA(100μl)中雙重復培育90分鐘(總體積120μl)。隨后，使細胞再懸浮并在350μl塑膠離心管中的200μl冰冷FCS上分層并且離心(1000g；1分鐘)。通過切斷管的底部來收集離心塊，并以γ計數器(Packard)對離心塊和上清液分別計數。
以在不存在競爭者的情況下的總結合(雙重復的平均值)減去在存在100倍過量的未經標記的GH的情況下的結合(cpm)(非特異性結合)的形式來測定特異性結合(cpm)。對所使用的每一種細胞類型測量非特異性結合。實驗是使用相同125I-GH制劑在隔開的天數進行并且應顯示內部一致性。125I-GH證實與產生GH受體的細胞的結合。未經標記的天然GH或hGH以劑量依賴性方式抑制結合，但GM-CSF或其它陰性對照無法抑制結合。hGH競爭結合天然125I-GH(類似于天然GH)的能力暗示所述受體同樣良好地識別兩種形式。
實施例10通過吲哚鍵聯PEG化的hGH的活體內研究 將PEG-hGH、未經修飾的hGH和緩沖溶液投與到小鼠或大鼠。結果展示與未經修飾的hGH相比，本發(fā)明中所述的PEG化hGH具有優(yōu)良的活性和延長的半衰期，其是由體重顯著增加所指示。
實施例11接合hGH和未接合hGH以及其變異體的活體內半衰期的測量 所有動物實驗都是在AAALAC質量合格設施中并按照由圣路易斯大學(St.Louis University)的實驗動物管理和使用委員會(Institutional Animal Care and UseCommittee)所認可的方案進行。在室內在12小時燈光/黑暗的循環(huán)下將大鼠個別圈養(yǎng)在籠中。使動物能夠隨意取用合格的Purina嚙齒動物食物5001和水。對于切除垂體的大鼠，飲用水額外含有5％葡萄糖。
實施例12藥物動力學研究 在進入動物實驗之前，通過三次檢定來評估每一種PEG化突變體hGH的品質。通過用非還原性條件下的MES SDS電泳緩沖液(Invitrogen，Carlsbad，CA)電泳4％-12％丙烯酰胺NuPAGE Bis-Tris凝膠來研究PEG-hGH(通過吲哚鍵聯進行PEG化)的純度。用考馬斯藍(Coomassie blue)將凝膠染色。根據密度測定掃描，PEG-hGH條帶的純度大于95％。通過使用來自Charles River Laboratories(Wilmington，MA)的KTA2試劑盒的動力學LAL檢定來測試每一種PEG-hGH中的內毒素含量，并且每一劑量的內毒素含量小于5EU。用IM-9pSTAT5生物檢定來分析PEG-hGH的生物活性，并且證實EC50值小于15nM。
在獲自Charles River Laboratories的雄性Sprague-Dawley大鼠(261g-425g)中彼此比較經PEG修飾的生長激素化合物的藥物動力學性質，并將其與非PEG化生長激素進行比較。通過手術將導管安裝于頸動脈中以用于血液采集。在導管成功安裝之后，將動物分配成治療組(每組三到六只)，接著給藥。以0.41-0.55ml/kg的給藥體積經皮下向動物投與1mg/kg的化合物。在各個時間點通過留置導管采集血樣，并且使其進入經EDTA涂布的微離心管中。在離心后收集血漿，并將其儲存在-80℃下直到分析。使用來自BioSource International(Camarillo，CA)或Diagnostic Systems Laboratories(Webster，TX)的抗體夾層生長激素ELISA試劑盒來測量化合物濃度。使用對應于所給與的類似物的標準來計算濃度。使用建模程序WinNonlin(Pharsight，4.1版)來估算藥物動力學參數。使用具有線性-上/對數-下梯形積分的非間室分析(Noncompartmental analysis)，并且均一加權濃度數據。
在大鼠中單次皮下給藥之后，以規(guī)則時間間隔獲得血漿濃度。對大鼠(每組n＝3-6)給予每千克蛋白質1mg的單一大丸藥劑量。將hGH野生型蛋白(WHOhGH)、經His標記的hGH多肽(his-hGH)或包含在六個不同位置中的每一位置處與30kDa PEG共價鍵聯的非天然氨基酸吲哚的經His標記的hGH多肽與WHOhGH和(his)-hGH進行比較。在規(guī)定時間間隔內獲取血漿樣本，并且按照所述內容來檢定所注射的化合物。通過非間室分析(Pharsight，4.1版)來評估濃度對時間的曲線。展示的值為平均值(+/-標準偏差)。Cmax最大濃度；末期t1/2末期半衰期；AUC0-＞inf外推到無窮大的濃度-時間曲線下的面積；MRT平均滯留時間；Cl/f表觀總血漿清除率；Vz/f在末期階段期間的表觀分布體積。
實施例13藥效學研究 切除垂體的雄性Sprague-Dawley大鼠是獲自Charles River Laboratories。在3-4周齡時通過手術去除垂體。將動物馴化3周時期，在此期間監(jiān)測體重。包括在研究開始之前7天的時期體重增加0g-8g的動物，并將其隨機分成治療組。對大鼠投與大丸藥劑量或每天經皮下給藥。在整個研究中，每天并且依次對大鼠稱重、麻醉、放血并給藥(適當時)。使用肝素化毛細管從眶竇采集血液，并將其置于經EDTA涂布的微離心管中。通過離心分離血漿，并將其儲存在-80℃下直到分析。繪制平均(+/-S.D.)血漿濃度對時間間隔的曲線。
肽IGF-1是生長調節(jié)素或類胰島素生長因子家族的成員。IGF-1介導生長激素的許多促進生長的作用。使用針對所提供的大鼠/小鼠IGF-1標準的競爭性結合酶免疫檢定試劑盒(Diagnosic Systems Laboratories)來測量IGF-1濃度。切除大鼠的垂體。經皮下對大鼠(每組n＝5-7)給予單次劑量或日劑量。每天依次對動物稱重、麻醉、放血并給藥(適當時)。獲得安慰劑治療、野生型hGH(hGH)、經His標記的hGH((his)hGH)和包含在位置35和92處與30kDa PEG共價鍵聯的吲哚的hGH多肽的體重結果。
實施例14包含非天然編碼氨基酸的PEG化hGH(通過吲哚鍵聯進行PEG化)的安全性和/或功效的人類臨床試驗 使用以下臨床試驗的實施例來治療兒童和成人的生長激素不足、特納綜合癥(Turner syndrome)、慢性腎衰竭、普達-威利綜合癥(Prader-Willi syndrome)、宮內生長遲緩的兒童、特發(fā)性身材矮小、與長期高劑量糖皮質激素使用相關的生長障礙、移植后生長障礙、性聯低血磷性佝僂病(X-linked hypophosphatemic rickets)、發(fā)炎性腸病、努南綜合癥(Noonan syndrome)、骨發(fā)育不良、與腹腔疾病相關的生長障礙、與(例如)晚期獲得性免疫缺陷綜合癥相關的肌肉萎縮，促進燒傷傷口愈合，治療肥胖個體的劇烈飲食的副作用、肌肉纖維疼痛(fybromyalgia)、慢性疲勞綜合癥、與衰老相關的衰弱，以及用于人類生長激素的其它用途。
目的為比較經皮下投與的PEG化的包含非天然編碼氨基酸的重組人類hGH與一種或一種以上的市售hGH產品(包括(但不限于)HumatropeTM(Eli Lilly &Co.)、NutropinTM(Genentech)、NorditropinTM(Novo-Nordisk)、GenotropinTM(Pfizer)和Saizen/SerostimTM(Serono))的安全性和藥物動力學。
患者研究中招收18名年齡在8歲-40歲范圍內并且體重介于20kg-90kg之間的健康志愿者(例如，兒童用于兒科適應癥以及成人用于成人適應癥)。個體不應具有血液學或血清化學以及陰性尿液毒性篩檢、HIV篩檢和乙型肝炎(hepatitisB)表面抗原的臨床顯著異常實驗值。其不應具有任何以下跡象高血壓；任何原發(fā)性血液疾病史；重大肝病、腎病、心血管疾病、胃腸疾病、泌尿生殖系統疾病、代謝疾病、神經病史；貧血或癲癇病史；對細菌或哺乳動物來源的產品、PEG或人類血清白蛋白具有已知敏感性；含咖啡因的飲料的習慣性以及重度消費者；在進入研究的30天內參與任何其它臨床試驗或經輸血或獻血；在進入研究的3個月內已暴露于hGH；在進入研究的7天內患??；以及在進入研究的14天內對研究前身體檢查或臨床實驗室評估具有顯著異常。對所有個體評估安全性，并且定時采集用于藥物動力學分析的所有血液采集物。在機構倫理委員會批準以及患者同意的情況下進行所有研究。
研究設計其應為在健康男性志愿者中的第I階段、單中心、開放標記、隨機化、兩周期交叉研究。將18名個體隨機指派到兩個治療序列組中的一組中(每組9名個體)。使用相等劑量的包含非天然編碼氨基酸的PEG化hGH和所選市售產品，在大腿上部以快速皮下注射形式經兩個單獨給藥時期投與GH。投與市售產品的劑量和頻率是按照包裝標簽中的說明來進行?？赏ㄟ^包括其它個體組而在研究中加入使用市售產品的其它劑量、給藥頻率或所需的其它參數。每一給藥時期由14天的平衡期隔開。對于兩個給藥時期中的每一時期，在給藥之前至少12小時和給藥后72小時將個體限定在研究中心，但在給藥時期之間無需如此。如果存在其它劑量、頻率或其它參數，那么也可添加額外個體組來測試PEG化hGH。經批準用于人類用途的多種GH調配物可用于此研究中。HumatropeTM(Eli Lilly &Co.)、NutropinTM(Genentech)、NorditropinTM(Novo-Nordisk)、GenotropinTM(Pfizer)和Saizen/SerostimTM(Serono)為經批準用于人類用途的市售GH產品。hGH的實驗調配物為包含非天然編碼氨基酸的PEG化hGH。
血液取樣在投與hGH之前和之后，通過直接靜脈穿刺連續(xù)取血。在給藥前約30分鐘、20分鐘和10分鐘(3個基線樣本)且在給藥后大致以下時間30分鐘和1小時、2小時、5小時、8小時、12小時、15小時、18小時、24小時、30小時、36小時、48小時、60小時以及72小時，獲得用于測定血清GH濃度的靜脈血樣(5mL)。將每一血清樣本分為兩個等分試樣。將所有血清樣本儲存在-20℃下。以干冰運輸血清樣本。在第1天初始給藥之前即刻、第4天早晨、第16天給藥之前即刻以及第19天早晨進行禁食臨床實驗測試(血液學、血清化學，以及驗尿)。
生物分析方法使用ELISA試劑盒程序(Diagnostic Systems Laboratory[DSL]，Webster TX)來測定血清GH濃度。
安全性測定在每一次給藥(第1天和第16天)之前以及每一次給藥后6小時、24小時、48小時和72小時立即記錄生命體征。安全性測定是基于不利事件的發(fā)生率和類型以及臨床實驗測試自基線的變化。另外，評估生命體征測量結果(包括血壓)和身體檢查結果與研究前的變化。
數據分析通過由給藥后的每一個值減去通過將給藥前30分鐘、20分鐘和10分鐘時采集的三個樣本的GH水平平均化而測定的平均基線GH濃度而關于給藥前基線GH濃度來修正給藥后血清濃度值。如果給藥前血清GH濃度低于檢定的定量水平，那么其不包括在平均值的計算中。由關于基線GH濃度所修正的血清濃度數據測定藥物動力學參數。使用BIOAVL軟件的最新版本，通過利用DigitalEquipment Corporation VAX 8600計算機系統的不依賴于模型的方法來計算藥物動力學參數。測定以下藥物動力學參數峰值血清濃度(Cmax)；到達峰值血清濃度的時間(tmax)；通過使用線性梯形規(guī)則計算的從時間零點到最后血液取樣時間(AUG0-72)的濃度-時間曲線下的面積(AUC)；以及由消除速率常數計算的末端消除半衰期(t1/2)。在對數-線性濃度-時間曲線的末端線性區(qū)域內，通過連續(xù)數據點的線性回歸來估算消除速率常數。對于每一治療，計算藥物動力學參數的平均標準偏差(SD)和變異系數(CV)。計算參數平均值的比率(保持調配物/非保持調配物)。
安全性結果在各治療組中，不利事件的發(fā)生率分布相同。與基線或研究前臨床實驗測試或血壓相比無臨床上顯著變化，并且身體檢查結果和生命體征測量結果與研究前相比也無顯著變化。兩個治療組的安全性概況看來應相似。
藥物動力學結果在所測量的每一時間點下，將所有18名個體在接受單次劑量的一種或一種以上的市售hGH產品(包括(但不限于)HumatropeTM(Eli Lilly& Co.)、NutropinTM(Genentech)、NorditropinTM(Novo-Nordisk)、GenotropinTM(Pfizer)和Saizen/SerostimTM(Serono))后的平均血清GH濃度-時間曲線(未關于基線GH水平進行修正)與包含非天然編碼氨基酸的PEG化hGH進行比較。所有個體都應具有在正常生理范圍內的給藥前基線GH濃度。由關于給藥前平均基線GH濃度所修正的血清數據測定藥物動力學參數，并且測定Cmax和tmax。所選的臨床比較物(HumatropeTM(Eli Lilly & Co.)、NutropinTM(Genentech)、NorditropinTM(Novo-Nordisk)、GenotropinTM(Pfizer)、Saizen/SerostimTM(Serono))的平均tmax比包含非天然編碼氨基酸的PEG化hGH的tmax顯著更短。與包含非天然編碼氨基酸的PEG化hGH的末端半衰期相比，所測試的市售hGH產品的末端半衰期值顯著更短。
盡管本發(fā)明的研究是在健康男性個體中進行，但預期在其它患者群體(諸如患有癌癥或慢性腎衰竭的男性或女性患者、小兒腎衰竭患者、自體預存程序中的患者，或預定選擇性手術的患者)中可具有類似的吸收特征和安全性概況。
總之，經皮下投與的單一劑量的包含非天然編碼氨基酸的PEG化hGH應為安全的，并且健康男性個體對其良好耐受。根據不利事件的相對發(fā)生率，市售形式的hGH和包含非天然編碼氨基酸的PEG化hGH的臨床實驗值、生命體征以及身體檢查結果、安全性概況應相當。包含非天然編碼氨基酸的PEG化hGH潛在地對患者和健康護理提供者提供較大臨床效用。
實施例15PEG化hGH和非PEG化hGH的水溶性比較 通過測定可溶解于100μL水中的各別多肽的量來獲得hGH野生型蛋白(WHO hGH)、經His標記的hGH多肽(his-hGH)或包含在位置92處與30kDa PEG共價鍵聯的非天然氨基酸吲哚的經His標記的hGH多肽的水溶性。PEG化hGH的量大于WHO hGH和hGH的量，這說明非天然氨基酸多肽的PEG化增加水溶性。
實施例16經修飾的治療活性非天然氨基酸多肽的活體內研究 將前列腺癌腫瘤異種移植物植入小鼠中，隨后將其分為兩組。一組每天用經修飾的治療活性非天然氨基酸多肽治療，而另一組每天用治療活性天然氨基酸多肽治療。每天測量腫瘤大小，并且如用經修飾的治療活性非天然氨基酸多肽治療的組的腫瘤大小的減小所指示，與治療活性天然氨基酸多肽相比，經修飾的治療活性非天然氨基酸多肽具有改良的治療功效。
實施例17非天然氨基酸多肽活性和親和性的測量 這個實施例詳述非天然氨基酸多肽的活性以及非天然氨基酸多肽對其受體、結合搭配物或配體的親和性的測量。
根據文獻所記載的方法表達并分離非天然氨基酸多肽受體、結合搭配物或配體的蛋白質。使用BiocoreTM系統來分析非天然氨基酸多肽與其受體的結合。類似地，結合搭配物或配體也可用于此檢定中。
如制造商所推薦，使用胺偶合程序，將大約600-800RU的可溶性受體固定在BiacoreTM CM5芯片上。以40μl/min的流動速率將各種濃度的在HBS-EP緩沖液(BiacoreTM，Pharmacia)中的野生型或經修飾或未經修飾的非天然氨基酸多肽在表面上注射4-5分鐘，并且在注射后15分鐘監(jiān)測解離。通過4.5M MgCl2的15秒脈沖使表面再生。在至少100個再生周期后僅觀測到結合親和性的極小損失(1-5％)。使用未固定有受體的參考細胞來扣除任何緩沖液體積影響和非特異性結合。
用BiaEvaluation 4.1軟件(BIACORETM)處理根據經修飾或未經修飾的非天然氨基酸多肽滴定實驗所獲得的動力學結合數據。以個體速率常數的比率(koff/kon)形式計算平衡解離常數(Kd)。
形成表達非天然氨基酸多肽的受體、結合搭配物或配體的穩(wěn)定細胞系。用含有受體、結合搭配物或配體cDNA的構筑體對細胞進行電穿孔。使轉染細胞恢復48小時，接著克隆。通過用針對受體的抗體染色的表面來鑒別表達轉染物的受體、結合搭配物或配體，并用FACS Array(BD Biosciences，San Diego，CA)進行分析。在對所需轉染物進行其它回合的重復亞克隆后形成穩(wěn)定轉染的細胞克隆。將所述細胞用于細胞結合檢定中。
在0℃下，在不存在或存在各種濃度(體積10μl)的未經標記天然氨基酸多肽或陰性對照多肽的情況下并且在存在125I-(經修飾)非天然氨基酸多肽(約100,000cpm或1ng)的情況下將細胞(3×106)在PBS/1％BSA(100μl)中雙重復培育90分鐘(總體積120μl)。隨后，使細胞再懸浮并在350μl塑膠離心管中的200μl冰冷FCS上分層并且離心(1000g；1分鐘)。通過切斷管的底部來收集離心塊，并以γ計數器(Packard)對離心塊和上清液分別計數。
以在不存在競爭者的情況下的總結合(雙重復的平均值)減去非特異性結合來測定特異性結合(cpm)。對所使用的每一種細胞類型測量非特異性結合。實驗是使用相同125I-(經修飾)非天然氨基酸多肽制劑以隔開的天數進行并且應顯示內部一致性。125I-(經修飾)非天然氨基酸多肽展現與受體、結合蛋白或產生配體的細胞結合。未經標記的天然氨基酸多肽以劑量依賴性方式抑制結合，但陰性對照多肽無法抑制結合。
應了解，本發(fā)明中所述的實施例和實施例只是說明性目的，并且根據其各種修改或改變應包括在本申請案的精神和權限以及隨附權利要求的范圍內。
序列表
權利要求
1.一種具有化合物1-4的結構的化合物
其中
A是可選的，并且當存在時為低碳亞烷基、經取代低碳亞烷基、低碳亞環(huán)烷基、經取代低碳亞環(huán)烷基、低碳亞烯基、經取代低碳亞烯基、亞炔基、經取代亞炔基、低碳亞雜烷基、經取代亞雜烷基、低碳亞雜環(huán)烷基、經取代低碳亞雜環(huán)烷基、亞芳基、經取代亞芳基、亞雜芳基、經取代亞雜芳基、亞烷芳基、經取代亞烷芳基、亞芳烷基或經取代亞芳烷基；
B是可選的，并且當存在時為一端與含吲哚的部分鍵聯的連接子，所述連接子選自由以下各基團組成的群組低碳亞烷基、經取代低碳亞烷基、低碳亞烯基、經取代低碳亞烯基、低碳亞雜烷基、經取代低碳亞雜烷基、-亞芳基、經取代亞芳基、亞雜芳基、經取代亞雜芳基、-O-、-O-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-S-、-S-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-S(O)k-(其中k為1、2或3)、-S(O)k(亞烷基或經取代亞烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、-C(O)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-N(R′)CO-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)C(NCN)N(R′)-、-N(R′)C(NNO2)N(R′)-、-N(R′)C(NCOOR′)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)2-N＝N-和-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，并且R′各自獨立地為H、烷基或經取代烷基；
R1為H、氨基保護基或至少一個氨基酸；并且
R2為OH、酯保護基或至少一個氨基酸；
n為0、1、2或3，并且m為0、1、2或3，條件是n或m中的至少一個不為0；
其中，具有相締合Ra基團的結構1、2、3和4中的各環(huán)可含有0、1或2個Ra基團，并且Ra是各自獨立地選自由H、鹵素、烷基、經取代烷基、-N(R″)2、-C(O)R″、-C(O)N(R″)2、-OR″和-S(O)kR″(其中k為1、2或3)組成的群組，其中R″各自獨立地為H、烷基或經取代烷基；或當存在一個以上Ra基團時，兩個Ra可視情況形成芳基、環(huán)烷基或雜環(huán)烷基；
R3與R4各自獨立地為H、鹵素、低碳烷基或經取代低碳烷基，或R3與R4或兩個R3基團視情況形成環(huán)烷基或雜環(huán)烷基；
R5各自獨立地為H、鹵素、烷基、經取代烷基、烯基、經取代烯基、炔基、經取代炔基、烷氧基、經取代烷氧基、烷基烷氧基、經取代烷基烷氧基、聚氧化烯、經取代聚氧化烯、芳基、經取代芳基、雜芳基、經取代雜芳基、烷芳基、經取代烷芳基、芳烷基、經取代芳烷基、-(亞烷基或經取代亞烷基)-ON(R″)2、OH、NH2、CN、NO2、-(亞烷基或經取代亞烷基)-C(O)SR″、-(亞烷基或經取代亞烷基)-S-S-(芳基或經取代芳基)、-C(O)R″、-C(O)2R″或-C(O)N(R″)2，其中R″各自獨立地為氫、烷基、經取代烷基、烯基、經取代烯基、烷氧基、經取代烷氧基、芳基、經取代芳基、雜芳基、烷芳基、經取代烷芳基、芳烷基、經取代芳烷基，或當存在一個以上R″基團時，兩個R″視情況形成雜環(huán)烷基；
或R5為L-X，其中，X是選自由以下各物組成的群組水溶性聚合物；聚氧化烯；聚乙二醇；聚乙二醇的衍生物；光交聯劑；至少一個氨基酸；至少一個糖基；至少一個核苷酸；至少一個核苷；配體；生物素；生物素類似物；可檢測標記；和其任何組合；并且L是可選的，并且當存在時為選自由以下各基團組成的群組的連接子亞烷基、經取代亞烷基、亞烯基、經取代亞烯基、-O-、-O-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-S-、-S-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-S(O)k-(其中k為1、2或3)、-S(O)k(亞烷基或經取代亞烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-N(R′)CO-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-N(R′)C(O)O-、-(亞烷基或經取代亞烷基)-O-N＝CR′-、-(亞烷基或經取代亞烷基)-C(O)NR′-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-(亞烷基或經取代亞烷基)-S(O)k-(亞烷基或經取代亞烷基)-S-、-(亞烷基或經取代亞烷基)-S-S-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、-N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-和-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自獨立地為H、烷基或經取代烷基；
當存在一個以上R5基團時，兩個鄰位R5基團可視情況形成雜環(huán)烷基或芳香族雜環(huán)烷基；
或含-B-吲哚的部分合起來形成包含至少一個吲哚部分的雙環(huán)或三環(huán)環(huán)烷基或雜環(huán)烷基；
或其活性代謝物、鹽或醫(yī)藥學上可接受的前藥或溶劑化物。
2.根據權利要求1所述的化合物，其中A為鍵、經取代或未經取代的低碳亞烷基，或未經取代或經取代的選自由亞苯基、亞吡啶基、亞嘧啶基或亞噻吩基組成的群組的亞芳基。
3.根據權利要求2所述的化合物，其中A為鍵。
4.根據權利要求1所述的化合物，其中B為鍵、低碳亞烷基、經取代低碳亞烷基、-O-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-CON(R″)-、-NR′-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-N(R″)CO-、-C(O)-、-C(O)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-CON(R″)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-S(亞烷基或經取代亞烷基)-、-S(O)(亞烷基或經取代亞烷基)-或-S(O)2(亞烷基或經取代亞烷基)-。
5.根據權利要求5所述的化合物，其中B為鍵。
6.根據權利要求1所述的化合物，其中R1為至少一個氨基酸。
7.根據權利要求1所述的化合物，其中R2為至少一個氨基酸。
8.根據權利要求7所述的化合物，其中R1為至少一個氨基酸。
9.根據權利要求1所述的化合物，其中X為至少一個氨基酸。
10.根據權利要求1所述的化合物，其中X為選自由熒光部分、磷光部分、化學發(fā)光部分、螯合部分、電子致密部分、磁性部分、插入部分、放射性部分、發(fā)色團部分和能量轉移部分組成的群組的可檢測標記。
11.根據權利要求1所述的化合物，其中X為水溶性聚合物。
12.根據權利要求11所述的化合物，其中所述水溶性聚合物包含聚氧化烯或經取代聚氧化烯。
13.根據權利要求11所述的化合物，其中所述水溶性聚合物包含-[(亞烷基或經取代亞烷基)-O-(氫、烷基或經取代烷基)]x，其中x為20-10,000。
14.根據權利要求11所述的化合物，其中所述水溶性聚合物是具有介于約2KDa到約40KDa范圍內的分子量的m-PEG。
15.一種制備結構1或2的化合物的方法，其包含使式(II)化合物與含羰基的化合物反應，其中所述式(II)化合物為
其中
A是可選的，并且當存在時為低碳亞烷基、經取代低碳亞烷基、低碳亞環(huán)烷基、經取代低碳亞環(huán)烷基、低碳亞烯基、經取代低碳亞烯基、亞炔基、經取代亞炔基、低碳亞雜烷基、經取代亞雜烷基、低碳亞雜環(huán)烷基、經取代低碳亞雜環(huán)烷基、亞芳基、經取代亞芳基、亞雜芳基、經取代亞雜芳基、亞烷芳基、經取代亞烷芳基、亞芳烷基或經取代亞芳烷基；
B是可選的，并且當存在時為一端與含吲哚的部分鍵聯的連接子，所述連接子選自由以下各基團組成的群組低碳亞烷基、經取代低碳亞烷基、低碳亞烯基、經取代低碳亞烯基、低碳亞雜烷基、經取代低碳亞雜烷基、亞芳基、經取代亞芳基、亞雜芳基、經取代亞雜芳基、-O-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-S-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-S(O)k-(其中k為1、2或3)、-S(O)k(亞烷基或經取代亞烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、-C(O)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-NR′-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、＝N-O-(亞烷基或經取代亞烷基)、-N(R′)CO-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)2-N＝N-和-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-；并且R′各自獨立地為H、烷基或經取代烷基；
R1為H、氨基保護基或至少一個氨基酸；并且
R2為OH、酯保護基或至少一個氨基酸；
Ra是各自獨立地選自由H、鹵素、烷基、經取代烷基、CN、NO2、-N(R′)2、-C(O)R′、-C(O)N(R′)2、-OR′和-S(O)kR′(其中k為1、2或3)組成的群組，并且R′各自獨立地為H、烷基或經取代烷基；
R3和R4獨立地為氫或胺保護基，包括(但不限于)
16.根據權利要求15所述的方法，其中A為鍵。
17.根據權利要求16所述的方法，其中B為鍵。
18.根據權利要求15所述的方法，其中R1為至少一個氨基酸。
19.根據權利要求15所述的方法，其中R2為至少一個氨基酸。
20.根據權利要求15所述的方法，其中所述式(II)化合物具有式(IV)的結構
其中，Ra是各自獨立地選自由H、鹵素、烷基、經取代烷基、CN、NO2、-N(R″)2、-C(O)R″、-C(O)N(R″)2、-OR″和-S(O)kR″(其中k為1、2或3)組成的群組，其中R″各自獨立地為H、烷基或經取代烷基。
21.一種制備結構3或4的化合物的方法，其包含使式(V)化合物與含肼的試劑反應；其中所述式(V)化合物為
其中
A是可選的，并且當存在時為低碳亞烷基、經取代低碳亞烷基、低碳亞環(huán)烷基、經取代低碳亞環(huán)烷基、低碳亞烯基、經取代低碳亞烯基、亞炔基、低碳亞雜烷基、經取代亞雜烷基、低碳亞雜環(huán)烷基、經取代低碳亞雜環(huán)烷基、亞芳基、經取代亞芳基、亞雜芳基、經取代亞雜芳基、亞烷芳基、經取代亞烷芳基、亞芳烷基或經取代亞芳烷基；
B是可選的，并且當存在時為選自由以下各基團組成的群組的連接子低碳亞烷基、經取代低碳亞烷基、低碳亞烯基、經取代低碳亞烯基、低碳亞雜烷基、經取代低碳亞雜烷基、低碳亞雜烯基、經取代低碳亞雜烯基、亞芳基、經取代亞芳基、亞雜芳基、經取代亞雜芳基、-O-、-O-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-S-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-S(O)k(亞烷基或經取代亞烷基)-(其中k為1、2或3)、-C(O)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-C(S)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-N(R′)-、-N(R′)CON(R′)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-NR′-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-CON(R′)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-CSN(R′)-(亞烷基或經取代亞烷基)-和-N(R′)CO-(亞烷基或經取代亞烷基)-，其中R′各自獨立地為H、烷基或經取代烷基；
J為
R為H、烷基、經取代烷基、環(huán)烷基或經取代環(huán)烷基；
R″各自獨立地為H、烷基、經取代烷基或保護基，或當存在一個以上R″基團時，兩個R″視情況形成雜環(huán)烷基；
R1為H、氨基保護基、樹脂、至少一個氨基酸、多肽或多核苷酸；并且
R2為OH、酯保護基、樹脂、至少一個氨基酸、多肽或多核苷酸；
R3與R4各自獨立地為H、鹵素、低碳烷基或經取代低碳烷基，或R3與R4或兩個R3基團視情況形成環(huán)烷基或雜環(huán)烷基；
或-A-B-J-R基團合起來形成包含至少一個羰基(包括一個羰基)、經保護羰基(包括一個經保護羰基)或經掩蔽羰基(包括一個經掩蔽羰基)的雙環(huán)或三環(huán)環(huán)烷基或雜環(huán)烷基；
或-J-R基團合起來形成包含至少一個羰基(包括一個羰基)、經保護羰基(包括一個經保護羰基)或經掩蔽羰基(包括一個經掩蔽羰基)的單環(huán)或雙環(huán)環(huán)烷基或雜環(huán)烷基。
22.根據權利要求21所述的方法，其對應于式(VI)
23.根據權利要求21所述的方法，其對應于式(VII)
其中，Ra是各自獨立地選自由H、鹵素、烷基、經取代烷基、-N(R″)2、-C(O)R″、-C(O)N(R″)2、-OR″和-S(O)kR″(其中k為1、2或3)組成的群組，其中R″各自獨立地為H、烷基或經取代烷基。
24.根據權利要求21所述的方法，其對應于式(X)
其中，Ra是各自獨立地選自由H、鹵素、烷基、經取代烷基、-N(R″)2、-C(O)R″、-C(O)N(R″)2、-OR″和-S(O)kR″(其中k為1、2或3)組成的群組，其中R″各自獨立地為H、烷基或經取代烷基；
Y和Z是獨立地選自由-OH、經氧取代的烷基、-SH或經硫取代的烷基組成的群組，并且Y和Z合起來可形成雜環(huán)烷基環(huán)。
25.根據權利要求21所述的方法，其對應于式(XI)
其中，Ra是各自獨立地選自由H、鹵素、烷基、經取代烷基、-N(R″)2、-C(O)R″、-C(O)N(R″)2、-OR″和-S(O)kR″(其中k為1、2或3)組成的群組，其中R″各自獨立地為H、烷基或經取代烷基；
Y是獨立地選自由OR″、NR″R″、NC(O)R″組成的群組，其中R″各自獨立地為H、烷基或經取代烷基。
26.根據權利要求21所述的方法，其對應于式(XII)
其中，Ra是各自獨立地選自由H、鹵素、烷基、經取代烷基、-N(R″)2、-C(O)R″、-C(O)N(R″)2、-OR″和-S(O)kR″(其中k為1、2或3)組成的群組，其中R″各自獨立地為H、烷基或經取代烷基；或當存在一個以上Ra基團時，兩個Ra可視情況形成環(huán)烷基或雜環(huán)烷基；
R3和R4獨立地為H、鹵素、CN、NO2、烷基、經取代烷基、N(R′)2、C(O)kR′、-C(O)N(R′)2、-OR′和-S(O)kR′(其中k為1、2或3)，其中R′各自獨立地為H、烷基或經取代烷基；
X為C、N或S，條件是當X為O或S時，R4不可為H、鹵素、CN、NO2、烷基、經取代烷基、N(R′)2、C(O)R′、-C(O)N(R′)2、-OR′和-S(O)kR′；其中k為1、2或3，并且n為0、1或2。
27.根據權利要求21所述的方法，其對應于式(XIII)
其中，Ra是各自獨立地選自由H、鹵素、烷基、經取代烷基組成的群組；
Y和Z是獨立地選自由-OH、經氧取代的烷基、-SH或經硫取代的烷基組成的群組，并且Y和Z合起來可形成環(huán)烷基環(huán)。
28.根據權利要求21所述的方法，其對應于式(XIV)
其中，Ra是各自獨立地選自由H、鹵素、烷基、經取代烷基、-N(R″)2、-C(O)R″、-C(O)N(R″)2、-OR″和-S(O)kR″(其中k為1、2或3)組成的群組，其中R″各自獨立地為H、烷基或經取代烷基；
其中B進一步包含-CH＝N-O-(亞烷基或經取代亞烷基)-；
n為1、2或3；并且
Y是獨立地選自由OR″、NR″R″、NC(O)R″組成的群組，其中R″各自獨立地為H、烷基、經取代烷基。
29.根據權利要求15所述的方法，其中所述化合物可與含羰基的試劑在水溶液中在適度條件下反應。
30.根據權利要求21所述的方法，所述反應是在水溶液中在適度條件下進行。
31.一種治療病癥、病狀或疾病的方法，所述方法包含投與治療有效量的具有結構式1、2、3或4的藥劑
其中
A是可選的，并且當存在時為低碳亞烷基、經取代低碳亞烷基、低碳亞環(huán)烷基、經取代低碳亞環(huán)烷基、低碳亞烯基、經取代低碳亞烯基、亞炔基、經取代亞炔基、低碳亞雜烷基、經取代亞雜烷基、低碳亞雜環(huán)烷基、經取代低碳亞雜環(huán)烷基、亞芳基、經取代亞芳基、亞雜芳基、經取代亞雜芳基、亞烷芳基、經取代亞烷芳基、亞芳烷基或經取代亞芳烷基；
B是可選的，并且當存在時為一端與含吲哚的部分鍵聯的連接子，所述連接子選自由以下各基團組成的群組低碳亞烷基、經取代低碳亞烷基、低碳亞烯基、經取代低碳亞烯基、低碳亞雜烷基、經取代低碳亞雜烷基、-亞芳基、經取代亞芳基、亞雜芳基、經取代亞雜芳基、-O-、-O-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-S-、-S-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-S(O)k-(其中k為1、2或3)、-S(O)k(亞烷基或經取代亞烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、-C(O)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-N(R′)CO-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)C(NCN)N(R′)-、-N(R′)C(NNO2)N(R′)-、-N(R′)C(NCOOR′)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)2-N＝N-和-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，并且R′各自獨立地為H、烷基或經取代烷基；
R1為H、氨基保護基或至少一個氨基酸；并且
R2為OH、酯保護基或至少一個氨基酸；
n為0、1、2或3，并且m為0、1、2或3，條件是n或m中的至少一個不為0；
其中，具有相締合Ra基團的結構1、2、3和4中的各環(huán)可含有0、1或2個Ra基團，并且Ra是各自獨立地選自由H、鹵素、烷基、經取代烷基、-N(R″)2、-C(O)R″、-C(O)N(R″)2、-OR″和-S(O)kR″(其中k為1、2或3)組成的群組，其中R″各自獨立地為H、烷基或經取代烷基；或當存在一個以上Ra基團時，兩個Ra可視情況形成芳基、環(huán)烷基或雜環(huán)烷基；
R3與R4各自獨立地為H、鹵素、低碳烷基或經取代低碳烷基，或R3與R4或兩個R3基團視情況形成環(huán)烷基或雜環(huán)烷基；
R5各自獨立地為H、鹵素、烷基、經取代烷基、烯基、經取代烯基、炔基、經取代炔基、烷氧基、經取代烷氧基、烷基烷氧基、經取代烷基烷氧基、聚氧化烯、經取代聚氧化烯、芳基、經取代芳基、雜芳基、經取代雜芳基、烷芳基、經取代烷芳基、芳烷基、經取代芳烷基、-(亞烷基或經取代亞烷基)-ON(R″)2、OH、NH2、CN、NO2、-(亞烷基或經取代亞烷基)-C(O)SR″、-(亞烷基或經取代亞烷基)-S-S-(芳基或經取代芳基)、-C(O)R″、-C(O)2R″或-C(O)N(R″)2，其中R″各自獨立地為氫、烷基、經取代烷基、烯基、經取代烯基、烷氧基、經取代烷氧基、芳基、經取代芳基、雜芳基、烷芳基、經取代烷芳基、芳烷基、經取代芳烷基，或當存在一個以上R″基團時，兩個R″視情況形成雜環(huán)烷基；
或R5為L-X，其中，X是選自由以下各物組成的群組水溶性聚合物；聚氧化烯；聚乙二醇；聚乙二醇的衍生物；光交聯劑；至少一個氨基酸；至少一個糖基；至少一個核苷酸；至少一個核苷；配體；生物素；生物素類似物；可檢測標記；和其任何組合；并且L是可選的，并且當存在時為選自由以下各基團組成的群組的連接子亞烷基、經取代亞烷基、亞烯基、經取代亞烯基、-O-、-O-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-S-、-S-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-S(O)k-(其中k為1、2或3)、-S(O)k(亞烷基或經取代亞烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-N(R′)CO-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-N(R′)C(O)O-、-(亞烷基或經取代亞烷基)-O-N＝CR′-、-(亞烷基或經取代亞烷基)-C(O)NR′-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-(亞烷基或經取代亞烷基)-S(O)k-(亞烷基或經取代亞烷基)-S-、-(亞烷基或經取代亞烷基)-S-S-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、-N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-和-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自獨立地為H、烷基或經取代烷基；
當存在一個以上R5基團時，兩個鄰位R5基團可視情況形成雜環(huán)烷基或芳香族雜環(huán)烷基；
或含-B-吲哚的部分合起來形成包含至少一個吲哚部分的雙環(huán)或三環(huán)環(huán)烷基或雜環(huán)烷基；
或其活性代謝物、鹽或醫(yī)藥學上可接受的前藥或溶劑化物。
32.根據權利要求31所述的方法，其進一步包含投與醫(yī)藥學上可接受的載劑。
33.根據權利要求31所述的方法，其中X為聚氧化烯。
34.根據權利要求31所述的方法，其中X為至少一個氨基酸。
35.根據權利要求34所述的方法，其中X的所述至少一個氨基酸包括非天然氨基酸。
36.根據權利要求31所述的方法，其中X為可檢測標記。
37.一種治療病癥、病狀或疾病的方法，其包含投與治療有效量的具有結構式5、6、7或8的藥劑
其中
A是可選的，并且當存在時為低碳亞烷基、經取代低碳亞烷基、低碳亞環(huán)烷基、經取代低碳亞環(huán)烷基、低碳亞烯基、經取代低碳亞烯基、亞炔基、經取代亞炔基、低碳亞雜烷基、經取代亞雜烷基、低碳亞雜環(huán)烷基、經取代低碳亞雜環(huán)烷基、亞芳基、經取代亞芳基、亞雜芳基、經取代亞雜芳基、亞烷芳基、經取代亞烷芳基、亞芳烷基或經取代亞芳烷基；
B是可選的，并且當存在時為一端與含吲哚的部分鍵聯的連接子，所述連接子選自由以下各基團組成的群組低碳亞烷基、經取代低碳亞烷基、低碳亞烯基、經取代低碳亞烯基、低碳亞雜烷基、經取代低碳亞雜烷基、-亞芳基、經取代亞芳基、亞雜芳基、經取代亞雜芳基、-O-、-O-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-S-、-S-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-S(O)k-(其中k為1、2或3)、-S(O)k(亞烷基或經取代亞烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、-C(O)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-N(R′)CO-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)C(NCN)N(R′)-、-N(R′)C(NNO2)N(R′)-、-N(R′)C(NCOOR′)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)2-N＝N-和-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，并且R′各自獨立地為H、烷基或經取代烷基；
R1為H、氨基保護基或至少一個氨基酸；并且
R2為OH、酯保護基或至少一個氨基酸；
n為0、1、2或3，并且m為0、1、2或3，條件是n或m中的至少一個不為0；
其中，具有相締合Ra基團的結構1、2、3和4中的各環(huán)可含有0、1或2個Ra基團，并且Ra是各自獨立地選自由H、鹵素、烷基、經取代烷基、-N(R″)2、-C(O)R″、-C(O)N(R″)2、-OR″和-S(O)kR″(其中k為1、2或3)組成的群組，其中R″各自獨立地為H、烷基或經取代烷基；或當存在一個以上Ra基團時，兩個Ra可視情況形成芳基、環(huán)烷基或雜環(huán)烷基；
R3與R4各自獨立地為H、鹵素、低碳烷基或經取代低碳烷基，或R3與R4或兩個R3基團視情況形成環(huán)烷基或雜環(huán)烷基；
R5各自獨立地為H、鹵素、烷基、經取代烷基、烯基、經取代烯基、炔基、經取代炔基、烷氧基、經取代烷氧基、烷基烷氧基、經取代烷基烷氧基、聚氧化烯、經取代聚氧化烯、芳基、經取代芳基、雜芳基、經取代雜芳基、烷芳基、經取代烷芳基、芳烷基、經取代芳烷基、-(亞烷基或經取代亞烷基)-ON(R″)2、OH、NH2、CN、NO2、-(亞烷基或經取代亞烷基)-C(O)SR″、-(亞烷基或經取代亞烷基)-S-S-(芳基或經取代芳基)、-C(O)R″、-C(O)2R″或-C(O)N(R″)2，其中R″各自獨立地為氫、烷基、經取代烷基、烯基、經取代烯基、烷氧基、經取代烷氧基、芳基、經取代芳基、雜芳基、烷芳基、經取代烷芳基、芳烷基、經取代芳烷基，或當存在一個以上R″基團時，兩個R″視情況形成雜環(huán)烷基；
或R5為L-X，其中，X是選自由以下各物組成的群組水溶性聚合物；聚氧化烯；聚乙二醇；聚乙二醇的衍生物；光交聯劑；至少一個氨基酸；至少一個糖基；至少一個核苷酸；至少一個核苷；配體；生物素；生物素類似物；可檢測標記；和其任何組合；并且L是可選的，并且當存在時為選自由以下各基團組成的群組的連接子亞烷基、經取代亞烷基、亞烯基、經取代亞烯基、-O-、-O-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-S-、-S-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-S(O)k-(其中k為1、2或3)、-S(O)k(亞烷基或經取代亞烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-N(R′)CO-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-N(R′)C(O)O-、-(亞烷基或經取代亞烷基)-O-N＝CR′-、-(亞烷基或經取代亞烷基)-C(O)NR′-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-(亞烷基或經取代亞烷基)-S(O)k-(亞烷基或經取代亞烷基)-S-、-(亞烷基或經取代亞烷基)-S-S-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、-N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-和-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自獨立地為H、烷基或經取代烷基；
當存在一個以上R5基團時，兩個鄰位R5基團可視情況形成雜環(huán)烷基或芳香族雜環(huán)烷基；
或含-B-吲哚的部分合起來形成包含至少一個吲哚部分的雙環(huán)或三環(huán)環(huán)烷基或雜環(huán)烷基；
或其活性代謝物、鹽或醫(yī)藥學上可接受的前藥或溶劑化物。
38.根據權利要求37所述的方法，其進一步包含投與醫(yī)藥學上可接受的載劑。
39.根據權利要求37所述的方法，其中R1與R2都是至少一個氨基酸。
40.根據權利要求37所述的方法，其中X為聚氧化烯。
41.根據權利要求37所述的方法，其中X為至少一個氨基酸。
42.一種檢測患者中多肽的存在的方法，所述方法包含投與有效量的同源非天然氨基酸多肽，所述非天然氨基酸多肽包含至少一個具有化合物1-4的結構的非天然氨基酸
其中
A是可選的，并且當存在時為低碳亞烷基、經取代低碳亞烷基、低碳亞環(huán)烷基、經取代低碳亞環(huán)烷基、低碳亞烯基、經取代低碳亞烯基、亞炔基、經取代亞炔基、低碳亞雜烷基、經取代亞雜烷基、低碳亞雜環(huán)烷基、經取代低碳亞雜環(huán)烷基、亞芳基、經取代亞芳基、亞雜芳基、經取代亞雜芳基、亞烷芳基、經取代亞烷芳基、亞芳烷基或經取代亞芳烷基；
B是可選的，并且當存在時為一端與含吲哚的部分鍵聯的連接子，所述連接子選自由以下各基團組成的群組低碳亞烷基、經取代低碳亞烷基、低碳亞烯基、經取代低碳亞烯基、低碳亞雜烷基、經取代低碳亞雜烷基、-亞芳基、經取代亞芳基、亞雜芳基、經取代亞雜芳基、-O-、-O-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-S-、-S-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-S(O)k-(其中k為1、2或3)、-S(O)k(亞烷基或經取代亞烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、-C(O)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-N(R′)CO-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)C(NCN)N(R′)-、-N(R′)C(NNO2)N(R′)-、-N(R′)C(NCOOR′)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)2-N＝N-和-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，并且R′各自獨立地為H、烷基或經取代烷基；
R1為H、氨基保護基或至少一個氨基酸；并且
R2為OH、酯保護基或至少一個氨基酸；
n為0、1、2或3，并且m為0、1、2或3，條件是n或m中的至少一個不為0；
其中，具有相締合Ra基團的結構1、2、3和4中的各環(huán)可含有0、1或2個Ra基團，并且Ra是各自獨立地選自由H、鹵素、烷基、經取代烷基、-N(R″)2、-C(O)R″、-C(O)N(R″)2、-OR″和-S(O)kR″(其中k為1、2或3)組成的群組，其中R″各自獨立地為H、烷基或經取代烷基；或當存在一個以上Ra基團時，兩個Ra可視情況形成芳基、環(huán)烷基或雜環(huán)烷基；
R3與R4各自獨立地為H、鹵素、低碳烷基或經取代低碳烷基，或R3與R4或兩個R3基團視情況形成環(huán)烷基或雜環(huán)烷基；
R5各自獨立地為H、鹵素、烷基、經取代烷基、烯基、經取代烯基、炔基、經取代炔基、烷氧基、經取代烷氧基、烷基烷氧基、經取代烷基烷氧基、聚氧化烯、經取代聚氧化烯、芳基、經取代芳基、雜芳基、經取代雜芳基、烷芳基、經取代烷芳基、芳烷基、經取代芳烷基、-(亞烷基或經取代亞烷基)-ON(R″)2、OH、NH2、CN、NO2、-(亞烷基或經取代亞烷基)-C(O)SR″、-(亞烷基或經取代亞烷基)-S-S-(芳基或經取代芳基)、-C(O)R″、-C(O)2R″或-C(O)N(R″)2，其中R″各自獨立地為氫、烷基、經取代烷基、烯基、經取代烯基、烷氧基、經取代烷氧基、芳基、經取代芳基、雜芳基、烷芳基、經取代烷芳基、芳烷基、經取代芳烷基，或當存在一個以上R″基團時，兩個R″視情況形成雜環(huán)烷基；
或R5為L-X，其中，X是選自由以下各物組成的群組水溶性聚合物；聚氧化烯；聚乙二醇；聚乙二醇的衍生物；光交聯劑；至少一個氨基酸；至少一個糖基；至少一個核苷酸；至少一個核苷；配體；生物素；生物素類似物；可檢測標記；和其任何組合；并且L是可選的，并且當存在時為選自由以下各基團組成的群組的連接子亞烷基、經取代亞烷基、亞烯基、經取代亞烯基、-O-、-O-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-S-、-S-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-S(O)k-(其中k為1、2或3)、-S(O)k(亞烷基或經取代亞烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-N(R′)CO-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-N(R′)C(O)O-、-(亞烷基或經取代亞烷基)-O-N＝CR′-、-(亞烷基或經取代亞烷基)-C(O)NR′-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-(亞烷基或經取代亞烷基)-S(O)k-(亞烷基或經取代亞烷基)-S-、-(亞烷基或經取代亞烷基)-S-S-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、-N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-和-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自獨立地為H、烷基或經取代烷基；
當存在一個以上R5基團時，兩個鄰位R5基團可視情況形成雜環(huán)烷基或芳香族雜環(huán)烷基；
或含-B-吲哚的部分合起來形成包含至少一個吲哚部分的雙環(huán)或三環(huán)環(huán)烷基或雜環(huán)烷基；
或其活性代謝物、鹽或醫(yī)藥學上可接受的前藥或溶劑化物。
43.根據權利要求42所述的方法，其中所述多肽為與治療蛋白同源的蛋白質，所述治療蛋白選自由以下各物組成的群組α-1抗胰蛋白酶、血管抑素、抗溶血因子、抗體、載脂蛋白(apolipoprotein)、脫輔基蛋白(apoprotein)、心房利鈉因子、心房利鈉多肽、心房肽、C-X-C趨化因子、T39765、NAP-2、ENA-78、gro-a、gro-b、gro-c、IP-10、GCP-2、NAP-4、SDF-1、PF4、MIG、降血鈣素(calcitonin)、c-kit配體、細胞因子、CC趨化因子、單核細胞趨化蛋白-1、單核細胞趨化蛋白-2、單核細胞趨化蛋白-3、單核細胞炎性蛋白-1α、單核細胞炎性蛋白-iβ、RANTES、1309、R83915、R91733、HCC1、T58847、D31065、T64262、CD40、CD40配體、c-kit配體、膠原蛋白、菌落刺激因子(CSF)、補體因子5a、補體抑制劑、補體受體1、細胞因子、上皮中性粒細胞激活肽-78、MIP-16、MCP-1、表皮生長因子(EGF)、上皮中性粒細胞激活肽、紅細胞生成素(EPO)、剝脫性毒素(exfoliating toxin)、因子IX、因子VII、因子VIII、因子X、成纖維細胞生長因子(FGF)、纖維蛋白原、纖維粘連蛋白、四螺旋束蛋白、G-CSF、glp-1、GM-CSF、葡糖腦苷脂酶、促性腺激素、生長因子、生長因子受體、grf、刺猬蛋白(hedgehog protein)、血紅蛋白、肝細胞生長因子(hGF)、水蛭素、人類生長激素(hGH)、人類血清白蛋白、ICAM-1、ICAM-1受體、LFA-1、LFA-1受體、胰島素、類胰島素生長因子(IGF)、IGF-I、IGF-II、干擾素(IFN)、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、白細胞介素(IL)、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、角質細胞生長因子(KGF)、乳鐵蛋白、白血病抑制因子、熒光素酶、神經素(neurturin)、中性粒細胞抑制因子(NIF)、抑瘤素M、成骨蛋白、癌基因產物、paracitonin、甲狀旁腺激素、PD-ECSF、PDGF、肽激素、多效營養(yǎng)因子(pleiotropin)、蛋白質A、蛋白質G、pth、致熱外毒素A、致熱外毒素B、致熱外毒素C、pyy、松弛素、腎素、SCF、小生物合成蛋白、可溶性補體受體I、可溶性I-CAM 1、可溶性白細胞介素受體、可溶性TNF受體、生長調節(jié)素、生長抑素、生長激素(somatotropin)、鏈激酶、超抗原、葡萄球菌腸毒素、SEA、SEB、SEC1、SEC2、SEC3、SED、SEE、類固醇激素受體、超氧化物歧化酶、中毒性休克綜合癥毒素、胸腺素α1、組織型纖溶酶原激活劑、腫瘤生長因子(TGF)、腫瘤壞死因子、腫瘤壞死因子α、腫瘤壞死因子β、腫瘤壞死因子受體(TNFR)、VLA-4蛋白、VCAM-1蛋白、血管內皮生長因子(VEGF)、尿激酶、mos、ras、raf、met、p53、tat、fos、myc、jun、myb、rel、雌激素受體、孕酮受體、睪丸激素受體、醛固酮受體、LDL受體和皮質酮。
全文摘要
本發(fā)明中揭示非天然氨基酸和包括至少一個非天然氨基酸的多肽，以及制備這些非天然氨基酸和多肽的方法。非天然氨基酸(自身或作為多肽的一部分)可包括多種官能團，但通常具有至少一個吲哚、羰基和/或肼基。本發(fā)明中也揭示進一步經翻譯后修飾的非天然氨基酸多肽，實現這些修飾的方法，和純化這些多肽的方法。通常，經修飾的非天然氨基酸多肽包括至少一個吲哚、羰基和/或肼基。另外揭示使用這些非天然氨基酸多肽和經修飾的非天然氨基酸多肽的方法，其包括治療、診斷和其它生物技術用途。
文檔編號C07D209/14GK101578264SQ200780046973
公開日2009年11月11日 申請日期2007年12月18日 優(yōu)先權日2006年12月18日
發(fā)明者苗振偉, 劉俊杰 申請人:Ambrx公司