專(zhuān)利名稱(chēng)：一種通過(guò)用種間核轉(zhuǎn)移技術(shù)生產(chǎn)克隆虎的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的
背景技術(shù)：
30年來(lái)，已知只可能在兩棲動(dòng)物中克隆受精卵，但目前已成功地在小鼠中通過(guò)置換單細(xì)胞受精卵的前核產(chǎn)生出克隆的子代(見(jiàn)McGrath和Solter，科學(xué)，220:1300-1302,1983)。雖然在克隆動(dòng)物上有了這個(gè)首例成功，動(dòng)物工業(yè)上的同樣成功(見(jiàn)Wakayama等，自然，394:369-374,1998)卻報(bào)告得相當(dāng)晚，因?yàn)橛?-細(xì)胞期后的成熟卵母細(xì)胞和受精卵裂球產(chǎn)生克隆小鼠有幾個(gè)問(wèn)題，例如重編程序的減少等。
有關(guān)通過(guò)核轉(zhuǎn)移生產(chǎn)克隆牲畜，首例報(bào)告是通過(guò)用8-到16-細(xì)胞受精卵的裂球作供體細(xì)胞產(chǎn)生綿羊的子代(見(jiàn)Wiladsen，自然，320:63-65,1986)。此后，據(jù)認(rèn)為通過(guò)核轉(zhuǎn)移只能克隆具有全能性的受精卵裂球，籍此，細(xì)胞可分化成每一個(gè)單細(xì)胞。然而，經(jīng)過(guò)持續(xù)的研究工作，首例克隆綿羊是通過(guò)導(dǎo)入體細(xì)胞核產(chǎn)生的(見(jiàn)Wilmut等，自然，385:810-813,1997)，從而糾正了在先的發(fā)育理論，并使得在生產(chǎn)克隆牛(見(jiàn)Well等，Reprod.Fertil.And Develop.,10:369-378,1998)和豬方面出現(xiàn)了成功例的報(bào)告。
通過(guò)發(fā)掘利用現(xiàn)有野生動(dòng)物的體細(xì)胞產(chǎn)生胚胎和產(chǎn)生胚胎的技術(shù)，被人們認(rèn)為對(duì)于永久地保存稀有瀕危物種的遺傳特征方面是很有價(jià)值的。但是，還沒(méi)有成功地克隆現(xiàn)有野生動(dòng)物的報(bào)告。人們發(fā)現(xiàn)，在克隆這些野生動(dòng)物時(shí)，如果克隆的動(dòng)物是稀有的并且是受保護(hù)的就難于得到受體卵母細(xì)胞。因此其克隆動(dòng)物就通過(guò)應(yīng)用種間核轉(zhuǎn)移的技術(shù)產(chǎn)生，并且卵母細(xì)胞從緊密相關(guān)的物種得到。這種種間核轉(zhuǎn)移的技術(shù)在先已經(jīng)有公開(kāi)(見(jiàn)Domink等，Bio1.Repro.,60(6):1496-1502(1999)。但是，該文針對(duì)的是應(yīng)用已經(jīng)進(jìn)行了許多研究工作的牲畜，所以還是使之難于把此技術(shù)應(yīng)用到生產(chǎn)野生動(dòng)物上。
在此情況下，有強(qiáng)烈的理由，探索和開(kāi)發(fā)一種改進(jìn)的方法，通過(guò)種間核轉(zhuǎn)移和野生動(dòng)物的體細(xì)胞產(chǎn)生克隆的野生動(dòng)物。
因此本發(fā)明的首要目的是提供一種通過(guò)種間核轉(zhuǎn)移技術(shù)生產(chǎn)克隆虎的方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是通過(guò)所述方法提供克隆虎胚胎。
本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供通過(guò)所述方法生產(chǎn)的由體細(xì)胞衍生的克隆虎。
圖2是一張照片，表示用一根持定(細(xì)玻璃)管和一根切割(細(xì)玻璃)管切割受體卵母細(xì)胞透明帶的過(guò)程。
圖3是一張照片，表示通過(guò)從受體卵母細(xì)胞取走第一極體和胞核進(jìn)行去核的過(guò)程。
圖4是一張照片，表示用一根持定管和一根注射管把體細(xì)胞移入去核的卵母細(xì)胞的過(guò)程。
本發(fā)明的詳細(xì)描述本發(fā)明生產(chǎn)克隆虎的方法包含以下步驟制備從虎身上采集的供體體細(xì)胞系；體外將從?；蛘哓埪殉膊杉穆涯讣?xì)胞培育成熟；去掉卵母細(xì)胞周?chē)那鸺?xì)胞，切割成熟的卵母細(xì)胞透明帶的一部分并且擠出部分包括第一極體的胞質(zhì)，以得到去核受體卵母細(xì)胞；通過(guò)把供體細(xì)胞注射進(jìn)去核卵母細(xì)胞將核移入受體卵母細(xì)胞，然后通過(guò)隨后的電融合和激活電融合后的細(xì)胞得到胚胎；后激活并且體外培養(yǎng)胚胎；然后把培養(yǎng)的胚胎移入代孕母畜以產(chǎn)生克隆虎仔。
本發(fā)明的生產(chǎn)克隆虎的方法進(jìn)一步說(shuō)明如下。步驟1制備供體細(xì)胞把從虎身上采集的體細(xì)胞系制備成供體細(xì)胞盡管沒(méi)有限制從虎上采集什么細(xì)胞作供體細(xì)胞，但優(yōu)選的細(xì)胞系包括從子宮沖洗液、子宮內(nèi)膜、輸卵管、耳或者肌肉、丘細(xì)胞或者胎兒成纖維細(xì)胞采集的細(xì)胞，可使用常規(guī)的公知的方法稍加改動(dòng)后制備這些細(xì)胞系(Mather&Barnes，細(xì)胞生物學(xué)方法，第57卷，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)方法，Academic Press,1998)。
例如，通過(guò)在子宮沖洗液中加入含1％青霉素-鏈霉素(Gibco；每毫升10000單位青霉素，每毫升10毫克鏈霉素)磷酸鹽緩沖的鹽水(PBS)然后離心。從子宮沖洗液中采集的細(xì)胞在補(bǔ)充了非必需氨基酸、10％的胎牛血清(FBS)和1％青霉素-鏈霉素的Dulbecco氏改進(jìn)的Eagle氏介質(zhì)(DMEM)中，在39℃、5％的CO2的環(huán)境下培養(yǎng)。
從子宮內(nèi)膜或者輸卵管采集的子宮上皮細(xì)胞用所述的PBS清洗、胰蛋白酶處理、然后在與上述相同的環(huán)境下培養(yǎng)。
對(duì)于丘細(xì)胞，用透明質(zhì)酸酶溶液處理丘細(xì)胞-卵母細(xì)胞復(fù)合體以分離卵母細(xì)胞周?chē)那鸺?xì)胞。將丘細(xì)胞在39℃、5％的CO2的環(huán)境下作胰蛋白酶處理30到60分鐘以后再以上述相似的方式培養(yǎng)。
有關(guān)耳成纖維細(xì)胞和胎虎成纖維細(xì)胞，它們分別從包在軟骨組織上的皮層的內(nèi)側(cè)和胎虎肢和體收集的組織得到在無(wú)菌條件下清洗和破碎這些組織，然后用胰蛋白酶及Ⅱ型膠原蛋白酶在39℃、5％的CO2的環(huán)境下處理。這些細(xì)胞也以類(lèi)似于上述的供體體細(xì)胞系的方式培養(yǎng)。
體細(xì)胞系由傳代培養(yǎng)、血清饑餓培養(yǎng)或者冷凍方法儲(chǔ)存。供體細(xì)胞系的傳代培養(yǎng)定期地通過(guò)在胰蛋白酶處理后用新的培養(yǎng)基代替舊的培養(yǎng)基進(jìn)行。血清饑餓培養(yǎng)通過(guò)施用補(bǔ)充0.5％FBS的DMEM以Wilmut等的方法進(jìn)行(見(jiàn)Wilmut等，自然，385:810-813.1997)。這樣儲(chǔ)存的細(xì)胞系在后面的步驟中用作供體細(xì)胞。步驟2制備受體卵母細(xì)胞在體外將從?；蜇埖穆殉膊杉牟怀墒斓穆涯讣?xì)胞培育成熟從含有10mM N-羥乙基哌嗪-N＇-[2-乙基磺酸(HEPES)的TCM199清洗介質(zhì)中的卵巢中選擇不成熟的卵母細(xì)胞，然后，取決于取得卵母細(xì)胞的動(dòng)物的不同在不同的培養(yǎng)介質(zhì)中培養(yǎng)成熟。由牛得到的卵母細(xì)胞用TCM199-1培養(yǎng)介質(zhì)培養(yǎng)使其成熟(見(jiàn)表1)。由貓得到的卵母細(xì)胞用補(bǔ)充了人類(lèi)絨毛膜促性腺激素(HCG)的TCM199-2培養(yǎng)介質(zhì)培養(yǎng)使其成熟(見(jiàn)表2)。兩種情況都在39℃、5％的CO2的環(huán)境下培養(yǎng)16至22小時(shí)。
表1TCM199-1培養(yǎng)介質(zhì)

表2TCM199-2培養(yǎng)介質(zhì)

步驟3受體卵母細(xì)胞的去核去掉成熟的受體細(xì)胞周?chē)那鸺?xì)胞并且切除卵母細(xì)胞的部分透明帶之后，從卵母細(xì)胞中去掉部分包括第一極體的胞質(zhì)，以得到去核的卵母細(xì)胞首先用一個(gè)剝脫管從含有透明質(zhì)酸酶的TCM199清洗介質(zhì)中物理地去掉成熟的卵母細(xì)胞周?chē)那鸺?xì)胞。然后用TCM199清洗介質(zhì)清洗剝脫了的卵母細(xì)胞，并且把它們移入細(xì)胞松馳素B溶液。為了對(duì)剝脫的細(xì)胞去核，用一根切割管穿刺剝脫了的卵母細(xì)胞的透明帶的一部分，以得到一個(gè)裂口，從此裂口可以把一部分包括第一極體的10％到15％的胞質(zhì)從卵母細(xì)胞擠出。清洗去核的卵母細(xì)胞，并且在TCM199培養(yǎng)介質(zhì)中保溫。所述細(xì)胞松馳素B溶液是通過(guò)用TCM199培養(yǎng)介質(zhì)稀釋溶解在DMSO(二甲基亞砜)中的細(xì)胞松馳素B制備的。步驟4電融合供體細(xì)胞和受體卵母細(xì)胞并且激活電融合的細(xì)胞將供體細(xì)胞移入到受體卵母細(xì)胞中，接著進(jìn)行電融合并且激活電融合的細(xì)胞在把供體細(xì)胞注射進(jìn)受體卵母細(xì)胞前，用TCM199培養(yǎng)介質(zhì)清洗去核的卵母細(xì)胞并且把它們移到PHA-P(植物血凝素)溶液中。然后通過(guò)把供體細(xì)胞注射到PHA-P溶液中的去核的卵母細(xì)胞的透明帶上造成的裂口中，把供體細(xì)胞移到去核的卵母細(xì)胞中。
使用電細(xì)胞操作器(BTX ECM2001)進(jìn)行電融合。把放在補(bǔ)充以TCM199清洗液的甘露醇溶液中的重建的胚胎放在有兩個(gè)電極的室中，這兩個(gè)電極在所述室的每側(cè)各有一個(gè)。在將胚胎放在所述室中以其供體細(xì)胞對(duì)著陰極之前，把所述室充以甘露醇溶液。用間隔1秒每次15微秒的0.75到2.00千伏/厘米的兩次直流脈沖對(duì)胚胎進(jìn)行電融合后，用甘露醇溶液和TCM199清洗介質(zhì)清洗電融合的胚胎，在細(xì)胞松馳素B中培養(yǎng)，并且激活。如果電融合在含鈣離子的甘露醇介質(zhì)中進(jìn)行，電融合和激活同時(shí)發(fā)生。不然，激活在電融合后進(jìn)行。當(dāng)電融合在不含鈣離子的甘露醇介質(zhì)中進(jìn)行時(shí)，激活步驟通過(guò)在離子霉素溶液中黑暗中保溫胚胎進(jìn)行。然后通過(guò)用含有FBS或者BSA的TCM199清洗介質(zhì)清洗胚胎去除離子霉素。所述離子霉素溶液通過(guò)用含有BSA的TCM199清洗介質(zhì)稀釋溶解在DMSO中的離子霉素制備。步驟5胚胎的后激活和體外培養(yǎng)胚胎的后激活和體外培養(yǎng)通過(guò)在放線(xiàn)菌酮溶液或者4-二甲氨基嘌呤(DAMP)溶液中保溫后激活在含有FBS或者BSA的TCM199清洗介質(zhì)中保溫的激活的胚胎，并且在5％的CO2或在5％CO2、7％O2和88％N2的混合氣體環(huán)境下體外培養(yǎng)。所述的放線(xiàn)菌酮溶液或者DAMP溶液通過(guò)在體外培養(yǎng)的介質(zhì)中添加溶解在乙醇中的放線(xiàn)菌酮或者DAMP而制備。體外培養(yǎng)的介質(zhì)包括mTALP(見(jiàn)表3)、mSOF(見(jiàn)表4)和mCR2aa(見(jiàn)表5)介質(zhì)，它們都含有NaCl、KCl、NaHCO3、NaH2PO4、CaCl2、乳酸鈉、葡萄糖、酚紅、BSA、卡那霉素、必需氨基酸、非必需氨基酸和L-谷氨酰胺。
可選擇地，冷凍保存體外培養(yǎng)的胚胎備以后使用，并且在打算使用時(shí)解凍。為了冷凍胚胎，用含有FBS的PBS清洗之，并放入含有青霉素-鏈霉素、CaCl2、葡萄糖、MgCl2、丙酮酸鈉和PBS的冷凍介質(zhì)中。然后把冷凍介質(zhì)中的胚胎緩慢冷凍，接著在液氮中快速冷凍。當(dāng)冷凍的胚胎從液氮中取出并且解凍時(shí)，把它們?cè)诳諝庵蟹胖眉s5秒鐘，然后在溫水中解凍。為了從解凍的胚胎中去掉冷凍介質(zhì)，把它們依次地放進(jìn)從含有高濃度甘油到含有低濃度的甘油的系列介質(zhì)中。
表3mTALP介質(zhì)

表4mSOF介質(zhì)

表5mCR2aa介質(zhì)

步驟6生產(chǎn)克隆虎將體外培養(yǎng)的胚胎移入代孕母畜以生產(chǎn)虎將在含有FBS的PBS中的胚胎植入代孕母畜的子宮。
基于上述的方法，本發(fā)明通過(guò)分別用韓國(guó)虎的耳細(xì)胞和韓國(guó)牛的卵母細(xì)胞作胞核供體和受體卵母細(xì)胞，制備了胚胎，即SNU5(韓國(guó)虎NT胚胎)。這種胚胎于2000年3月10日在國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)KCTC(韓國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，韓國(guó)KRIBB#52,OUNDONG,YUSONG-KU，TAEJON,305-33，韓國(guó))保藏，保藏號(hào)為KCTC0752BP。
現(xiàn)在以以下各實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，這些實(shí)施例不應(yīng)當(dāng)用作限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1制備供體細(xì)胞和受體卵母細(xì)胞為了制備供體細(xì)胞，在刮掉組織周?chē)拿笥靡掖己吞鸩藟A(betadine)對(duì)雄性成年虎耳尖的組織進(jìn)行消毒。用消毒的器械采集皮膚組織(面積1至2平方厘米)，移入內(nèi)盛含有0.5％青霉素(10000單位/毫升)-鏈霉素(10毫克/毫升)的PBS(磷酸鹽緩沖的鹽水，Gibco氏BRL，美國(guó)Life Technology)的50毫升試管中。然后從所述采集的皮膚組織中用消毒剪子和手術(shù)刀分離軟骨和含毛皮膚，得到襯在軟骨上的皮膚內(nèi)側(cè)的組織作為供體。將該組織用PBS清洗，然后粉碎到100目。然后在39℃、5％的CO2環(huán)境下在含有0.25％的胰蛋白酶、1mM的EDTA和1毫克/毫升的Ⅱ型膠原蛋白酶的PBS中將組織保溫1小時(shí)，在組織被酶消化后，以1500轉(zhuǎn)/分鐘離心兩分鐘，然后懸浮在補(bǔ)充了10％FBS、1％NEAA(非必需氨基酸)、和1％青霉素-鏈霉素的DMEM(Dulbecco氏改進(jìn)的Eagle氏培養(yǎng)基，Gibco氏BRL，美國(guó)LifeTechnology)中。將懸浮液移入細(xì)胞培養(yǎng)皿中，在39℃、5％CO2環(huán)境下保溫以得到體細(xì)胞系。此后細(xì)胞在含有0.25％的胰蛋白酶和1mM的EDTA的溶液中進(jìn)行胰蛋白酶處理，然后把細(xì)胞數(shù)調(diào)節(jié)到2×104個(gè)細(xì)胞/毫升以在Eppendorf管中等分細(xì)胞。


圖1表示分離為單個(gè)細(xì)胞以用作胞核供體的體細(xì)胞。
另一方面，為得到受體卵母細(xì)胞，用帶有18G針頭的10毫升注射器從韓國(guó)牛的卵巢吸取直徑約2到6毫米左右的卵泡。然后，把卵泡液移入底部畫(huà)有格條的(線(xiàn)間寬度為1厘米)的100毫米平皿中，然后篩選有均勻的胞質(zhì)并且周?chē)凶銐驍?shù)量的丘細(xì)胞層的卵母細(xì)胞。選出的卵母細(xì)胞在35毫米平皿中用2毫升TCM199清洗介質(zhì)(見(jiàn)表6)清洗三次，接著用TCM199-1培養(yǎng)介質(zhì)(表1)清洗一次。最后在含有0.1％雌二醇溶液(表7)、2.5％促卵泡激素溶液(表8)和10％FBS的TCM199介質(zhì)中培養(yǎng)，以得到受體卵母細(xì)胞。
表6TCM199清洗介質(zhì)

表7雌二醇溶液

表8促卵泡激素溶液

實(shí)施例2體細(xì)胞的核轉(zhuǎn)移實(shí)施例1中制備的受體卵母細(xì)胞用TCM199清洗介質(zhì)清洗一次，然后移入通過(guò)1毫升的TCM199清洗介質(zhì)與111微升的透明質(zhì)酸酶原液(在TCM199清洗介質(zhì)中每毫升10毫克)混合制備的0.1％透明質(zhì)酸酶(美國(guó)Sigma Chemical Co.)溶液。在0.1％透明質(zhì)酸酶環(huán)境下從卵母細(xì)胞去掉丘細(xì)胞之后，將剝脫后的卵母細(xì)胞清洗三次并且在TCM199清洗介質(zhì)中保溫。然后把卵母細(xì)胞移入通過(guò)含有10％FBS的1毫升TCM199清洗介質(zhì)與1微升的細(xì)胞松馳素B原液(在DMSO每毫升7.5毫克)混合制備的細(xì)胞松馳素B(美國(guó)Sigma Chemical Co.)溶液中，并用一種微操作器切開(kāi)每個(gè)卵母細(xì)胞的透明帶的一部分，以得到一個(gè)裂口，從此裂口可以把10％到15％的胞質(zhì)從卵母細(xì)胞擠出，以得到去核的卵母細(xì)胞。制備去核的卵母細(xì)胞的步驟更具體地說(shuō)明如下把工作盤(pán)放在微操作器臺(tái)上，在微操作器的左臂上裝備有一根持定管，在其右臂上裝備有一根切割管。然后，分別把持定管和切割管沿9點(diǎn)鐘和3點(diǎn)鐘的方向放置，并且通過(guò)在中間放置一個(gè)微管控制器把它們調(diào)節(jié)得可以沿各方向自由運(yùn)動(dòng)。進(jìn)一步把兩個(gè)微管調(diào)節(jié)得不能接觸到工作盤(pán)，并且通過(guò)在微滴管上方上下移動(dòng)使它們不接觸工作盤(pán)并且它們的尖端放在微滴管的中間。然后用一個(gè)洗口管(內(nèi)徑大于200微米)把卵母細(xì)胞從TCM199清洗介質(zhì)移入細(xì)胞松馳素B溶液。首先用其粗調(diào)鈕和細(xì)調(diào)鈕把微操作器聚焦在卵母細(xì)胞上，并通過(guò)上下移動(dòng)該兩個(gè)微管進(jìn)一步聚焦。卵母細(xì)胞放置得以其第一極體沿卵母細(xì)胞的12點(diǎn)鐘方向，然后把持定管沿卵母細(xì)胞的9點(diǎn)鐘方向放置得緊靠卵母細(xì)胞以通過(guò)加液壓固定卵母細(xì)胞。圖2表示用持定管和切割管切割卵母細(xì)胞的透明帶的過(guò)程。如圖2所示，卵母細(xì)胞用切割管(2)從1點(diǎn)鐘的方向向11點(diǎn)鐘的方向切割，特別小心不要損傷卵母細(xì)胞的胞質(zhì)。此后向持定管(1)施加液壓以分開(kāi)卵母細(xì)胞(3)，然后將持定管與靠著第一極體上部剌穿透明帶的切割管接觸，以通過(guò)磨擦兩個(gè)管切割部分透明帶。上述在卵母細(xì)胞上造的裂口既用于去核也用于供體注射。圖3表示從卵母細(xì)胞去掉第一極體和胞核的過(guò)程。如圖3所示，把卵母細(xì)胞(3)以其裂口豎直取向放置，用持定管(1)持定其下部以防止移動(dòng)，然后用切割管(2)輕擠其上部以得到去核的卵母細(xì)胞。去核的卵母細(xì)胞用TCM199清洗介質(zhì)清洗三次，然后在TCM199培養(yǎng)介質(zhì)中保溫。
此后，用微操作器把事先制備好的供體細(xì)胞移入去核的卵母細(xì)胞。首先用400微升TCM199清洗液和100微升PHA-P(植物血凝素)原液(在TCM199清洗液中0.5毫克/毫升)混合制備的PHA-P溶液在工作盤(pán)的中間做一個(gè)4微升的注射微滴。然后，用含有1％FBS的PBS做兩個(gè)供體細(xì)胞的微滴，一個(gè)在同一工作盤(pán)上的注射微滴之上，一個(gè)在其下。在這些微滴上涂復(fù)礦物油之后，把工作盤(pán)放在微操作器臺(tái)上。
用一個(gè)注射管代替安裝在微操作器上的切割管。去核的卵母細(xì)胞用TCM199清洗介質(zhì)清洗三次，然后移入注射微滴。把供體細(xì)胞吸入注射管然后移入注射微滴。圖4表示把一個(gè)體細(xì)胞移入去核的卵母細(xì)胞的過(guò)程。如圖4所示，去核的卵母細(xì)胞以其裂口取向?yàn)?點(diǎn)鐘放置，用持定管持定，然后用注射管和液壓經(jīng)所述裂口注射進(jìn)供體細(xì)胞，以得到重建的胚胎。把胚胎用TCM199清洗介質(zhì)清洗三次，然后在TCM199清洗介質(zhì)中保溫。實(shí)施例3電融合和激活重建的胚胎使用電細(xì)胞操作器(美國(guó)，BTX,ECM2001)進(jìn)行電融合，然后再激活。用一個(gè)清洗用口管在含有重建的胚胎的TCM199培養(yǎng)介質(zhì)中加入15微升含有0.28M甘露醇、0.5mM HEPES(pH7.2)、0.1mMMgSO4和0.05％BSA的甘露醇溶液。在所述介質(zhì)中保溫1分鐘之后，把胚胎放在補(bǔ)充以TCM199清洗液的甘露醇溶液中培養(yǎng)1分鐘，最后用清洗用口管把胚胎移入甘露醇溶液。電細(xì)胞操作器的室(3.2毫米的453號(hào)室)中充灌補(bǔ)充以TCM199清洗介質(zhì)的甘露醇溶液，然后把所述胚胎放在所述室中以其供體細(xì)胞對(duì)著陰極。用間隔1秒每次15微秒的0.75到2.00千伏/厘米的兩次直流脈沖對(duì)胚胎進(jìn)行電融合后，將胚胎借助于甘露醇溶液移入TCM199清洗液，并且用TCM199清洗液清洗三次。
為激活電融合的胚胎，把胚胎在離子霉素(美國(guó)Sigma ChemicalCo.)溶液中黑暗中培養(yǎng)4分鐘，所述溶液是一種含有5μM離子霉素和1％的BSA的TCM199清洗液。所述離子霉素原液通過(guò)在1.34毫升的DMSO中溶解1毫克的離子霉素制備。激活的胚胎在含補(bǔ)充以10％FBS的TCM199清洗介質(zhì)的35毫米平皿中保溫5分鐘以從胚胎洗去離子霉素。實(shí)施例4后激活和體外培養(yǎng)電融合的胚胎激活的胚胎在25微升的放線(xiàn)菌酮(美國(guó)Sigma Chemical Co.)溶液中后激活4個(gè)小時(shí)，所述的放線(xiàn)菌酮溶液是通過(guò)在體外培養(yǎng)的介質(zhì)mTALP(見(jiàn)表3)中添加放線(xiàn)菌酮原液(10毫克/毫升在乙醇中)，到最終濃度為10微克/毫升來(lái)制備。然后篩選胚胎，把選出的胚胎在39℃溫度，5％的CO2環(huán)境下培養(yǎng)7天。
基于上述的方法時(shí)，本發(fā)明人分別用從用韓國(guó)虎的耳朵細(xì)胞作為供體細(xì)胞，用韓國(guó)牛的卵母細(xì)胞作受體細(xì)胞，產(chǎn)生一種胚胎，即SNU5(韓國(guó)虎NT胚胎)。這種胚胎于2000年3月10日在國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)KCTC(韓國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，韓國(guó)KRIBB#52,OUNDONG,YUSONG-KU,TAEJON,305-33，韓國(guó))保藏，保藏號(hào)為KCTC0752BP。實(shí)施例5用從貓得到的卵母細(xì)胞生產(chǎn)胚胎本發(fā)明用實(shí)施例1至4所述的同樣方法產(chǎn)生和培養(yǎng)胚胎，不同是的用從貓得到的卵母細(xì)胞作為受體卵母細(xì)胞。實(shí)施例6胚胎的冷凍和解凍及植入冷凍實(shí)施例4和5中產(chǎn)生的胚胎以長(zhǎng)期保存。首先在35毫米平皿中分布一種冷凍介質(zhì)(見(jiàn)表9和10)，調(diào)節(jié)冰箱維持到-5℃。選作冷凍的胚胎用含有10％FBS的PBS清洗，在冷凍介質(zhì)中保溫20分鐘。然后，把胚胎吸入到0.25毫升的法式吸管中使含有胚胎的冷凍介質(zhì)處在吸管的中間，而吸管的兩側(cè)是空氣。在用一個(gè)加熱了的鉗子密封了吸管的兩端后，把它放進(jìn)冰箱，在-5℃保持5分鐘。然后用一把預(yù)冷鉗子種入液氮中速凍。在種入后，以-0.3℃/分鐘的速度冷凍到-30℃，在溫度達(dá)到-30℃時(shí)保持10分鐘。最后把胚胎儲(chǔ)存在液氮罐中。
表9冷凍PBS

表10冷凍介質(zhì)

為使冷凍的胚胎解凍，在35毫米平皿中制備含有補(bǔ)充以20％的FBS的PBS的解凍介質(zhì)，并且加上甘油以得到各有0％、3％和6％甘油的解凍介質(zhì)(見(jiàn)表9和11)。然后從液氮中取出冷凍的吸管，在空氣中保持5秒鐘，然后在含有溫水(30℃)的容器(直徑大于20厘米)中解凍。在解凍后，把吸管在其兩端的空氣層處切割開(kāi)，然后收集含有胚胎的介質(zhì)。在顯微鏡下檢查胚胎。為了從胚胎去掉冷凍介質(zhì)，把它們相繼地在含有6％甘油、3％甘油和0％甘油的解凍介質(zhì)中各保溫5分鐘。
表11解凍介質(zhì)

把解凍的胚胎放入含有20％的FBS的PBS中，然后吸入吸管。然后把它移入代孕母畜的子宮。實(shí)施例7比較應(yīng)用不同供體細(xì)胞的胚胎為了比較應(yīng)用不同受體卵母細(xì)胞制備的胚胎的區(qū)別，將實(shí)施例4和5制備的胚胎移入代孕母畜的子宮，然后就以下各項(xiàng)進(jìn)行比較電融合的卵母細(xì)胞數(shù)、電融合率(％)、分裂率(％)、8-細(xì)胞胚胎數(shù)(％)、16-細(xì)胞胚胎數(shù)(％)、32-細(xì)胞胚數(shù)(％)、桑椹胚/胚泡發(fā)育數(shù)(％)、轉(zhuǎn)移的胚胎數(shù)和胚胎轉(zhuǎn)移后的懷孕數(shù)(見(jiàn)表12)。桑椹胚/胚泡發(fā)育數(shù)(％)代表剛好在植入前階段的由核轉(zhuǎn)移產(chǎn)生的總胚胎數(shù)中由體外培養(yǎng)發(fā)育的胚胎數(shù)的比率。
表12克隆虎胚胎的比較

如表12所示，應(yīng)用牛的卵母細(xì)胞比用貓的卵母細(xì)胞的發(fā)育率和受孕率高。這可以解釋為，許多在牛的卵母細(xì)胞上開(kāi)發(fā)的研究有助于建立理想的核轉(zhuǎn)移條件，而對(duì)于在貓的卵母細(xì)胞上開(kāi)發(fā)的研究還不多。
先前的研究表明已經(jīng)進(jìn)行了許多研究的牲畜可以用于種間核轉(zhuǎn)移。然而，沒(méi)有一個(gè)成功地用于生產(chǎn)克隆子代。與上述情況相聯(lián)系，本發(fā)明因此在產(chǎn)生體細(xì)胞衍生的克隆動(dòng)物上取得了很大的成功，生產(chǎn)出了體細(xì)胞衍生的克隆子代。
如以上清楚地表示和說(shuō)明，本發(fā)明提供了一種通過(guò)種間核轉(zhuǎn)移技術(shù)生產(chǎn)克隆虎的方法，該技術(shù)涉及把虎的休細(xì)胞與牛或者貓的卵母細(xì)胞融合。本發(fā)明還涉及一種提供克隆虎的胚胎和用所述胚胎培育克隆虎的方法。根據(jù)本發(fā)明的方法，可以通過(guò)應(yīng)用種間核轉(zhuǎn)移產(chǎn)生其克隆胚胎，永久地保存稀有瀕危動(dòng)物的遺傳特征，作為一種保存野生動(dòng)物的途徑。除了保存野生動(dòng)物，還可望應(yīng)用本發(fā)明的方法發(fā)展許多涉及種間核轉(zhuǎn)移的相關(guān)應(yīng)用。
閱讀以上說(shuō)明后，本領(lǐng)域內(nèi)的一般技術(shù)人員可以對(duì)本文所示和所述進(jìn)行種種修改。這些修改也落入本發(fā)明的權(quán)利要求書(shū)所述的范圍內(nèi)。
有關(guān)微生物及其它生物材料的保藏證明(PCT細(xì)則13之二)


PCT/RO/134表
權(quán)利要求
1．一種生產(chǎn)克隆虎的方法，該方法包含以下步驟(Ⅰ)制備從虎身上采集的供體體細(xì)胞系；(Ⅱ)體外將從?；蛘哓埖穆殉膊杉穆涯讣?xì)胞培育成熟；(Ⅲ)去掉卵母細(xì)胞周?chē)那鸺?xì)胞，切割成熟的卵母細(xì)胞透明帶的一部分以造成一個(gè)裂口，并且從此裂口擠出部分包括第一極體的胞質(zhì)，以得到去核受體卵母細(xì)胞；(Ⅳ)通過(guò)把供體細(xì)胞注射進(jìn)去核受體卵母細(xì)胞將核移入受體卵母細(xì)胞，然后通過(guò)隨后的電融合和激活電融合后的細(xì)胞得到胚胎；(Ⅴ)后激活并且體外培養(yǎng)胚胎；(Ⅵ)然后把培養(yǎng)的胚胎移入代孕母畜以產(chǎn)生克隆虎仔。
2．根據(jù)權(quán)利要求1的生產(chǎn)克隆虎的方法，其中步驟(Ⅰ)制備的體細(xì)胞系包括從子宮沖洗液、子宮內(nèi)膜、輸卵管、耳或者肌肉、丘細(xì)胞或者胎成纖維細(xì)胞采集的細(xì)胞。
3．根據(jù)權(quán)利要求1的生產(chǎn)克隆虎的方法，其中所述體細(xì)胞系通過(guò)傳代培養(yǎng)、血清饑餓培養(yǎng)或者冷凍保存。
4．根據(jù)權(quán)利要求1的生產(chǎn)克隆虎的方法，其中步驟(Ⅲ)中，在用透明質(zhì)酸酶處理后，用剝脫管物理地去掉卵母細(xì)胞周?chē)那鸺?xì)胞。
5．根據(jù)權(quán)利要求1的生產(chǎn)克隆虎的方法，其中步驟(Ⅲ)中，卵母細(xì)胞的去核是通過(guò)下列步驟進(jìn)行的用微操作器切割卵母細(xì)胞在卵母細(xì)胞上造成一個(gè)裂口；把卵母細(xì)胞以其裂口豎直取向并且用一根持定管持定卵母細(xì)胞的下部以防止它移動(dòng)；用一根切割管擠壓卵母細(xì)胞的上部經(jīng)所述裂口將包括第一極體的10％到15％胞質(zhì)從卵母細(xì)胞擠出。
6．根據(jù)權(quán)利要求1的生產(chǎn)克隆虎的方法，其中步驟(Ⅳ)中的胞核轉(zhuǎn)移是通過(guò)經(jīng)在卵母細(xì)胞的透明帶上造成的裂口，把供體細(xì)胞注射進(jìn)入去核的受體卵母細(xì)胞進(jìn)行的。
7．根據(jù)權(quán)利要求1的生產(chǎn)克隆虎的方法，其中步驟(Ⅳ)中的電融合是通過(guò)間隔1秒每次15微秒施加的0.75到2.00千伏/厘米的兩次直流脈沖進(jìn)行的。
8．根據(jù)權(quán)利要求1的生產(chǎn)克隆虎的方法，其中步驟(Ⅳ)中，如果電融合在含鈣離子的介質(zhì)中進(jìn)行，激活步驟與電融合同時(shí)發(fā)生。
9．根據(jù)權(quán)利要求1的生產(chǎn)克隆虎的方法，其中步驟(Ⅳ)中，如果電融合在不含鈣離子的介質(zhì)中進(jìn)行，激活步驟在離子霉素溶液中在黑暗中進(jìn)行。
10．根據(jù)權(quán)利要求1的生產(chǎn)克隆虎的方法，其中步驟(Ⅴ)中的后激活是通過(guò)在放線(xiàn)菌酮溶液或者DAMP(4-二甲氨基嘌呤)溶液中培養(yǎng)胚胎進(jìn)行的。
11．根據(jù)權(quán)利要求1的生產(chǎn)克隆虎的方法，其中步驟(Ⅴ)中的體外培養(yǎng)是通過(guò)在mTALP、mSOF或者mCR2aa介質(zhì)中培養(yǎng)后激活的胚胎進(jìn)行的。
12．根據(jù)權(quán)利要求1的生產(chǎn)克隆虎的方法，該方法還包括儲(chǔ)存在步驟(Ⅴ)中體外培養(yǎng)的胚胎以備后用的步驟，該步驟是在含有青霉素-鏈霉素、CaCl2、葡萄糖、MgCl2、丙酮酸鈉和磷酸鹽緩沖的鹽水的冷凍介質(zhì)中冷凍胚胎后進(jìn)行的。
13．一種胚胎，即SNU5(韓國(guó)虎NT胚胎，KCTC0752BP)，它是通過(guò)權(quán)利要求1的步驟(Ⅰ)到(Ⅴ)，分別用韓國(guó)虎的耳朵細(xì)胞作為胞核供體，用韓國(guó)牛(Bos taurus coreanae)的卵母細(xì)胞作為受體卵母細(xì)胞產(chǎn)生的。
14．一種克隆虎，它是通過(guò)權(quán)利要求1的步驟(Ⅵ)用權(quán)利要求13所述的SNU5(韓國(guó)虎NT胚胎，KCTC0752BP)作為胚胎生產(chǎn)的。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種應(yīng)用種間胞核轉(zhuǎn)移技術(shù)生產(chǎn)克隆虎的方法。本發(fā)明的生產(chǎn)克隆虎的方法包含以下步驟:制備從虎身上采集的供體體細(xì)胞系;在體外將從牛或貓的卵巢采集的卵母細(xì)胞培育成熟;去掉卵母細(xì)胞周?chē)那鸺?xì)胞,切割成熟的卵母細(xì)胞透明帶的一部分以造成一個(gè)裂口,并且通過(guò)該裂口擠出部分包括第一極體的胞質(zhì),以得到去核受體卵母細(xì)胞;通過(guò)把供體細(xì)胞注射進(jìn)去核卵母細(xì)胞將一個(gè)核移入受體卵母細(xì)胞,然后通過(guò)隨后的電融合和激活電融合后的細(xì)胞得到胚胎;后激活并且體外培養(yǎng)胚胎;然后將培養(yǎng)的胚胎移入代孕母畜以產(chǎn)生克隆虎。本發(fā)明可以核轉(zhuǎn)移胚胎的方式廣泛地用于永久地保存稀有瀕危動(dòng)物的遺傳特征。
文檔編號(hào)A01K67/027GK1304445SQ00800651
公開(kāi)日2001年7月18日 申請(qǐng)日期2000年6月30日 優(yōu)先權(quán)日1999年6月30日
發(fā)明者李炳千, 申泰英, 盧湘鎬, 林正默, 樸鐘任, 趙鐘基, 金琪淵, 李殷松, 申秀晶, 金晟基, 宋吉永, 龍煥律, 安國(guó)俊, 玄尚桓, 李秉東, 黃禹錫 申請(qǐng)人:黃禹錫