專利名稱：以玻璃珠為培養(yǎng)基質(zhì)的叢枝菌根真菌的培養(yǎng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及特殊微生物的培養(yǎng)技術(shù)，更具體地說涉及叢枝菌根真菌的培養(yǎng)，以及特定的培養(yǎng)裝置及培養(yǎng)介質(zhì)。
叢枝菌根(AM)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實踐和自然生態(tài)系統(tǒng)中的重要作用已廣為人們所知。近85％的植物種類和幾乎所有的農(nóng)作物能夠形成叢枝菌根。叢枝菌根真菌(AMF)可以通過多種方式或途徑影響植物的生理代謝和生長發(fā)育過程。許多調(diào)查研究表明叢枝菌根對植物的營養(yǎng)狀況(尤其是植物的磷營養(yǎng))、水分的吸收利用、抵抗病原菌侵染、鹽分及重金屬毒害有著顯著的積極的作用。在資源和環(huán)境問題日益嚴峻的背景下，叢枝菌根的應(yīng)用作為一條有效可行的生物學(xué)途徑，能夠發(fā)掘生物的自身潛力，提高作物對自然資源的利用效率，從而降低能耗，減輕環(huán)境所承受的壓力，因而有著廣闊的應(yīng)用前景。對叢枝菌根研究和認識日趨廣泛深入的同時，在應(yīng)用方面，出現(xiàn)了商業(yè)化接種劑。然而，AM真菌是嚴格專性共生生物，脫離了宿主植物即無法正常生長發(fā)育，完成生命過程。雖然研究者們試圖探明宿主植物與菌根真菌之間的信息和物質(zhì)交換過程，但至今不能獲取足夠的數(shù)據(jù)以支撐建立AM真菌的離體培養(yǎng)，這無疑成為相關(guān)研究以及叢枝菌根廣泛應(yīng)用的主要障礙。
無論出于科學(xué)還是經(jīng)濟的考慮，獲得AM真菌材料都有著極其重要的意義。對叢枝菌根進行遺傳學(xué)和生物學(xué)的研究有賴于獲得純凈真菌組織，而生產(chǎn)商業(yè)化的接種劑需要高密度和純度的真菌繁殖體。顯然，現(xiàn)有條件下只能建立共生條件下的AM真菌培養(yǎng)。通常應(yīng)用的培養(yǎng)方法包括土培、無土基質(zhì)培養(yǎng)(如沙培)等，也有稀少的應(yīng)用霧培或營養(yǎng)液培養(yǎng)的報道。雙重?zé)o菌培養(yǎng)技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一種最接近于純培養(yǎng)的AM真菌培養(yǎng)技術(shù)。在這種培養(yǎng)體系中，菌根共生體由Ri T-DNA轉(zhuǎn)基因的宿主植物根器官和菌根真菌在培養(yǎng)基中建立起來，由此叢枝菌根由開放式培養(yǎng)系統(tǒng)轉(zhuǎn)入微生物實驗室的培養(yǎng)皿中，從而盡可能地減免了外源污染。一些商業(yè)行為和科研活動中，各種生長刺激物質(zhì)(如類異黃酮、褐藻酸低聚糖等)被應(yīng)用以促進真菌孢子產(chǎn)生及菌絲體發(fā)育。偶有商家或研究者稱人工混合基質(zhì)中離體真菌孢子和菌絲體的富集培養(yǎng)為純培養(yǎng)(大多應(yīng)用了生長刺激或促進物質(zhì))，但并非科學(xué)上的純培養(yǎng)概念。
基質(zhì)培養(yǎng)(如土培)易于操作，成功率高，所以仍是當前應(yīng)用最為廣泛的AM真菌培養(yǎng)方法，但開放式培養(yǎng)過程中菌種會遭受不同程度的外源污染，經(jīng)過數(shù)代培養(yǎng)菌種往往嚴重蛻化，于是不得不重新純化。如果需要從土壤盆栽宿主植物分離AM真菌，去除孢子表面的污染顯得十分困難，同時也難以獲得足夠量的純凈菌絲體。少見應(yīng)用的無土培養(yǎng)技術(shù)(如霧培、營養(yǎng)液膜培養(yǎng))因為難以維系適宜的生長條件，成功率和培養(yǎng)效率通常不高。利用雙重?zé)o菌培養(yǎng)技術(shù)獲得的真菌孢子很有價值，然而建立此培養(yǎng)體系極其繁瑣，培養(yǎng)條件要求嚴格，非專業(yè)技術(shù)人員難以操作，而且目前只有少數(shù)幾個真菌菌種建立了這種培養(yǎng)。
無可否認，通過基質(zhì)培養(yǎng)途徑提供菌劑是簡便可行的，但為了某些特殊目的需要獲得大量純凈真菌材料，如科學(xué)研究的需要以及生產(chǎn)高純度的商業(yè)化菌劑，通常的培養(yǎng)方法便顯出無以克服的局限性，普遍的困難是無法簡單有效地將宿主植物根系和培養(yǎng)基質(zhì)與真菌分離。對于無土培養(yǎng)，即便不考慮其它局限性，也面臨著同樣的問題。針對這些困難，我們在此提出一種玻璃珠分室培養(yǎng)技術(shù)以彌補現(xiàn)有AM真菌培養(yǎng)技術(shù)的不足。
本發(fā)明的目的之一是提供一種新的從枝菌根(AM)真菌的培養(yǎng)方法，該方法應(yīng)用特殊培養(yǎng)裝置和培養(yǎng)介質(zhì)，區(qū)隔真菌和宿主植物的生長空間，有效免除植物生長基質(zhì)及外物對真菌的可能污染。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下1.培養(yǎng)裝置采用硬質(zhì)塑料板(或有機玻璃板、PVC板等)與特殊孔徑的尼龍網(wǎng)加工成三分室的培養(yǎng)容器(附


圖1)。三個分室中，中間的分室為區(qū)隔宿主植物與真菌生長空間的隔離分室。區(qū)隔分室與植物生長室之間以1mm孔徑的尼龍網(wǎng)分隔，與真菌生長室之間以30μm尼龍網(wǎng)分隔。根系可以穿過1mm尼龍網(wǎng)生長到區(qū)隔分室中，但30μm尼龍網(wǎng)只允許根外菌絲通過而阻止了根系的伸展，所以只有菌根真菌能夠在玻璃珠分室中生長。區(qū)隔分室中填充粗河砂可以有效防止植物生長室中土壤顆粒對真菌的污染，而真菌生長室中的玻璃珠因具有表面光滑、比重相對較重的特性而易于和真菌組織分離。區(qū)隔分室和真菌生長室蓋上尺寸合適的深色PVC板蓋子以避免外源污染(如藻類生長)。
2.培養(yǎng)程序
(1)基本材料準備A、宿主植物(如玉米、三葉草等)種子；菌根接種劑為含有真菌孢子和菌絲體的菌土，或其它類型菌劑)；B、3～4mm厚的有機玻璃板或PVC板；網(wǎng)孔分別為1mm和30μm的尼龍網(wǎng)；C、低養(yǎng)分含量的沙土與沙子；粗河砂(粒徑1～3mm)；玻璃珠(粒徑0.8～1.2mm)。
植物種子需經(jīng)表面消毒，所有培養(yǎng)基質(zhì)均需滅菌處理(如高壓蒸汽滅菌)。
(2)培養(yǎng)系統(tǒng)的建立如前所述，培養(yǎng)容器由塑料板或有機玻璃板和尼龍網(wǎng)加工而成。分別將粗河砂和玻璃珠裝入?yún)^(qū)隔分室和真菌生長室，菌根接種劑(接種劑量一般為生長基質(zhì)總量的5％)與沙土混勻裝入植物生長室，而后自區(qū)隔室澆水(使植物生長室中重量含水量在15％左右)，待水分滲透均勻后播種。
A、培養(yǎng)基質(zhì)前述特定粒徑的玻璃珠(0.8～2.0mm)和河砂(1～3mm)；B、培養(yǎng)裝置三室培養(yǎng)系統(tǒng)，或者為提高培養(yǎng)效率在植物生長室另一側(cè)增加一個區(qū)隔室和真菌生長室，或在真菌生長室另一側(cè)增加一個區(qū)隔室和植物生長室而構(gòu)成五室培養(yǎng)系統(tǒng)；特定網(wǎng)孔(1mm和30μm)的尼龍網(wǎng)；C、真菌菌種Glomus mosseae、Glomus versiforme、Glomus
intraridices、Sclerocystis sinuosa、Gigarspora margarita等。
(3)培養(yǎng)過程在能夠控制溫度和光照的培養(yǎng)室中進行培養(yǎng)。水分管理注意只能從區(qū)隔室澆水，以防止土壤顆粒被沖入中間分室污染真菌。平時用蓋子蓋住區(qū)隔室和真菌生長室以防止水分過度蒸發(fā)及藻類生長。當植物出現(xiàn)缺素癥狀時，向菌根室澆入1/4 Hoagland營養(yǎng)液(Hoagland& Snyder，1938，其中P濃度降低至1/10)。培養(yǎng)過程中可隨時用小茶匙自真菌生長室取樣，觀測是否有菌絲及孢子產(chǎn)生。
收獲一般培養(yǎng)周期為8周左右。最后收獲時，用茶匙將真菌生長室內(nèi)的真菌連同玻璃珠轉(zhuǎn)移到380μm篩上，用蒸餾水小心沖洗，通過30μm篩回收菌體。也可以將真菌連同玻璃珠緩緩傾入盛有蒸餾水的塑料杯中，玻璃珠很快沉入杯底，而菌絲體及孢子浮留于水面，通過30μm篩可回收菌物。
我們由宿主植物三葉草、玉米和AM真菌菌種Glomus mosseae、Glomus versiforme、Glomus intraridices、Sclerocystis sinuosa、Gigarspora margarita等在玻璃珠分室培養(yǎng)系統(tǒng)中成功建立了菌根共生培養(yǎng)，并獲得了相應(yīng)純凈真菌。對于產(chǎn)孢能力強的真菌菌種Glomusversiforme來說，由體積為(10×15×(3+4+5))cm3的培養(yǎng)容器可獲得多至20毫克干重的菌體，每盆獲取孢子數(shù)量可以萬計。
玻璃珠分室培養(yǎng)將AM真菌的傳統(tǒng)基質(zhì)培養(yǎng)與無土培養(yǎng)完好結(jié)合起來，簡便易行，培養(yǎng)效率卻大大提高。這種培養(yǎng)系統(tǒng)最顯著的優(yōu)點是真菌易于和培養(yǎng)基質(zhì)分離。利用這種培養(yǎng)技術(shù)可以培養(yǎng)出大量保持自然菌落的AM真菌，同時免除其它外源污染，無論對于科學(xué)研究或是生產(chǎn)應(yīng)用都具有不可替代的功用，尤其為制備叢枝菌根生物學(xué)研究所需的大量純凈真菌材料，及生產(chǎn)高純度菌劑或高效的微生物肥料應(yīng)用于集約化農(nóng)業(yè)，提供了一條簡便易行的途徑。
附圖的簡要說明附
圖1為玻璃珠分室培養(yǎng)系統(tǒng)示意圖。植物生長室裝入砂土和細砂的混合物，區(qū)隔室裝入河砂，真菌生長室裝玻璃珠。根系可穿過尼龍網(wǎng)A在菌根室中生長，而只有菌絲可暢通無阻地穿過尼龍網(wǎng)B進入真菌生長室。經(jīng)過一定培養(yǎng)時期，自真菌生長室即可觀測、收集到真菌組織。
附圖2自真菌生長室分離得到的Glomus versiforme孢子和菌絲體。
實施例真菌菌種為Glomus mosseae(Nicol. & Gerd)Gerdmann & Trappe和Glomus versiforme(Karsten)Berch，以含有寄主植物根段、菌根真菌孢子及根外菌絲的真菌菌種的根際土為接種劑。采用玉米(Zeamays，農(nóng)大108)為宿主植物進行擴繁。播種前用10％H2O2對種子進行表面消毒并于室溫下催芽。
低養(yǎng)分含量的砂土(采自北京大興龐各莊鄉(xiāng)，基本理化性狀pH(CaCl2)，7.8；有機質(zhì)含量，0.39％；全氮，0.027％；速效磷(Olsen-P)，3.9mg/kg；速效鉀(NH4OAc-K)，60.4mg/kg)、細砂(過1mm篩)、河砂(粒徑1～3mm)和玻璃珠(粒徑0.8～1.2mm)。所有培養(yǎng)基質(zhì)在裝盆前均經(jīng)高壓蒸汽滅菌處理(120℃，2小時)。
采用有機玻璃板加工成的分室培養(yǎng)系統(tǒng)，尺寸為(10×15×(3+4+5))cm3。區(qū)隔室裝入850g河砂，真菌生長室裝入960g玻璃珠。播種前將菌根接種劑(接種劑量20克)與沙土混勻裝入植物生長菌根室，而后自區(qū)隔室澆水(100ml)，待水分滲透均勻后播種。每盆播種5粒，出苗后間留4株。
培養(yǎng)進行8周時，在真菌生長室觀測到大量Glomus versiforme孢子及菌絲(見附圖2)，同時也觀察到Glomus mosseae少量孢子果和菌絲體的形成。Glomus versiforme可回收真菌孢子和菌絲體的量可達20mg干物重，Glomus mosseae可達10mg。
權(quán)利要求
1.叢枝菌根真菌的培養(yǎng)方法。該方法使用由區(qū)隔分室，真菌生長室，植物生長室組成的三分室培養(yǎng)容器；該方法包括將接種劑裝入培養(yǎng)容器的植物生長室，而后自區(qū)隔室澆水，將宿主植物種子播種，培養(yǎng)，回收真菌孢子和菌絲體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述接種劑為含有叢枝菌根真菌孢子、菌絲體的菌土。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述培養(yǎng)容器為采用應(yīng)硬質(zhì)塑料板與尼龍網(wǎng)(孔徑1毫米和30微米)加工而成的三分室培養(yǎng)容器。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述的培養(yǎng)容器還包括為在植物生長室另一側(cè)增加一個區(qū)隔室和真菌生長室，或在真菌生長室另一側(cè)增加一個區(qū)隔室和植物生長室而構(gòu)成五室培養(yǎng)系統(tǒng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中區(qū)隔分室和真菌生長室分別裝有粗河砂和玻璃珠。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中接種劑與砂土混勻裝入培養(yǎng)容器的真菌生長室。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中培養(yǎng)周期為8周。
8.權(quán)利要求1的培養(yǎng)方法中所用的培養(yǎng)容器。
全文摘要
本發(fā)明公開了叢枝菌根真菌的培養(yǎng)方法,該方法使用了特定的培養(yǎng)裝置及培養(yǎng)介質(zhì)。該培養(yǎng)裝置為由區(qū)隔分室,真菌生長室,植物生長室組成的三分室培養(yǎng)容器,區(qū)隔分室和真菌生長室分別裝有粗河砂和玻璃珠,該方法包括將菌根真菌接種劑與砂土混勻裝入培養(yǎng)容器的植物生長室,而后自區(qū)隔室澆水,將宿主植物種子播種,培養(yǎng),回收真菌孢子和菌絲體。
文檔編號A01N63/04GK1354252SQ00132468
公開日2002年6月19日 申請日期2000年11月21日 優(yōu)先權(quán)日2000年11月21日
發(fā)明者李曉林, 陳保東 申請人:李曉林, 陳保東