專利名稱：合成含有氨基酸和/或肽的接枝共聚物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一類新的含有氨基酸和/或肽的接枝共聚物，并具有強(qiáng)的粘接作用，它們廣泛地適用于各種生物醫(yī)學(xué)。這些接枝共聚物適合于代謝作用，在玻璃試管內(nèi)或在體內(nèi)有生長和活化組織和/或細(xì)胞的作用。
聚合材料已廣泛用于移植物或其他生物醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用。這是由于它們與天然細(xì)胞組織成份如膠原蛋白極其相似。該成份可與其它物質(zhì)直接結(jié)合。對數(shù)十種肽的研究，制出了多種有用的生物醫(yī)學(xué)多肽。然而仍有大量的聚合物尚未加以評價(jià)和使用，這些聚合物由于其高度柔軟的骨架和許多有功能的側(cè)鏈而具有引人注目的性能，這包括難熔性、機(jī)械強(qiáng)度和粘接能力。
近年來，已萃取、提純出膠原蛋白、昆布氨酸、血纖維素蛋白和纖維結(jié)合素并作為細(xì)胞組織和細(xì)胞粘接促進(jìn)劑在市場上出售，合成的聚-D-賴氨酸和聚-L-賴氨酸也是為此目的而進(jìn)行銷售的。但這些還存在著明顯不足之處，即限制了這類聚合物的用途，如(a)它們僅能與有限的幾種類型的基體起作用或它們僅對一些特殊類型的細(xì)胞有效;和(b)人血中的血纖維素蛋白和纖維結(jié)合素對健康有潛在的危害。
最近，Waite和Tanzer在“科學(xué)”Vol.212，1038-1040頁(1981)上確定了某些天然的極強(qiáng)粘接劑，生物粘接劑多酚朊，它是由生活在水下并定期克服擊岸波力和潮汐力的海生貽貝所分泌的。自然界中存在的生物粘接劑多酚朊是由貽貝的外分泌酚腺產(chǎn)生并存貯的，并由貽貝的腳在形成新的令人生厭的粘接劑的形成過程中沉積在海岸表面上。天然的生物粘接劑多酚朊可按照“生物化學(xué)雜志”，Vol.258，2911-15頁(1983)或US-4，496，397所述的方法進(jìn)行萃取和提純。
從貽貝中提取天然生物粘接劑多酚朊的應(yīng)用受到其能得到的量所限制?，F(xiàn)在只能滿足少量研究和某些醫(yī)療上的應(yīng)用。
形成生物粘接劑多酚朊在重復(fù)單元的同感十肽菌素可按照US-4，585，585所述的方法進(jìn)行聚合來制取。由人工合成得到的生物粘接劑多酚朊具有粘接劑特性，但受到一些限制，即所得分子量僅約10，000至20，000，因而限制了其粘接強(qiáng)度，另外，由于難于控制的副反應(yīng)以及很難有效地解開其保護(hù)的氨基酸，十肽菌素的聚合反應(yīng)是很復(fù)雜的，因此這種合成材料在許多需要較強(qiáng)粘接強(qiáng)度的方面就不能使用。
除了聚-D-賴氨酸和聚-L-賴氨酸以外，多肽粘接劑必須從生物源中提取。通常合成聚合物最好盡可能避免引入生物的衍生物，盡管其量很小，但卻會危害和污染。
人們發(fā)現(xiàn)以合理的費(fèi)用來合成而制得的高分子量物質(zhì)，聚-D-賴氨酸和聚-L-賴氨酸，但對細(xì)胞組織的粘接不很有效。同樣地生物粘接劑多酚朊的十肽菌素低聚物也不具有令人滿意的粘接性能，而采用傳統(tǒng)程序聚合反應(yīng)將十肽菌素進(jìn)行聚合的幾次試驗(yàn)也不能形成足夠高的聚合度，致使所生產(chǎn)的十肽菌素聚合物的粘接性能無法與從貽貝中提取的天然生物粘接劑多酚朊相比。
令人驚奇的是現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)十肽菌素低聚物的立體化學(xué)對生物粘接劑多酚朊的粘接特性并非是必需的，還出人預(yù)料地發(fā)現(xiàn)一種聚合物僅需含有一定數(shù)量的3，4-二羥苯丙氨酸(Dopa)不必含有完整的十肽菌素鏈區(qū)就具有良好的粘接性能。現(xiàn)在更進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)聚合物的分子量具有關(guān)鍵性。這是由于主鏈聚合物和最終的接枝共聚物具有陽離子性能。
因此本發(fā)明的第一目的是提供一種具有強(qiáng)粘接作用的含有氨基酸和/或肽的接枝共聚物。
本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供一種可變通的方法以合成常規(guī)設(shè)定的含有氨基酸和/或肽的接枝共聚物，適用于特定的最終用途和/或表面。
本發(fā)明更進(jìn)一步的目的是重復(fù)合成一種具有特殊分子量、二羥苯丙氨酸(Dopa)含量和粘接性的接枝共聚物。
在實(shí)現(xiàn)本發(fā)明這些以及其他目的的同時(shí)，本發(fā)明提供水溶性的含有陽離子氨基酸和/或肽的接枝共聚物，具有分子量約從30，000至500，000，包括有(a)一種聚合物主鏈，它含有或通過改性可給出自由的伯或仲胺功能團(tuán)以便與氨基酸或肽接枝反應(yīng)，該主鏈分子量約從10，000至250，000;和(b)與聚合物主鏈上至少約5%至100%的伯或仲胺功能團(tuán)進(jìn)行接枝反應(yīng)的氨基酸或肽，其中所說的氨基酸或肽的接枝物，包括至少一個(gè)3，4-二羥苯丙氨酸(Dopa)或其可經(jīng)羥基化成為Dopa形式的前體。
根據(jù)本發(fā)明含有氨基酸和/或肽的接枝共聚物，其形式可以變化，從而控制(a)分子量、陽離子度、接枝到聚合物主鏈上的氨基酸或肽單元的取代百分比，(b)含有氨基酸和/或肽的接枝共聚物本身的化學(xué)和物理結(jié)構(gòu)，故此本發(fā)明的聚合物可制成適合于特殊的最終用途。
為了更全面地了解本發(fā)明，請參閱本發(fā)明的附圖及下面所述的例子。


圖1是用于合成含肽接枝共聚物PAA-SA-Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Hyp-Thr-Dopa-Lys-OH，所采用程序的示意圖，在例1中將加以詳述。
圖2是用于合成含肽接枝共聚物H-Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Hyp-Thr-Dopa-Lys-PLL所采用程序的示意圖，在例2中將加以詳述。當(dāng)然，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明并不限于這里所述的個(gè)別例子。
接枝共聚物是由一種聚合物或共聚物作為主鏈，在其上可接上一個(gè)或多個(gè)支鏈，接枝共聚物一般所具有的性質(zhì)與由相同單體單元在直鏈上無規(guī)則分布而形成的常規(guī)共聚物的性質(zhì)，可觀察其不同之處，常規(guī)共聚物的性質(zhì)一般介于二種均聚物性質(zhì)之間，而接枝共聚物可具有每種組分的一些性質(zhì)。
“肽”這個(gè)詞在本發(fā)明中是廣義的解釋。該詞包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸以及天然和合成的肽。在任何情況下，肽都是或包括至少一個(gè)Dopa基團(tuán)或一個(gè)能迅速羥基化而成為Dopa形式的前體。因?yàn)橐寻l(fā)現(xiàn)此基團(tuán)對粘接作用是必要的。
本發(fā)明的含肽接枝共聚物的聚合物主鏈最好是水溶性的，因而由其制得的接枝共聚物也將是水溶性的。一些聚合物雖然不是水溶性的，但與某些特定功能團(tuán)反應(yīng)后能具有水溶性，這樣的聚合物也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。接枝共聚物在水中的溶介度是以組織、細(xì)胞和其它生物學(xué)活性部分在水溶液中的溶介為基準(zhǔn)的，當(dāng)然，是不能使用有機(jī)溶劑。
聚合物主鏈也必須是陽離子的或能表現(xiàn)為陽離子的，以便與負(fù)電荷的生物學(xué)表面產(chǎn)生強(qiáng)烈的靜電相互作用。一般說來，對含有必需的自由伯和仲胺基團(tuán)的聚合物主鏈的改性會使聚合物主鏈表現(xiàn)為既有水溶性和陽離子化。含有自由伯或仲胺基團(tuán)的接枝共聚物主鏈應(yīng)呈現(xiàn)的PK值至少約為8，最好約從8.5至約10。
此外，聚合物主鏈必須含有足夠的伯或仲自由胺功能團(tuán)以便與肽接枝物能進(jìn)行反應(yīng)成為含肽的接枝共聚物，從而表現(xiàn)出所期望的生物粘接性質(zhì)。還有對于不包含有所說的胺基團(tuán)，但可通過改性而含有所說基團(tuán)的聚合物主鏈也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在最佳的實(shí)施例中，聚合物主鏈?zhǔn)怯擅總€(gè)含有或經(jīng)改性而含有一個(gè)自由伯或仲胺功能團(tuán)的單體重復(fù)單元所組成的。換句話說，主鏈可以是一個(gè)不含有一個(gè)自由胺基的單體單元所組成的共聚物。然而在所有的情況下，對于含有或經(jīng)改性而含有自由伯或仲胺基的單體單元來說，所需要的自由胺基數(shù)量必須至少為約從1，000，000至25，000，000摩爾/克聚合物，以便與肽接枝物進(jìn)行反應(yīng)。
分子量是這些粘接劑的一個(gè)關(guān)鍵特性。這里所用的一切分子量都是指數(shù)均分子量。含肽的接枝共聚物必須有足夠高的分子量，以便提供足夠數(shù)量的分子間的鍵并在基質(zhì)和粘接劑之間進(jìn)行連接，將基質(zhì)粘接到粘接劑上。如分子量在30，000以下，含肽的接枝共聚物因未獲得足夠的總分子量而不能形成粘接劑。如果分子量在約500，000以上，含肽的接枝共聚物因太粘以致不能從溶液中過濾或沉淀出來，因而難于將其用于基質(zhì)上。聚合物主鏈的分子量應(yīng)約從10，000至約250，000，最好約從30，000至約150，000。
可從市場購買的適用主鏈聚合物包括聚賴氨酸、聚烯丙胺、聚氮丙啶、脫乙酰殼多糖、聚乙烯胺、硫酸軟骨素、聚右旋糖酐、透明質(zhì)酸、聚丙烯酸、聚丙烯腈以及像聚(Lys、Tyr)、聚(Lys、Ser)等具有所需分子量的共聚物。
為了在生物醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用，要求聚合物主鏈?zhǔn)怯珊凶銐虻姆磻?yīng)部位以便粘接含肽接枝物的單體所組成，合適的單體包括氨基酸、碳水化合物、肽、類脂、糖脂、丙烯酸、烯丙胺等，以及這些物質(zhì)的各種混合物。
另外，聚合物主鏈對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員可用已知的聚合方法進(jìn)行合成。聚合物主鏈必須含有足夠的陽離子單體成份或能表現(xiàn)出陽離子性而能形成所需陽離子度的單體成份;所生產(chǎn)的聚合物其PK值最好約為8。合適的水溶性陽離子單體包括賴氨酸、烏氨酸、氨基糖、烯丙酸、乙烯胺等等。聚合物也必須是水溶性的或能表現(xiàn)為水溶性的，因此選擇任何非活性共聚用單體必須能使生成的聚合物是水溶性的。合適的非活性共聚用單體包括中性的或酸性的氨基酸，糖和羥酸等。
此外，需要這樣的主鏈/肽混合物，即所粘合的肽移植的活度應(yīng)盡可能保留多一些，根據(jù)預(yù)定的用途，混合物應(yīng)是水溶性的且容易過濾消毒。
肽接枝物與主鏈聚合物的反應(yīng)在每種情況下都應(yīng)準(zhǔn)許在肽接枝物的反應(yīng)基團(tuán)和主鏈聚合物的反應(yīng)基團(tuán)之間形成共價(jià)鍵。在某些情況下，自由的肽接枝物和那些已定位之間發(fā)生反應(yīng)形成雙的或三重的肽接枝物。
肽接枝物必須至少含有一個(gè)3，4-二羥苯丙氨酸(Dopa)氨基酸或用共同未決申請(申請?zhí)?56594，申請日為86年5月25日)所揭示的方法經(jīng)羥基化能形成Dopa形式的前體。經(jīng)羥基化可形成Dopa形式的例子包括酪氨酸和苯丙氨酸。Dopa基團(tuán)的存在提供了很強(qiáng)的氫結(jié)合，當(dāng)其用于水環(huán)境中時(shí)，可很好地與水競爭，將其從表面進(jìn)行取代。Dopa基團(tuán)也提供了金屬螯合，在出現(xiàn)粘接的固化過程中形成邁克爾型親核縮合產(chǎn)物。
氨基酸如賴氨酸、丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、甘氨酸、羥基脯氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、組氨酸等可以任何所需比例，與包括肽接枝物來產(chǎn)生不同性質(zhì)的含肽接枝共聚物。
脯氨酸是公知的結(jié)構(gòu)破乳劑，它對接枝物提供一個(gè)開放的構(gòu)成，將大部分分子暴露于表面，從而增加了吸附作用。賴氨酸帶有高PK值，在生理?xiàng)l件下具有很強(qiáng)的離子相互作用。
肽接枝物的特殊例子包括Dopa、Dopa-Lys-Ala-Lys、Hyp-Hyp-Thr-Dopa-Lys、Ala-Lys-Pro-Ser-Dopa、Dopa-Hyp-Hyp-Thr、Hyp-Thr-Dopa-Lys、Dopa-Hyp-Lys-Ser、Dopa-Lys-Ala-Lys-Hyp-Ser-Tyr、Dopa-LysAla-Lys-Hyp-Ser-Tyr-Hyp-Hyp-Thr、Lys-Hys-Ser-Dopa-Hyp-Hyp-Thr-Dopa-Lys、Dopa-Lys-Glu-Ser-Hyp、Dopa-Lys-Cys(SO3H)-Lys、Cys(SO3)-Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Hyp-Thr-Dopa-Lys、Hyp-Hyp-Thr-Tyr-Lys、Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr、Phe-Tyr-Lys-Ser、Hyp-Hyp-Thr-Phe-Lys等。
含肽接枝共聚物產(chǎn)物的總分子量范圍從約30，000至約500，000，而以約70，000至約350，000為較好，最好是約100，000。要達(dá)到必要的分子量，當(dāng)然取決于主鏈聚合物的分子量，肽接枝物的分子量以及取代程度。對上述參數(shù)加以變更可預(yù)制用于各種特殊目的用途的聚合物。
含肽接枝共聚物必須含有接枝在至少5%至約100%的自由伯或仲胺功能團(tuán)的肽單元(以下簡稱為%取代)，含肽接枝共聚物的最小%取代將根據(jù)聚合物主鏈的特性而發(fā)生變化。然而，在所有的情況下，最小%取代量必須足以使形成的含肽接枝共聚物具有所需的分子量，溶介度和陽離子度特性，以及所希望的生物粘接劑性質(zhì)。
在最佳實(shí)施例中，聚合物主鏈含有或經(jīng)改性后含有重復(fù)的單體單元，每個(gè)單元都含有自由的伯或仲胺單元，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)必須至少有5%的自由胺基與肽接枝物反應(yīng)以獲得所需的生物粘接劑性質(zhì)。在此最佳實(shí)例中，%取代量約從7%至約30%，最好是約從10%至約20%，這種類型聚合物主鏈的例子包括聚賴氨酸和聚烯丙胺，其中重復(fù)的單體單元分別是賴氨酸和烯丙胺。
聚合物主鏈也可以是由不同單體單元組成的共聚物，每個(gè)單體單元不一定包括自由的伯或仲胺單元。對于這種類型的主鏈聚合物需要較大的最小取代度以獲得所需的生物粘接劑性質(zhì)。作為一個(gè)極端的例子，聚合物主鏈中自由伯或仲胺基的數(shù)量可以足夠低，由100%的肽接枝所取代，制成具有所需性質(zhì)的含肽接枝共聚物，再者，肽接枝物的最小%取代量必須足夠高，以致使制成的具有分子量約從30，000至約500，000范圍的含肽接枝共聚物，并有所需的溶介度和陽離子度特性。
本發(fā)明含有一個(gè)以上氨基酸的肽是用Merrifield在“美國化學(xué)會志”85卷，2149-2154頁(1963)所述的工藝而制備的。所涉及的合成是將受保護(hù)的氨基酸逐步加到增長的肽鏈上，該鏈通過共價(jià)鍵連接到固體載體上(如固體樹脂珠粒)。這種方法的總概念取決于用共價(jià)鍵將鏈上的第一個(gè)氨基酸連接到固體聚合物樹脂珠粒上，以及逐步的方式每次接上一個(gè)氨基酸直到收集到所需的結(jié)果為止。最后從固體載體上除去肽，然后除去保護(hù)基。這種方法所提供的肽增長鏈連接到完全不溶固體粒子上。因此以適宜的方式將其過濾并洗去試劑和副產(chǎn)品。
氨基酸可連接到任何適宜的聚合物珠粒上，該聚合物在所用的溶劑中是不溶介的，并且在過濾后具有穩(wěn)定的物理形式。這樣的聚合物珠粒必須含有一個(gè)這樣的功能團(tuán)，即第一個(gè)受保護(hù)的氨基酸通過共價(jià)鍵牢固地鍵合到它上面。適用此目的各種聚合物珠粒的例子如聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚葡聚糖、脫乙酰殼多糖等。
在氨基酸上的各種功能團(tuán)雖然是活性的，但并不進(jìn)入反應(yīng)，在整個(gè)反應(yīng)過程中，像用于多肽工藝中那樣，都用傳統(tǒng)的保護(hù)基團(tuán)方法將這些功能團(tuán)保護(hù)起來。
氨基酸的α-氨基是用一個(gè)叔丁基氧代羰基(BOC)或一個(gè)芴基甲氧基羰基(FMOC)或一個(gè)其等效物加以保護(hù)。羥基功能是用一個(gè)芐基或芐基衍生物基團(tuán)如4-甲氧芐基、4-甲芐基、3，4-二甲芐基、4-氯芐基、2，6-二氯芐基、4-硝基芐基、芐基氫化基或一個(gè)其等效物加以保護(hù)。
半胱氨酸的硫羥的功能可用上述的芐基或芐基衍生保護(hù)基或用一個(gè)正-烷基硫代基如甲基硫代基、乙基硫代基、正-丙基硫代基、正-丁基硫代基或其等效物加以保護(hù)。精氨酸的胍基功能可用一個(gè)硝基、甲苯磺?；蛞粋€(gè)其等效物加以保護(hù)。賴氨酸的ε-氨基功能可用一個(gè)芐基氧代羰基或一個(gè)芐基氧代羰基衍生物如2-氯芐基氧代羰基、2-溴芐基氧代羰基、3，4-二甲基芐基氧代羰基或其等效物加以保護(hù)。用于組氨酸的咪唑氮原子保護(hù)基是芐基、甲苯磺?；蛉缟鲜鲇糜谫嚢彼岬钠S基氧代羰基或芐基氧代羰基的衍生物。
一旦獲得所需的肽，就將其與聚合物主鏈進(jìn)行反應(yīng)生成接枝共聚物。此方法的第一步是裂開肽的終端保護(hù)基團(tuán)。然后將肽與一個(gè)雙功能團(tuán)交聯(lián)試劑反應(yīng)。適合于此目的的交聯(lián)劑包括雙琥珀酰亞胺基辛二酸、雙琥珀酰亞胺基癸二酸、雙琥珀亞胺基酒石酸、二硫代雙(琥珀酰亞胺基丙酸酯)、1，2-亞乙基二醇雙(琥珀酰亞胺基琥珀酸酯等。在終端含有一個(gè)活性基的肽，然后從固體載體上裂開，所用的裂介試劑對于肽合成技術(shù)，本領(lǐng)域的技術(shù)人員是熟知的，如三氟乙酸、甲烷磺酸、氟化氫等。將保護(hù)基團(tuán)，固體載體和已選定的裂介試劑進(jìn)行適當(dāng)?shù)慕M合，最后一步是提供一種水溶性的，含有一個(gè)活性基能與所選定的聚合物主鏈上自由的伯或仲胺基進(jìn)行反應(yīng)的自由肽。自由肽與聚合物主鏈在一種適宜的緩沖溶液如三乙胺硼酸鹽、四硼酸鈉等中混合并進(jìn)行反應(yīng)生成含肽接枝共聚物。
本發(fā)明的含肽接枝共聚物僅對某些確定的應(yīng)用表現(xiàn)出足夠的粘接性能，如將細(xì)胞、蛋白質(zhì)和細(xì)胞組織部分定位到惰性基質(zhì)如塑料和玻璃上或生物基質(zhì)如皮膚移植上或人造靜脈材料上等。
通過加入交聯(lián)劑可提高肽接枝共聚物的粘接強(qiáng)度。交聯(lián)劑在基質(zhì)和共聚物之間以及共聚物自身之間促進(jìn)含肽接枝共聚物的局部或全部交聯(lián)。交聯(lián)的本質(zhì)尚不清楚，但可認(rèn)為必定含有共價(jià)鍵。所用交聯(lián)劑的準(zhǔn)確重量百分比取決于含肽接枝共聚物的分子量以及交聯(lián)劑的純度。
適用的交聯(lián)劑包括例如、酶催化氧化劑如兒茶酚氧化酶、
酪氨酸酶、或帶有任何數(shù)量的活性功能團(tuán)的化學(xué)交聯(lián)劑、這類交聯(lián)劑包括戊二醛、甲醛、雙(硫代琥珀酰亞胺基)辛二酸酯和3，3-二硫代雙(硫代琥珀酰亞胺基丙酸酯)、或甚至是化學(xué)氧化劑如氧或過氧化物，或配位劑如鐵、鋁、錳等。
在各種應(yīng)用中，可加入表面活性劑，填料、染料、抗菌素、治療劑等。
以下的例子用以說明本發(fā)明含肽接枝共聚物的合成方法、用作粘接劑和含肽接枝共聚物的粘接強(qiáng)度。這里的這些例子僅用于說明的目的而不構(gòu)成對本發(fā)明權(quán)利要求的限制。在本領(lǐng)域的技術(shù)人員了解所述的本發(fā)明后，可以作出許多變更或修改，它們均屬于本發(fā)明的構(gòu)思或范圍之內(nèi)。
例1PAA-SA-Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Hyp-Thr-Dopa-Lys-OH的合成例1中含肽接枝共聚物合成方法所用的工藝流程簡要在圖1中說明。
將含有1毫克當(dāng)量羥基的對-芐氧基芐醇樹脂(1克)用二氯甲烷沖洗幾次，加入FMOC-Lys(BOC)-OH(1mm0.465克)、1毫升溶于二氯甲烷中的1N二環(huán)己基碳二亞胺(DCCI)(1mm)溶液和加入對-二甲胺基吡啶(1.0mm0.124克)。將懸浮液搖動(dòng)6小時(shí)。重復(fù)此偶聯(lián)作用，然后把樹脂用0.5毫升苯甲酰氯和0.5毫升的吡啶處理，再搖動(dòng)30分鐘，然后用乙醇、二甲基乙酰胺(DMAC)和二氯甲烷徹底洗滌樹脂并在真空下干燥。每克樹脂的FMOC-Lys(BOC)-OH含量用分光光度測定法測定為0.6-0.8mm/gm。
將FMOC－Lys(BOC)－對－芐酯樹脂(I)放入一個(gè)反應(yīng)罐(ACT200型,肽自動(dòng)合成器)中，所用的洗滌和反應(yīng)都用15-20毫升的溶劑進(jìn)行。操作周期的草案由以下內(nèi)容組成1，用二甲基乙酰胺(DMAC)洗滌2，用15%哌啶/二甲基-亞砜(1×5分鐘，1×15分鐘介封3，用DMAC洗滌4，用二氯甲烷洗滌5，用成型的FMOC-氨基酸的1-羥基苯并三唑(HOBT)酯偶聯(lián)6，用乙醇、DMAC、二氯甲烷洗滌苯并三唑酯的制備是在一個(gè)預(yù)先活化罐中將各為3當(dāng)量的FMOC-氨基酸，HOBT和二環(huán)己基碳二亞胺(DCCI)在二氯甲烷中混合20分鐘而成的。在二氯甲烷中進(jìn)行偶聯(lián)30分鐘，再在二氯甲烷/二甲基亞砜(比例為2∶1)中偶聯(lián)1.5小時(shí)。偶聯(lián)的完全度用Keiser測試法〔由Keiser等人在“分析生物化學(xué)”Vol.34。595-598頁(1970)中說明〕進(jìn)行監(jiān)控。用適當(dāng)?shù)厥茏钄嗟陌被嵫苌镱A(yù)成型9個(gè)周期。(圖Ⅰ，Ⅲ)最后的一個(gè)周期用雙琥珀酰亞胺基辛二酸(DSS)或雙琥珀酰亞胺基癸二酸(DSA)偶聯(lián)預(yù)成型。
將合成完畢后的肽反應(yīng)產(chǎn)物從反應(yīng)罐送出，然后用三氟乙酸/兒茶酚處理45分鐘(圖Ⅰ，Ⅳ)。濾出樹脂并將濾液蒸發(fā)，加入醚沉淀出肽琥珀酰亞胺酯三氟乙酸鹽。
將肽琥珀酰亞胺酯三氟乙酸鹽加到4mm的聚烯丙胺的鹽酸水溶液中，并強(qiáng)力攪拌，加入三乙氨基硼酸鹽緩沖劑(1M、PH為9.5)將PH調(diào)至8.5(圖Ⅰ，Ⅴ)。30分鐘后用稀鹽酸(Hcl)將混合物酸化至PH為2，然后用分子量截止為約8000-12，000的滲析袋滲析36小時(shí)并在冷室中更換3次4升0.001NHcl。將此溶液凍干、形成Hcl鹽的聚烯丙胺-肽(圖Ⅰ，Ⅵ)，這在HPLC上產(chǎn)生一個(gè)單峰并具有恰當(dāng)?shù)陌被峤槲鰯?shù)。發(fā)現(xiàn)在聚烯丙胺上約10%的氨基被肽?；?。
例2，H-Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Hyp-Thr-Dopa-Lys-PLL的合成例2是含肽接枝共聚物所使用的合成程序的概要在圖2中說明。
用例1的方法制備FMOC-Lys(BOC)-對-芐氧基芐酯樹脂并用例1同樣的方法進(jìn)行9個(gè)周期的氨基酸偶聯(lián)預(yù)先型(圖2、Ⅰ)。N終端丙氨酸以它的BOC-衍生物形式偶聯(lián)，而Dopa則以FMOC-Dopa(Cl2Bzl)2-OBT的形式加入。
將肽合成完畢后的反應(yīng)產(chǎn)物從反應(yīng)罐中送出，然后用三氟乙酸/兒茶酚處理45分鐘(圖2，Ⅶ)。濾出樹脂并將濾液蒸發(fā)。加入醚沉淀出十肽菌素三氟乙酸鹽(圖2，Ⅷ)。
將十肽菌素三氟乙酸鹽溶于二噁烷/水(1∶1)中并用各是4當(dāng)量的三乙胺和二-叔丁基碳酸氫鈉進(jìn)行處理，在過濾紙上呈陰性的水合茚三酮試驗(yàn)表明完成了反應(yīng)。然后用稀鹽酸將混合物酸化至pH為3，蒸發(fā)，用醚沉淀，然后濾出沉淀的BOC-十肽菌素。
然后將1mm的BOC-十肽菌素在四氫呋喃中用1.1mm的二環(huán)己基碳二亞胺和2mm的五氟化酚進(jìn)行處理。攪拌45分鐘后濾出沉淀的二環(huán)己基脲并蒸發(fā)濾液。將殘余物用乙醚沉淀，過濾并在真空條件下干燥、得到BOC-十肽菌素-對-氟苯酯(圖2，Ⅹ)。
將此制備的BOC-十肽菌素-五氟苯酯用三氟乙酸/兒茶酚處理45分鐘，加入醚后接著蒸發(fā)沉淀出的十肽菌素-五氟苯酯三氟乙酸鹽(圖2，Ⅺ)。這是在一塊多孔玻璃上進(jìn)行收集的，過濾，用醚凈化并在真空條件下于干燥器中干燥。
將1mm的十肽菌素五氟苯酯三氟乙酸鹽加到4mm的聚-L-賴氨酸氫溴鹽水溶液中，強(qiáng)力攪拌加入三乙氨基硼酸鹽緩沖液(1M，PH9.5)使PH值調(diào)至8.5，30分鐘后用稀鹽酸將混合物酸化至PH為2，凍干得到部分受阻斷的含肽接枝共聚物(圖2，Ⅻ)。
將部分受阻斷的含肽接枝共聚物Ⅻ溶于三氟乙酸中并用乙烷二硫醇、苯硫基甲烷溶液和三氟甲烷磺酸進(jìn)行處理。20分鐘后加入乙醚，用多孔玻璃漏斗過濾沉淀出的產(chǎn)品，并用乙醚和乙酸乙酯洗滌，然后將含肽接枝共聚物溶于水中，用分子量截止為約30，000的滲析袋滲析36小時(shí)并在冷室中更換3次4升的0.001NHcl，將溶液凍干形成Hcl鹽的聚-L-賴氨酸肽接枝共聚物，(圖2，ⅩⅢ)，這在HPLC上出現(xiàn)一個(gè)單峰并產(chǎn)生預(yù)期的氨基酸，可發(fā)現(xiàn)聚-L-賴氨酸上約10%的氨基被十肽菌素?；?br> 例3，H-Dopa-PAA的合成將1mm的叔-丁氧基羰基(BOC)-Dopa在四氫呋喃中用2mm的N-羥基琥珀酰亞胺和1mm的二環(huán)己基碳二亞胺進(jìn)行處理。攪拌1小時(shí)后濾出沉淀的二環(huán)己基碳二亞胺并將濾液蒸發(fā)干燥，然后將干燥物再溶于乙醇中并加到2mm的聚烯丙胺鹽酸化物的水溶液中，加入三乙氨基硼酸鹽緩沖液(1M，PH9.5)使PH值調(diào)至8.5。攪拌30分鐘后將混合物用稀鹽酸化至PH為2，然后將溶劑蒸發(fā)，殘余物用三氟乙酸進(jìn)行處理除去叔-丁氧羰基，加入乙醚后接著蒸發(fā)沉淀出的Dopa-聚合物，用多孔玻璃漏斗過濾。
然后將含Dopa的接枝共聚物溶于水中，用分子量截止為8，000-12，000的滲析袋滲析36小時(shí)，并在冷室中更換3次4升的0.001NHcl。
所得到的粉狀Dopa-聚烯丙胺接枝共聚物經(jīng)冷凍干燥后在HPLC上出現(xiàn)一個(gè)單峰，可以發(fā)現(xiàn)聚烯丙胺上約40%的氨基被Dopa?；?，結(jié)果分子量為70，000。
例4至10使用上述例1的工藝流程，制備出以下的含肽接枝共聚物。
例18采用上述例3的工藝流程，制備含有氨基酸的接枝共聚物和H-Dopa-PLL。所形成的接枝共聚物的分子量為37，000并發(fā)現(xiàn)聚賴氨酸上10%的氨基被Dopa?；?。
對比例19至20采用上述例3的工藝流程，制備下列含有氨基酸的接枝共聚物對比例號氨基酸主鏈%取代分子量19H-絲氨酸PAA20%41K20H-酪氨酸PAA10%40K對比例21至23采用肽合成技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的標(biāo)準(zhǔn)方法制備下列合成聚合物對比例號說明分子量21Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Hyp-Thr-Dopa-Lys＝(10P)119822(10P)n1Dopa，2Hypo(1538)n＜20K23H-Dopa-Lys-Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-OH(853)n＜10K例21中所采用的制備十肽菌素的技術(shù)已由Baran和Merrifield在“肽”Vol.2.1-284頁(1980)，“美國化學(xué)會志”Vol.95.1328-33(1973)，以及由meienhoffer等人在“國際肽蛋白研究會志”Vol.13，35-42頁(1979)加以敘述。對比例22和23中的低分子量十肽菌素聚合物是用標(biāo)準(zhǔn)方法獲得的，該方法在肽化學(xué)中用于線性聚合，此方法已由Yamamoto在“化學(xué)會志”PerkinTrans，Vol.I，613-617頁(1987)加以說明。
例23此例子說明本發(fā)明含肽接枝共聚物用于細(xì)胞固定的粘接作用。
由貽貝中提取純的生物粘接劑多酚朊，Mytilis，edulis已按特別的配方制備并作為對比物，用作生物活性材料(CELL-TAK
粘接劑，可從Biopolymers，Inc.Farmington.CT得到)固定在單一組份形式的惰性基片上。CELL-TAK
粘接劑和含肽接枝共聚物在大約4℃的5%(V/V)乙酸中貯存。
將三種哺乳動(dòng)物細(xì)胞類型分別與用CELL-TAK
粘接劑的附著物，未涂覆細(xì)胞組織培養(yǎng)塑料器具的附著物以及用本發(fā)明含肽接枝共聚物涂覆的塑料器具附著物進(jìn)行對比。依照在小倉鼠腎細(xì)胞上的固著物(BHK-21;ATCC CCL10)在含有10%小牛皮血清和10%胰蛋白
磷酸鹽肉湯的Basal Medium Eagle′s(BME)中生長。人類組織淋巴細(xì)胞(u-937;ATCC CRL1593)在含有10%小牛皮血清的RPMI 1640介質(zhì)中生長。淋巴細(xì)胞(P3×63-Ag8.653;ATCC CRL1580)除了用20%熱鈍化胎兒牛血清外，也能同樣生長。后兩種細(xì)胞類型的獨(dú)立的固著物，因此在懸浮體培養(yǎng)液中操作。
所有的蛋白質(zhì)都用溶液澆鑄方法涂覆在細(xì)胞組織培養(yǎng)塑料器具上。對于所有的試驗(yàn)，用10毫克/毫升的微升體積溶液噴涂并干燥于35毫米直徑、10平方厘米的塑料盤上，最終密度為0.5～5微克/平方厘米。用空氣干燥后，將盤用一次乙醇(95%V/V)和二次蒸餾水漂洗。
檢定附著物在37℃下維持20分鐘后所附著細(xì)胞的量，BHK細(xì)胞從托盤上受胰蛋白酶的作用，并用新鮮介質(zhì)通過離心作用進(jìn)行洗滌，然后懸浮在新的帶有10%小牛血清，密度為2×105細(xì)胞/毫升的RPMI 1640，在懸浮液中生長的U-937和P3X細(xì)胞通過離心作用進(jìn)行洗滌并再懸浮到相似的密度。將懸浮液接種到未處理的細(xì)胞組織的培養(yǎng)皿上作為另一個(gè)對照物，別的器皿用純的生物粘接劑多酚朊和本發(fā)明的接枝共聚物處理。到20分鐘時(shí)，輕度攪拌，然后從器皿上除去未附著的細(xì)胞并用血球計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。計(jì)算數(shù)據(jù)是用附著的細(xì)胞數(shù)減去從細(xì)胞盤中器皿上(均分為3)所得未附著細(xì)胞數(shù)除以細(xì)胞盤上的總數(shù)，再乘以百分系數(shù)。
此項(xiàng)檢定的條件是這樣確定的，即得到次優(yōu)級粘接的Cell-Tak
粘接劑涂覆板，這樣就可研究對超過純生物粘接劑多酚朊粘接能力的任何聚合物涂層。表1所示為制備各種蛋白質(zhì)所獲得的性能范圍。在本例中所用的聚賴氨酸酪氨酸聚合物是具有分子量為100，000的1∶1線性無規(guī)共聚物。對比例22和23的合成聚合物，其分子量低于純生物粘接劑多酚朊的分子量，此聚合物作為細(xì)胞附著物的媒質(zhì)對應(yīng)地顯示出較低的性能，隨著分子量的增加，附著性能也增加。例3和5的合成接枝共聚物與純的生物粘接劑多酚朊的分子量接近，而粘接劑附著性能看來比低分子量的合成聚合物高很多。例4的合成接枝共聚物的分子量高于純生物粘接劑多酚朊的分子量，而附著性能則近于相等。
在所有劑量中，例3和例5的合成接枝共聚物比純生物粘接劑多酚朊好。
表Ⅰ細(xì)胞附著物與Cell-TAK
粘接劑和合成的類似物的百分比粘接劑BHK-21細(xì)胞類型U-93715微克P3X2525微克Cell-Tak
粘接劑 60 88 55例3788471例4638157例5769457例11437635例18376440對比例22291418對比例23212829聚賴氨酸酪氨酸67/31聚-L-賴氨酸80/59聚烯丙胺//94塑料191714測定哺乳細(xì)胞在純生物粘接劑多酚朊和含肽接枝共聚物存在下的生長速率，以評價(jià)由含肽接枝共聚物所引起的任何可能的不利影響，小倉鼠腎細(xì)胞(BHK)毛坯在BME陽性10%小牛皮血清和10%胰蛋白
磷酸鹽肉湯中生長匯集胰蛋白酶化并在BME中用離心方法洗滌幾次，將懸浮物(5×104細(xì)胞/毫升)接種到未經(jīng)處理的35mm器皿上(對照物)以及帶有Cell-Tak
粘接劑和在10%小牛皮血清的BME中含肽接枝共聚物(5微克/平方厘米)的器皿上。在有5%CO2，37.5℃保溫的過程中的不同時(shí)間點(diǎn)取出三份盤子。所附著的細(xì)胞于是從表面胰蛋白酶化，洗滌后用血球計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。
BHK-21細(xì)胞的生長速率與未涂覆的對照物比較或與純生物粘接劑多酚朊對照比較，不受所有測試的含肽接枝共聚物或純生物粘接劑多酚朊(包括主鏈聚合物聚烯丙胺和聚-L-賴氨酸)的影響，重要的是需注意在任何這些聚合物存在下，生長速率不增大或延遲。
例24本例說明細(xì)胞組織切片在使用本發(fā)明含肽接枝共聚物所制成的載片上的延遲作用。
將嵌入石蠟的肝細(xì)胞組織切片成10毫米，并粘著在玻璃顯微鏡載片上，載片上涂覆Cell-Tak
粘接劑或含肽接枝共聚物，涂覆密度為每載片5微克，制備三個(gè)載片，每個(gè)載片上都含有兩個(gè)不同的切片。
試驗(yàn)用的含肽接枝共聚物是PAA-SA-Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Hyp-Thr-Dopa-Lys-OH，例5的含肽接枝共聚物，和乙酰-Dopa-PAA。這里所用的以及以下例子中所用的乙酰-Dopa-PAA均是按例3中所述的工藝流程進(jìn)行制備的，但下面的除外，將1mm的乙酰-Dopa，而不是1mm的叔丁氧羰基(BOC)-Dopa在四氫呋喃中先用2mm的N-羥基琥珀酰亞胺和1mm的二環(huán)己基碳二亞胺進(jìn)行處理。另外因用了乙酰-Dopa而不是BOC-Dopa，就不必用三氟乙酸來解除阻斷。生成的接枝共聚物分子量為42，000并發(fā)現(xiàn)聚烯丙胺上10%的自由氨基被乙酰-Dopa所?；?。
另外，經(jīng)測試線型聚烯丙胺聚合物(PAA)分子量約為30，000，線型聚-L-賴氨酸聚合物分子量約為100，000。
在45℃暖臺上干燥1小時(shí)后，載片在二甲苯中作兩次5分鐘洗滌，接著在95%乙醇中洗滌3次，在70%乙醇中洗滌一次及一次3分鐘水洗脫去蠟。載片然后再經(jīng)受下述次序的處理切片保留數(shù)處理 PAA 乙酰-Dopa 例5 Cell-Tak
-PAA粘接劑1，100mMPBS，6666PH8，15分鐘2，10mMPBS，PH7，66660.3%H2O2，0.25%三硝基甲苯，x-1002小時(shí)3，流水，15分鐘66664，胰蛋白酶/EDTA6666(0.05%/0.02%)30分，37℃5，胰蛋白酶/EDTA6666(0.05%/0.02%)30分，37℃6，流水，15分鐘66667，0.1%SDS在水中666615.5小時(shí)
8，流水，25分鐘66669，胃蛋白酶(5，000U/ml)656620分，37℃10，流水浴，15分鐘6366PAA和例5中的含肽接枝共聚物以及Cell-Tak
粘接劑同樣完成所有這些處理。處理9和10后，切片從乙酰-Dopa-PAA接枝共聚物上脫落，用聚-L-賴氨酸固定的切片在處理7或在此之前就全部脫落。
例25本例說明本發(fā)明含肽接枝共聚物在鋁上的粘接性能。
將表Ⅱ中所設(shè)定的含肽接枝共聚物的控制量和純生物粘接劑多酚朊應(yīng)用到鋁箔帶上來測試其粘接強(qiáng)度。用乙醇將1.3厘米×4厘米的帶清洗干凈并干燥，將固定量的含水聚合物輸送到一個(gè)帶子的末端，迅速地將第二條帶子壓上1.3厘米。每個(gè)粘接區(qū)域內(nèi)聚合物的總量在4和20微克之間變化，送至4微升的蒸餾水中，允許粘接劑固化1小時(shí)，將樣條夾在壓力表(0-500或0-5000克范圍)和齒輪電動(dòng)機(jī)之間，用一氣缸產(chǎn)生25克/秒的變形，以此來測量粘接強(qiáng)度，所有步驟均在室溫下進(jìn)行。數(shù)據(jù)為每組5個(gè)試樣的平均值，并以克/平方厘米/微克來表示。
表Ⅱ聚合物箔粘接的剪切強(qiáng)度試驗(yàn)克/平方厘米/微克蛋白質(zhì)純生物粘接劑多酚朊73聚烯丙胺74聚-L-賴氨酸62聚-L-賴氨酸酪氨酸0例384例452例569例731例1142例1265例13130例1476對比例1965對比例2021對比例210對比例2220對比例230乙酰-Dopa-PAA0PAA-LopoDopa，oHypro48純生物粘接劑多酚朊在每平方厘米/微克蛋白質(zhì)73克剪切強(qiáng)度下，顯示出最高粘接強(qiáng)度6.4和9.6微克，以每微克聚合物為基準(zhǔn)，許多含肽接枝共聚物和線型聚烯丙胺聚合物(PAA)接近或超過純生物粘接劑多酚朊所顯示的強(qiáng)度。
例26此例論證了本發(fā)明含肽接枝共聚物在含水環(huán)境中的應(yīng)用。
對純生物粘接劑蛋白質(zhì)和各種分子量的含肽接枝共聚物測定其水相容粘接特性。使用酶催化的或化學(xué)的分子間交聯(lián)劑以增加組分的分子量，因而也提高了內(nèi)聚粘合強(qiáng)度。Hypan
聚丙烯腈(Kingston Technologies.Inc)是一種至少含有80%水的水凝膠，將其用作要粘合的基質(zhì)，Hypan
-Hypan
水凝膠粘合體是通過測試其對酸浴(0.5M Hcl)的抗酸力來表示每種帶有或不帶有交聯(lián)劑的聚合物的粘接特性。Hypan
水凝膠用不帶交聯(lián)劑的純生物粘接劑多酚朊粘合的帶子在水中兩小時(shí)之內(nèi)就會分離，但在酸中不到1分鐘就會分離。帶有交聯(lián)劑的純生物粘接劑多酚朊在水中或酸中至少一個(gè)星期仍保持完整。
將Hypan
水凝膠切成1×2厘米的長片，使用前在磷酸鹽緩沖鹽水PH7.0(PBS)中浸濕。應(yīng)用各種濃度的純生物粘接劑多酚朊或含肽共聚物，范圍從1至15微克/平方厘米。用純生物粘接劑多酚朊和高分子量含肽接枝共聚物，只要較低的濃度就足以形成充分的粘合。每微克粘接劑使用5.5至11單位的
狀酪氨酸酶。使用的化學(xué)交聯(lián)劑是以共價(jià)方式將兩個(gè)自由胺粘合。選擇雙(硫代琥珀酰亞胺基)辛二酸(BS-3)和3，3-二硫代雙(硫代琥珀酰亞胺基丙酸)(DTSSP)是因?yàn)樗鼈兊乃芙舛群驮谏鞵H值的官能度。
將粘接劑和或交聯(lián)劑或緩沖劑直接放到一片Hypan
水凝膠上，混合后分布在1平方厘米的區(qū)域。將第二長片直接迅速放在已處理過的長片頂上。允許交疊的長片保溫30秒然后放入300微升0.5N鹽酸的Coor器皿中。其結(jié)果在表Ⅲ中總結(jié)。
用
狀酪氨酸酶進(jìn)行酶催化交聯(lián)的結(jié)果是所有粘合Hypan
水凝膠的測試聚合物都很好。當(dāng)交聯(lián)純生物粘接劑多酚朊時(shí)，要交聯(lián)的同型物都合并在酸中。對主鏈的測試，聚賴氨酸酪氨酸和聚烯丙胺粘合良好，但二者在酸中的交聯(lián)狀態(tài)是分離的。聚-L-賴氨酸在哪種狀態(tài)都不粘合。
化學(xué)交聯(lián)劑如BS3和DTSSP在粘合所有測試的同型物都是成功的，只有少數(shù)例外，可用于這些交聯(lián)劑的自由胺對已加載的(質(zhì)子化的)胺(此胺可與帶負(fù)電荷的水凝膠進(jìn)行離子化粘合)對此系統(tǒng)及任何含肽化合物可認(rèn)為是關(guān)鍵性的。該比例是PH的函數(shù)。
最意想不到的是，例15的高分子量聚合物提供耐酸粘合卻不加交聯(lián)劑。375K的分子量顯然足以提供耐酸粘合強(qiáng)度。
對比例20至22合成的低分子量肽和聚合物加不加交聯(lián)劑都不能粘合。
表Ⅲ凝膠粘合試驗(yàn)?zāi)退嵴澈暇酆衔?
狀酪氨酸酶 BS3 DTSSP純生物粘接劑多酚朊+++++++++聚烯丙胺-++++++聚-L-賴氨酸-+++-
線型共聚物---例3++++++++例4++++++例5+++++++++例7+++++++++例11--例12+非水溶性例13+++++++例14++++++++例15++++++例18++++對比例19-+++++對比例20-+++對比例21--對比例22-對比例23---乙酰-Dopa-PAA++++++-PAA-Lop，(ODopa，++++++OHypro)例27一個(gè)眼睛的模型系統(tǒng)用來證明使用本發(fā)明的含肽接枝共聚物來密封小的和大的細(xì)胞組織孔眼的可行性。用手術(shù)刀從15-20毫米直徑的角膜部位取下整個(gè)牛眼睛的上皮細(xì)胞手術(shù)刀劃破擦傷角膜的中心制出一個(gè)孔眼將附加在10m，鹽水注射器上的18－計(jì)針插。
前眼房通過角膜的穿刺術(shù)確定是否有漏出物。然后用去離子水沖洗擦傷部位并抹去過量的水。再將純生物粘接劑多酚蛋白質(zhì)和含肽接枝共聚物(50ug/cm2)立即施加到孔眼部位的外圍。將一塊水凝膠治療接觸透鏡(Hypan
hydrogel，Kingston Technologies，Inc.)在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中預(yù)浸30分鐘，然后將其鋪在受傷部位，輕壓透鏡一角膜界面確保補(bǔ)片直接對合到細(xì)胞組織上。在固化過程中將一個(gè)充水滲析袋施加到粘合劑上20分鐘。粘合劑的強(qiáng)度用附加在針頭上的測壓計(jì)測量，此針頭預(yù)先插入前眼房。
拿開滲析袋，眼壓約為120
/分鐘，用注射器連接到測壓計(jì)上，監(jiān)控漏出物和壓力。所記錄的水壓是第一次漏出物標(biāo)記所達(dá)到的讀數(shù)。此壓力值除以0.535換算為mmHg。數(shù)據(jù)至少是兩個(gè)試樣的平均值。表Ⅳ中耐壓37至75mmHg的粘合劑標(biāo)一個(gè)單+，失效前達(dá)到75或更高mmHg的標(biāo)++。
表ⅣHypan粘合到眼睛上的能力聚合物COXBS3純生物粘接劑多酚朊++++聚烯丙胺--聚-L-賴氨酸-聚-L-賴氨酸酪氨酸-線型共聚物例3++例4-例5-++例7--例11++例12-例13++例14++例15++對比例19--對比例20-+對比例21-對比例22-對比例23乙酰-Dopa-PAA+PAA-10，(O，Dopa，OHypro)-試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了使用本系統(tǒng)的含肽接枝共聚物密封大的和小的細(xì)胞組織孔眼的可行性?？墒?，僅聚合物主鏈組分，以及對比例19-23的聚合物至少在37mmHg壓力下不顯示粘合力。
例28此例論證了用本發(fā)明的含肽接枝共聚物作為皮膚移植的應(yīng)用。使用豬表皮來評價(jià)粘合力。
將冷凍的脫脂豬表皮切成2厘米的長條，蓋上濕紗布進(jìn)行冷凍以便在完全融化時(shí)出現(xiàn)水合作用。大約2小時(shí)后將豬皮條用乙醇擦洗，然后用紗布弄干。
粘合劑配方含有14微升的例5含肽接枝共聚物(5毫克/毫升在水中);4微升的0.05M PO4緩沖劑(PH＝7)以及2微升的30mM(17.18毫克/毫升)雙(硫代琥珀酰亞胺基)辛二酸(BS3)的水溶液。將要進(jìn)行測試的粘合劑成份在一個(gè)干凈的聚苯乙烯盤中按上述順序進(jìn)行混合。
將14微升的粘接劑組份施加到一塊豬皮條的粘接部位(1平方厘米)。在粘接部位再蓋上第二塊豬皮條，它上面再放上一個(gè)295克重量的塑料盤壓10分鐘，然后垂直掛起粘接的細(xì)胞組織在底部施以重力直至粘接部位斷裂，由此測試粘接劑的剪切強(qiáng)度。
本發(fā)明例5的含肽接枝共聚物，所產(chǎn)生的平均剪切強(qiáng)度為93克/平方厘米。
例29在本例中使用牛角膜來證實(shí)本發(fā)明的含肽接枝共聚物與交聯(lián)劑和緩沖劑配合在一起對粘接角膜細(xì)胞組織是一個(gè)有效的配方。從已形成晶核的眼內(nèi)刮掉牛角膜(包括整個(gè)上皮和內(nèi)皮)并切成兩個(gè)2×1平方厘米的片，將牛角膜片用100微升的磷酸鹽緩沖鹽水溶液沖洗并馬上干燥，先進(jìn)行以下的粘接(1平方厘米面積)測試。
在一分開的干凈表面，將在PO4緩沖劑或水中的8微升例5含肽接枝共聚物與5微升的0.025M PO4緩沖劑以及1.16微升雙硫代琥珀酰亞胺基)辛二酸(BS3)在水中以濃度為15mM進(jìn)行混合。應(yīng)當(dāng)注意，如果以水作溶劑，含肽接枝共聚物的穩(wěn)定性較高，而且如果該溶液計(jì)劃有貯一星期以上時(shí)則必使用。在每個(gè)試驗(yàn)中，將8微升的配方組成施加到眼睛上0.64平方厘米的面積，然后將第二塊牛角膜長條慢慢放置在第一塊上，僅覆蓋同樣的0.64平方厘米面積。
用大約含15毫升水的小水袋對粘接處向下加負(fù)荷，允許持續(xù)20分鐘，然后測試粘接處的剪切強(qiáng)度。
將粘接的角膜條的一端夾在環(huán)形架上，另一端夾一個(gè)水袋，然后以200毫升/分鐘的恒定速率向袋內(nèi)注入水直至粘接部位出現(xiàn)分離為止。測定水的重量，之后轉(zhuǎn)換為剪切強(qiáng)度單位，結(jié)果列于表Ⅴ中。
表Ⅴ用于粘接劑的溶劑水的重量(克)剪切強(qiáng)度(克/平方厘米)水5890水42660.025MPO4210 3280.025MPO4160 250試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)上述濃度的含有肽接枝共聚物和交聯(lián)劑的配方在軟組織細(xì)胞上所形成的粘接至少表現(xiàn)出66克/平方厘米的剪切強(qiáng)度。由于組織細(xì)胞不是均勻的，因此所獲得的數(shù)值不能再現(xiàn)確切數(shù)字，但其結(jié)果就產(chǎn)生的粘接這一事實(shí)是一致的。
權(quán)利要求
1.一種水溶性陽離子含肽接枝共聚物，其分子量表現(xiàn)為從大約30，000至大約500，000，此共聚物包括(a)一個(gè)聚合物主鏈，含有或可經(jīng)改性而包括有自由的伯或仲胺功能團(tuán)以便與氨基酸或肽接枝物反應(yīng)，所說的聚合物主鏈呈現(xiàn)從大約10，000至大約250，000的分子量；和(b)與所說聚合物主鏈的至少5%至大約100%的所說伯或仲胺功能團(tuán)進(jìn)行反應(yīng)的一個(gè)氨基酸或肽接枝物，其中所說的氨基酸或肽接枝物包括至少一個(gè)3，4-二羥苯丙氨酸(Dopa)氨基酸或其一個(gè)能羥基化成Dopa形式的前體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的含肽接枝共聚物，其中所說共聚物分子量范圍從約50，000至約350，000。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的含肽接枝共聚物，其中所說共聚物分子量范圍從約70，000至約350，000。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的含肽接枝共聚物，其中所說共聚物分子量約為100，000。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的含肽接枝共聚物，其中含有自由伯或仲胺官能單元的聚合物主鏈表現(xiàn)至少約為8的PK值。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的含肽接枝共聚物，其中含有自由伯或仲胺官能單元的聚合物主鏈表現(xiàn)的PK值從約8.5至約10。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的含肽接枝共聚物，其中所說的主鏈包括含有自由伯或仲胺官能團(tuán)的單體單元，胺基存在的數(shù)量至少大約1-25毫摩爾自由胺基/克聚合物(含有所說的胺基以便與所說的氨基酸或肽接枝物反應(yīng))。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的含肽接枝共聚物，其中所說的主鏈呈現(xiàn)的分子量從大約10，000至大約250，000。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的含肽接枝共聚物，其中所說的聚合物主鏈選自含有由聚賴氨酸，聚丙烯胺，聚氮丙啶，脫乙酰殼多糖，聚乙烯胺，硫酸軟骨素，聚右旋糖酐，透明質(zhì)酸，聚丙烯酸組成的組和其共聚物。
10.根據(jù)權(quán)利要求1的含肽接枝共聚物，其中所說的聚合物主鏈?zhǔn)蔷圪嚢彼帷?br> 11.根據(jù)權(quán)利要求1的含肽接枝共聚物，其中所說的聚合物主鏈?zhǔn)蔷巯┍贰?br> 12.根據(jù)權(quán)利要求10的含肽接枝共聚物，其中至少大約5%至大約30%的所說自由伯或仲游離胺基與所說的氨基酸或肽接枝物反應(yīng)。
13.根據(jù)權(quán)利要求10的含肽接枝共聚物，其中大約10%至大約20%的所說自由伯或仲胺基與所說的氨基酸或肽接枝物反應(yīng)。
14.根據(jù)權(quán)利要求11的含肽接枝共聚物，其中至少大約5%至大約30%的所說自由伯或仲游離胺基與所說的氨基酸或肽接枝物反應(yīng)。
15.根據(jù)權(quán)利要求11的含肽接枝共聚物，其中大約10%至大約20%的所說自由伯或仲胺基與所說的氨基酸或肽接枝物反應(yīng)。
16.根據(jù)權(quán)利要求1的含肽接枝共聚物，其中所說的氨基酸或肽接枝物含有3，4-二羥苯丙氨酸(Dopa)氨基酸。
17.根據(jù)權(quán)利要求1的含肽接枝共聚物，其中所說的氨基酸或肽接枝物含有能羥基化為Dopa形式的3，4-二羥苯丙氨酸前體。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的含肽接枝共聚物，其中所說的前體選自由酪氨酸和苯丙氨酸組成的組。
19.根據(jù)權(quán)利要求1的含肽接枝共聚物，其中所說的氨基酸或肽接枝物選自由Dopa，Dopa-Lys-Ala-Lys，Hyp-Hyp-Thr-Depa-Lys，Ala-Lys-Pro-Ser-Dopa，Dopa-Hyp-Hyp-Thr，Hyp-Thr-Dopa-Lys，Dopa-Hyp-Lys-Ser，Dopa-Lys-Ala-Lys-Hyp-Ser-Tyr，Dopa-Lys-Ala-Lys-Hyp-Ser-Tyr-Hyp-Hyp-Thr，Lys-Hyp-Ser-Dopa-Hyp-Hyp-Thr-Dopa-Lys，Dopa-Lys-Glu-Ser-Hyp，Dopa-Lys-Cys(SO3H)-Lys，Cys(SO3)-Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Hyp-Thr-Dopa-Lys，和Lys-Dopa-Thr-Hyp-Hyp-Tyr-Ser-Pro-Lys-Ala，Hyp-Hyp-Thr-Tyr-Lys，Ala-Lys-Pro-Ser-Typ，Phe-Tyr-Lys-Ser，以及Hyp-Hyp-Thr-Phe-Lys組成的組。
20.根據(jù)權(quán)利要求1的含肽接枝共聚物，其中所說的聚合物主鏈?zhǔn)蔷圪嚢彼?，而所說的氨基酸或肽接枝物選自由Lys-Dopa-Thr-Hyp-Hyp-Tyr-Ser-Pro-Lys-Ala，Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Hyp-Thr-Dopa-Lys，Lys-Hyp-Ser-Dopa-Hyp-Hyp-Thr-Dopa-Lys，Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Thr-Dopa-Lys，Dopa-Lys-Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr，Dopa-Lys-Ala-Lys-Ala-Lys-Hyp-Ser-Dopa-Hyp-Hyp-Thr和Dopa組成的組。
21.根據(jù)權(quán)利要求1的含肽接枝共聚物，其中所說的聚合物主鏈?zhǔn)蔷巯┍?，而所說的氨基酸或肽接枝物選自由Dopa，Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Hyp-Thr-Dopa-Lys，Cys-Pro-Ser-Thr-Pro-Pro-Thr-Thr-Lys，Hyp-Thr-Dopa-Lys，Dopa-Lys-Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr，和Dopa-Lys-Ala-Lys-Hyp-Ser-Dopa-Hyp-Hyp-Thr組成的組。
22.根據(jù)權(quán)利要求1的含肽接枝共聚物，其中所說的聚合物主鏈?zhǔn)蔷巯┍罚f的氨基酸或肽接枝物是Dopa。
23.根據(jù)權(quán)利要求1的含肽接枝共聚物，其中所說的聚合物主鏈?zhǔn)蔷巯┍?，而所說的氨基酸或肽接枝物是SA-Lys-Pro-Tyr-Hyp-Hyp-Thr-Dopa-Lys-OH。
24.一種水溶性陽離子含肽接枝共聚物，其分子量表現(xiàn)為從大約30，000至大約500，000，該聚合物包括(a)一個(gè)含有單體重復(fù)單元的聚合物主鏈，每個(gè)所說的單體重復(fù)單元包括或能經(jīng)改性后包括自由的伯或仲胺官能單元以便與氨基酸或肽接枝物反應(yīng)，所說的聚合物主鏈所顯示的分子量從約10，000至約250，000;和(b)一個(gè)與所說聚合物主鏈至少5%所說伯或仲胺官能單元進(jìn)行反應(yīng)的氨基酸或肽接枝物，其中所說的氨基酸或肽接枝物包括至少一個(gè)3，4-二羥苯丙氨酸(Dopa)氨基酸或能羥基化成Dopa形式的前體。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的一種水溶性陽離子含肽接枝共聚物，其中所說的單體重復(fù)單元選自由賴氨酸和烯丙胺組成的組。
26.根據(jù)權(quán)利要求24的一種水溶性陽離子含肽接枝共聚物，其中自由伯或仲胺官能單元存在的數(shù)量至少大約為1-25毫摩爾胺/克聚合物，以便與所說的氨基酸或肽接枝物反應(yīng)。
全文摘要
一種分子量從大約30,000至大約500,000的水溶性陽離子含肽接枝共聚物，它包括(a)一個(gè)聚合物主鏈和(b)一個(gè)與聚合物主鏈至少大約5％至大約100％的伯或仲胺功能團(tuán)進(jìn)行反應(yīng)的氨基酸或肽接枝物。本發(fā)明的含肽接枝共聚物可以在(a)分子量，陽離子度，接枝到聚合物主鏈上的氨基酸或肽單元的取代百分比及(b)含肽接枝共聚物自身的化學(xué)和物理結(jié)構(gòu)中變化，由此能夠?qū)ｉT制造出本發(fā)明的聚合物可用于特殊目的的最終應(yīng)用。
文檔編號C08G69/08GK1042162SQ8910758
公開日1990年5月16日 申請日期1989年8月21日 優(yōu)先權(quán)日1988年8月22日
發(fā)明者克里斯汀·V·本尼迪克特, 尼希夫·查特韋迪 申請人:生物聚合體有限公司