專利名稱：促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)的綠色添加劑及其生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)的綠色添加劑及其生產(chǎn)方法，更具體地說，涉及一種含促上皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(PEGF)的玉米、水稻、小麥、大豆、油菜粉等類作物及其生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
在現(xiàn)有技術(shù)中，用植物作表達(dá)載體來表達(dá)外源蛋白已有不少報(bào)道，但將PEGF基因于植物體上表達(dá)尚未見報(bào)道。目前的動(dòng)物促生長(zhǎng)添加劑技術(shù)中，有化學(xué)合成的促生長(zhǎng)添加劑，如β-激動(dòng)劑(俗稱“瘦肉精”)和生長(zhǎng)激素，但因其是人工合成，具有頑固的熱穩(wěn)定性，使用后會(huì)在動(dòng)物組織中形成累積性殘留。由于這類化合物具有口服活性，違法使用會(huì)給消費(fèi)者帶來一些不良影響(如頭暈眼花，嘔吐等癥狀)，正受到國(guó)家的“封殺”。此外，市場(chǎng)上還有一些抗生素型促生長(zhǎng)添加劑，它們通過抑制腸道內(nèi)的有害細(xì)菌而達(dá)到促生長(zhǎng)的目的，由于它們屬于抗生素，因此，必然面臨耐藥性和藥物殘留的問題。
用植物反應(yīng)器高效表達(dá)促上皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子，既避免了生長(zhǎng)激素必須注射所造成的不便，又可作為一種綠色環(huán)保促生長(zhǎng)添加劑，不僅滿足了當(dāng)今市場(chǎng)的需求，無毒副作用、無殘留，同時(shí)又可減少飼料轉(zhuǎn)化為脂肪的浪費(fèi)，大幅提高飼料的利用率。
總而言之，促上皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(PGEF)，具有如下幾個(gè)功能
1、促進(jìn)mRNA，DNA和蛋白質(zhì)的合成；2、促進(jìn)細(xì)胞的擴(kuò)散和分生；3、參與細(xì)胞保護(hù)功能；4、促進(jìn)傷口的愈合；5、增強(qiáng)對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收如糖、氨基酸和電解質(zhì)；6、改善腸道消化功能；7、促進(jìn)卵母細(xì)胞的成熟，改善動(dòng)物的繁殖性能；8、提高畜禽的瘦肉比例，減少脂肪沉積，提高飼料的轉(zhuǎn)化率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種具有促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)的飼料添加劑包括玉米、水稻、小麥、大豆、油菜粉及其生產(chǎn)方法。
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案生產(chǎn)一種促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)的飼料添加劑，包括玉米、水稻、小麥、大豆和油菜粉等類作物，它們含促上皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子并可明顯地促進(jìn)動(dòng)物的生長(zhǎng)，用以表達(dá)促上皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子的修飾基因?yàn)門GGGGAAGAACGGCAGCCTGTGCTGCTTCTCTCTGCTGCTGCTGCTGCTTCTCGCCGGGTTGGCGTCC+AACTCTTACTCTGAGTGCCCGCCGAGTCATGACGGGTACTGCCTTCACGGTGGTGTTTGTATGTACATTGAAGCTGTTGATTCTTACGCTTGCAACTGCGTTTTCGGTTACGTTGGTGAAAGATGCCAACATAGAGACCTTAAGTGGTGGGAACTTAGA+CATCATCATCATCATCAT。
上述PEGF修飾基因序列通過植物反應(yīng)器能表達(dá)出相應(yīng)的重組蛋白，并形成三級(jí)結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明較好的技術(shù)方案是實(shí)施過程中，進(jìn)行基因重組和重組蛋白的制備，即(1)將上述促上皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因插入質(zhì)粒載體采用分子生物學(xué)的方法人工合成PEGF基因，該基因含有啟動(dòng)子和終止子，基因經(jīng)過修飾成為植物所偏嗜的密碼子，前端為植物的信號(hào)肽基因，片段兩端為內(nèi)切酶位點(diǎn)(Xba I和sal I)。用相應(yīng)的內(nèi)切酶切表達(dá)載體和目的片段，T4連接酶連接重組，構(gòu)建各自的重組質(zhì)粒；(2)將上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入植物玉米、水稻、小麥、大豆和油菜中進(jìn)行表達(dá)，獲得轉(zhuǎn)基因植物的種子將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌，于含卡那霉素的LB中培養(yǎng)，離心收集細(xì)胞，于含蔗糖和L6-BA的MS培養(yǎng)液中重懸，再將培養(yǎng)好的植物莖葉浸入含根癌農(nóng)桿菌細(xì)胞的重懸液中真空浸潤(rùn)，用水沖洗，存放至成熟，用含MS、蔗糖和MES的GM和卡那霉素的瓊脂凝膠篩選轉(zhuǎn)基因種子；(3)取種子種入土壤，獲得可作為飼料添加劑的植物根、莖、葉、果實(shí)或種子。
在實(shí)施本發(fā)明的過程中，首先通過對(duì)豬、牛、羊(綿羊和山羊)、人的促上皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因進(jìn)行大量的分析和重組，選取具有相同保守區(qū)的片段進(jìn)行重組。同時(shí)為了提高在植物中的表達(dá)量，我們把目的片段與植物本身的一段信號(hào)肽基因相融合，來防止mRNA的降解。然后人工合成此段基因，與植物的表達(dá)載體連接重組，通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化和基因槍轉(zhuǎn)化的方法，把目的基因整合進(jìn)植物的基因組中。
上述PEGF基因序列通過植物反應(yīng)器表達(dá)出相應(yīng)的重組蛋白，并形成三級(jí)結(jié)構(gòu)，用含重組活性蛋白的作物粉作飼料添加劑，可起到明顯的促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)的作用。
在實(shí)施本發(fā)明的過程中，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)的綠色添加劑的生產(chǎn)包括用目的基因的同源性分析、目的基因的人工修飾、目的基因的人工合成、基因重組、重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化植物，促動(dòng)物生長(zhǎng)方法包括用含重組蛋白的作物粉制作飼料添加劑并飼喂家畜。首先通過對(duì)豬、牛、羊(綿羊和山羊)、人的促上皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因進(jìn)行大量的分析和重組，選取具有相同保守區(qū)的片段進(jìn)行重組。同時(shí)，為了提高在植物中的表達(dá)量，把目的片段與植物本身的一段信號(hào)肽基因相融合，來防止mRNA的降解。采用分子生物學(xué)的方法人工合成PEGF基因，該基因含有啟動(dòng)子和終止子，基因經(jīng)過修飾成為植物所偏嗜的密碼子，前端為植物的信號(hào)肽基因，片段兩端為內(nèi)切酶位點(diǎn)(Xba I和sal I)。用相應(yīng)的內(nèi)切酶切表達(dá)載體和目的片段，T4連接酶連接重組，構(gòu)建相應(yīng)的重組質(zhì)粒；將上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入植物玉米、水稻、小麥、大豆和油菜中進(jìn)行表達(dá)，獲得轉(zhuǎn)基因植物的種子將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌，于含卡那霉素的LB中培養(yǎng)，離心收集細(xì)胞，于含蔗糖和L6-BA的MS培養(yǎng)液中重懸，再將培養(yǎng)好的植物莖葉浸入含根癌農(nóng)桿菌細(xì)胞的重懸液中真空浸潤(rùn)，用水沖洗，存放至成熟，用含MS、蔗糖和MES的GM和卡那霉素的瓊脂凝膠篩選轉(zhuǎn)基因種子，并可經(jīng)ELISA法和Westernblot法檢測(cè)確證。
實(shí)施過程中，將植物種子種于小杯中，在4℃暗室中放置48小時(shí)使其同步發(fā)芽。后轉(zhuǎn)至生長(zhǎng)室20℃曝光16小時(shí)，用雙蒸水，也可以用礦物質(zhì)水澆灌。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌細(xì)胞系(Agrobacterium tumefaciens cell line)(C58C1株)，在LB(Luri-Bertani)培養(yǎng)液中(含卡那霉素50mg/ml)培養(yǎng)離心收集細(xì)胞，于200ml MS(murashige和Skoog)培養(yǎng)液(2.35g/l)(含5％蔗糖和10g/L的6-BA(6-芐氨基嘌吟6-benzilaminopurine中重懸。待植物6-7周齡時(shí)，倒置培養(yǎng)杯將植物浸入含根癌農(nóng)桿菌細(xì)胞(Agrobacterium)的重懸液中，真空5×106mpa浸潤(rùn)滲透15分鐘，用水沖洗后放于生長(zhǎng)室中直至成熟。在培養(yǎng)皿中用含GM(4.7g/lMS、1％蔗糖和0.5g/LMES(嗎啉乙烷磺酸morpholine ethanesulfonic acid)和50mg/ml卡那霉素的瓊脂凝膠(8g/lPH5.7)中篩選轉(zhuǎn)基因種子。兩周后，將轉(zhuǎn)基因植物移至土壤中培育成熟即可獲得促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)基因種子。或者用重組質(zhì)粒包裹金彈，采用基因轟擊的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化，經(jīng)過培育和Southern blot檢測(cè)確認(rèn)后獲得促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)基因種子。
轉(zhuǎn)基因植物的根、莖、葉、果實(shí)和種子中含有促上皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(PEGF)的外源基因，經(jīng)PCR檢測(cè)確證，所含外源蛋白可經(jīng)ELISA和Western blot檢測(cè)確證。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下明顯的優(yōu)點(diǎn)一是生產(chǎn)技術(shù)簡(jiǎn)單，二是飼料添加劑中的重組蛋白具有生物活性，可明顯地促進(jìn)動(dòng)物的生長(zhǎng)，家畜進(jìn)食含上述添加劑的飼料后，其瘦肉率、增重率明顯高于空白對(duì)照組。
具體實(shí)施例方式
以下通過具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更加詳細(xì)的描述實(shí)施例首先通過對(duì)豬、牛、羊(綿羊和山羊)、人的促上皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因進(jìn)行大量的分析和重組，選取具有相同保守區(qū)的功能片段進(jìn)行重組。同時(shí)，為了提高在植物中的表達(dá)量，把目的片段與植物本身的一段信號(hào)肽基因相融合，來防止mRNA的降解。采用分子生物學(xué)的方法人工合成PEGF基因，該基因含有啟動(dòng)子和終止子，基因經(jīng)過修飾成為植物所偏嗜的密碼子，前端為植物的信號(hào)肽基因，片段兩端為內(nèi)切酶位點(diǎn)(Xba I和sal I)。用相應(yīng)的內(nèi)切酶切表達(dá)載體和目的片段，T4連接酶連接重組，構(gòu)建相應(yīng)的重組質(zhì)粒；將上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入植物玉米、水稻、小麥、大豆和油菜中進(jìn)行表達(dá)，獲得轉(zhuǎn)基因植物的種子將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌，于含卡那霉素的LB中培養(yǎng)，離心收集細(xì)胞，于含蔗糖和L6-BA的MS培養(yǎng)液中重懸，再將培養(yǎng)好的植物莖葉浸入含根癌農(nóng)桿菌細(xì)胞的重懸液中真空浸潤(rùn)，用水沖洗，存放至成熟，用含MS、蔗糖和MES的GM和卡那霉素的瓊脂凝膠篩選轉(zhuǎn)基因種子，并經(jīng)ELISA法和Western blot法檢測(cè)確證。
將植物的種子植入小杯中，于4℃暗室中放置48小時(shí)使其同步發(fā)芽，其后轉(zhuǎn)移至生長(zhǎng)室20℃曝光16小時(shí)，用雙蒸水，偶爾用礦物質(zhì)水澆灌。待植物6-7周齡時(shí)，倒置培養(yǎng)杯將植物莖葉浸入含根癌農(nóng)桿菌細(xì)胞的重懸液中，真空度5×106mpa浸潤(rùn)滲透15分鐘，用水沖洗后放入生長(zhǎng)室中直至成熟。在培養(yǎng)皿中，用含GM(4.7g/lMS、1％蔗糖和0.5g/lMES)和50mg/ml濃度卡那霉素的瓊脂膠凝(8g/lPH5.7)中篩選轉(zhuǎn)基因植株。兩周后，將轉(zhuǎn)基因植物移至土壤中培養(yǎng)成熟即可獲得抗禽流感的轉(zhuǎn)基因種子。或者用重組質(zhì)粒包裹金彈，采用基因轟擊的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化，經(jīng)過培育和Southern blot檢測(cè)確認(rèn)后獲得促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)基因種子。
各個(gè)轉(zhuǎn)基因植物的根、莖、葉、果實(shí)或種子中所含外源基因PEGF，可經(jīng)PCR檢測(cè)引物檢測(cè)其存在。
各個(gè)轉(zhuǎn)基因植物的根、莖、葉、果實(shí)或種子中所含的外源蛋白，經(jīng)ELISA和Western blot檢測(cè)其存在，陽性對(duì)照為空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的植物抽提物中混有人工合成的多肽PEGF(10ug/ml)，陰性對(duì)照為空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的植物抽提物。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因植物的根、莖、葉、果實(shí)或種子中含有外源蛋白PEGF，能夠與蛋白中相應(yīng)的多肽血清發(fā)生明顯的反應(yīng)。在Western blot檢測(cè)中，用抗PEGF的血清可檢測(cè)到特異性的條帶，分子量為1-10KDa，得出與ELISA相同的檢測(cè)結(jié)果。
家畜進(jìn)食用上述作物制作的飼料添加劑后，與空白對(duì)照組相比較，瘦肉率、增長(zhǎng)率明顯提高，超過了目前市場(chǎng)上銷售的促生長(zhǎng)型添加劑的水平。
權(quán)利要求
1.一種促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)的綠色添加劑，包括玉米、水稻、小麥、大豆和油菜粉類作物，其特征在于該類添加劑含促上皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(PEGF)，用以表達(dá)促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)的PEGF修飾基因?yàn)門GGGGAAGAACGGCAGCCTGTGCTGCTTCTCTCTGCTGCTGCTGCTGCTTCTCGCCGGGTTGGCGTCC+AACTCTTACTCTGAGTGCCCGCCGAGTCATGACGGGTACTGCCTTCACGGTGGTGTTTGTATGTACATTGAAGCTGTTGATTCTTACGCTTGCAACTGCGTTTTCGGTTACGTTGGTGAAAGATGCCAACATAGAGACCTTAAGTGGTGGGAACTTAGA+CATCATCATCATCATCAT。
2.生產(chǎn)權(quán)利要求1所述的綠色添加劑的方法，其特征在于進(jìn)行基因重組和重組蛋白的制備，具體過程為(1)將PEGF修飾基因插入質(zhì)粒載體采用分子生物學(xué)的方法人工合成PEGF基因，該基因含有啟動(dòng)子和終止子，基因經(jīng)過修飾成為植物所偏嗜的密碼子，前端加植物的信號(hào)肽基因，片段兩端為內(nèi)切酶位點(diǎn)(Xba I和sal I)。用相應(yīng)的內(nèi)切酶切表達(dá)載體和目的片段，T4連接酶連接重組，構(gòu)建相應(yīng)的重組質(zhì)粒，然后(2)將上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入植物玉米、水稻、小麥、大豆和油菜中進(jìn)行表達(dá)，獲得轉(zhuǎn)基因植物的種子將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌，于含卡那霉素的LB中培養(yǎng)，離心收集細(xì)胞，于含蔗糖和L6-BA的MS培養(yǎng)液中重懸，再將培養(yǎng)好的植物莖葉浸入含根癌農(nóng)桿菌細(xì)胞的重懸液中真空浸潤(rùn)，用水沖洗，存放至成熟，用含MS、蔗糖和MES的GM和卡那霉素的瓊脂凝膠篩選含PEGF的轉(zhuǎn)基因種子，再(3)取種子種入土壤，獲得可作為飼料添加劑的植物根、莖、葉、果實(shí)或種子。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)的綠色添加劑及其生產(chǎn)方法,添加劑中的活性蛋白是由人工合成的促上皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子修飾基因表達(dá)而成,是在原料作物的根、莖、葉和種子中形成的立體結(jié)構(gòu)的總和,通過將PEGF修飾基因插入質(zhì)粒載體、重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入植物中表達(dá)、不同轉(zhuǎn)基因種子種入土壤獲得可作為飼料添加劑的作物及將含重組活性蛋白的飼料添加飼喂家畜等過程,有效地解決了常規(guī)促生長(zhǎng)添加劑的耐藥性和藥物殘留等問題、具有生產(chǎn)方法簡(jiǎn)單、操作方便,并能明顯改善腸道功能、促進(jìn)腸道消化、促進(jìn)糖、氨基酸、電解質(zhì)等的吸收,促進(jìn)細(xì)胞擴(kuò)散和傷口的愈合及促進(jìn)動(dòng)物卵母細(xì)胞的成熟等功能,廣泛適用于各類動(dòng)物的促進(jìn)生長(zhǎng)之用。
文檔編號(hào)A01N63/00GK1349742SQ0112983
公開日2002年5月22日 申請(qǐng)日期2001年10月27日 優(yōu)先權(quán)日2001年10月27日
發(fā)明者鐘安清, 秦智鋒 申請(qǐng)人:深圳市三方圓信息技術(shù)有限公司