專利名稱：：一種轉(zhuǎn)基因抗棉鈴蟲棉花雜交種的選育方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明一種轉(zhuǎn)基因抗棉鈴蟲棉花雜交種的選育方法，屬于棉花轉(zhuǎn)基因育種方法，專用于轉(zhuǎn)Bt+CpTI雙價(jià)基因抗棉鈴蟲棉花雜交種的選育。我國長江、黃河流域棉區(qū)尚無轉(zhuǎn)Bt+CpTI雙價(jià)基因抗蟲雜交棉品種在生產(chǎn)上大面積推廣種植。本發(fā)明一種轉(zhuǎn)基因抗棉鈴蟲棉花雜交種的選育方法，包括以中國農(nóng)科院生物技術(shù)中心發(fā)放的轉(zhuǎn)Bt+CpTI雙價(jià)基因抗蟲棉“SGK321”為基礎(chǔ)材料，采用卡那霉素抗生素標(biāo)記和Bt+CpTI基因PCR分子標(biāo)記、抗蟲性生物學(xué)測(cè)定方法相結(jié)合檢測(cè)抗蟲性，根據(jù)產(chǎn)量、品質(zhì)、抗蟲性狀進(jìn)行連續(xù)4-5代的系統(tǒng)選育，獲得抗蟲性純合(100％)、皮棉產(chǎn)量比原基礎(chǔ)材料“SGK321”提高9.5％的抗蟲棉品系“SGK321′”。以“SGK321′”為父本，“蘇棉12號(hào)”為母本雜交，培育出轉(zhuǎn)雙價(jià)基因抗蟲雜交種“南抗7號(hào)”。該組合簡單重復(fù)序列(SSR)指紋圖譜具有雙親譜帶的共顯性特征帶。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明所提供的轉(zhuǎn)基因抗棉鈴蟲棉花雜交種的選育方法具有如下優(yōu)點(diǎn)1、本發(fā)明所提供的方法選育了抗蟲性純合(100％)、皮棉產(chǎn)量比原基礎(chǔ)材料提高9.5％的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉品系“SGK321′”。以“SGK321′”為父本，與一系列常規(guī)品種雜交，培育出轉(zhuǎn)基因抗蟲雜交種“南抗7號(hào)”。與傳統(tǒng)育種方法相比，利用本方法培育轉(zhuǎn)基因抗蟲雜交種的年限縮短，從而提高了育種效率。2、選育的新品系“SGK321′”與中國農(nóng)科院生物技術(shù)中心發(fā)放的轉(zhuǎn)Bt+CpTI基因抗蟲棉原基礎(chǔ)材料相比，“SGK321′”的農(nóng)藝性狀有較大改善(見表1)，表1.SGK321′與SGK321農(nóng)藝性狀比較(2000-2001年平均)“SGK321′”對(duì)棉鈴蟲有顯著抗性，苗期葉片對(duì)初孵棉鈴蟲幼蟲的抗性達(dá)100％(原材料存在株間分離，純度為95％左右)。3、育成品種“南抗7號(hào)”的主要優(yōu)點(diǎn)產(chǎn)量高、品質(zhì)好在常規(guī)治蟲情況下，籽棉產(chǎn)量兩年平均為275.4千克/畝，皮棉產(chǎn)量為117.6千克/畝(2000-2001年)。纖維品質(zhì)適合紡織工業(yè)要求，2.5％跨長30.8mm，比強(qiáng)度21.9cN/tex，馬克隆值4.8(表2)。表2.南抗7號(hào)產(chǎn)量、品質(zhì)性狀表(2000-2001年平均，以泗棉3號(hào)、南抗3號(hào)為對(duì)照)高抗棉鈴蟲“南抗7號(hào)”對(duì)棉鈴蟲具有極顯著的抗性，苗期、初花期葉片室內(nèi)喂養(yǎng)棉鈴蟲初孵幼蟲5天后，幼蟲死亡率達(dá)100％，盛花期以后，葉片的室內(nèi)抗蟲性有所下降，對(duì)初孵幼蟲的抗性達(dá)70％-90％。在江蘇省等地試種表明，一、二代棉鈴蟲發(fā)生期可不用化學(xué)防治，三、四代棉鈴蟲發(fā)生期酌情防治1-3次，較常規(guī)品種約減少用藥70％-90％。抗病性強(qiáng)“南抗7號(hào)”高抗枯萎病，耐黃萎病。在人工病圃枯萎病指為0-5，黃萎病指為15-25。綜合性狀好“南抗7號(hào)”具有較好的豐產(chǎn)性和適應(yīng)性，適于長江流域和黃河流域棉區(qū)種植，皮棉畝產(chǎn)90-150千克/畝；皮棉樣品經(jīng)中國農(nóng)科院棉花研究所檢測(cè)，纖維品質(zhì)適合紡織工業(yè)要求；抗病性強(qiáng)?！澳峡?號(hào)”屬性中屬，生育期130天左右。株型為塔形，株高105cm左右，葉片中等大小，葉色較深，結(jié)鈴性強(qiáng)，鈴卵圓形，單鈴重5.6g，籽指9.9g。衣分42.0％以上。吐絮暢，絮白。轉(zhuǎn)Bt+CpTI雙價(jià)基因抗蟲雜交種“南抗7號(hào)”對(duì)棉鈴蟲，紅鈴蟲等棉花主要害蟲具有顯著的抗性，同時(shí)又具有較常規(guī)品種個(gè)體發(fā)育潛力大，單株產(chǎn)量高，適于稀植的特點(diǎn)，雜種優(yōu)勢(shì)十分明顯?！澳峡?號(hào)”還特別適合進(jìn)行棉花與瓜果、蔬菜的間、套作。雜交種種植密度較稀，棉花與間、套作物相互影響少，從而都能取得高產(chǎn)；此外，轉(zhuǎn)基因抗蟲棉田間用農(nóng)藥少，可保證蔬菜、瓜果等的安全?！澳峡?號(hào)”轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的產(chǎn)量水平高，適應(yīng)性廣，在江蘇省、安徽省、河南省、山西省都表現(xiàn)突出，是一個(gè)既適應(yīng)長江流域又適應(yīng)黃河流域棉區(qū)種植的抗蟲棉雜交種，有廣闊的推廣利用前景。“南抗7號(hào)”是一個(gè)轉(zhuǎn)Bt+CpTI雙價(jià)基因抗蟲棉雜交種。由于有2個(gè)抗蟲基因，對(duì)棉鈴蟲的抗性大為增強(qiáng)，同時(shí)棉鈴蟲也不易對(duì)抗蟲棉產(chǎn)生抗性。4、“南抗7號(hào)”雜交種及其親本的SSR指紋圖譜可用于分子鑒定和種子純度的檢測(cè)。這是“南抗7號(hào)”特有的分子檢測(cè)特征，可作為“南抗7號(hào)”的鑒定標(biāo)準(zhǔn)。本發(fā)明所利用的中國農(nóng)科院生物技術(shù)中心發(fā)放的轉(zhuǎn)Bt+CpTI基因抗蟲棉原始基礎(chǔ)材料“SGK321”，經(jīng)濟(jì)性狀一般(畝產(chǎn)僅70千克左右)，抗蟲性存在株間分離(純度為95％左右)。為此，對(duì)該材料進(jìn)行單株選擇和后代鑒定。選擇對(duì)棉鈴蟲抗性純合的單株及株系，并采取多種方法進(jìn)行抗性鑒定?？敲顾貥?biāo)記鑒定將脫脂棉撕成小條沾取500ppm的卡那霉素溶液，粘附于棉花植株倒2新生葉上。5天后所有沾有卡那霉素溶液的感蟲棉株的葉片均出現(xiàn)明顯的黃色斑塊，而轉(zhuǎn)Bt+CpTI基因抗蟲棉的葉片無任何癥狀?？瓜x基因PCR分子標(biāo)記鑒定該技術(shù)是用來測(cè)定個(gè)體內(nèi)是否存在抗蟲基因?？瓜x性生物學(xué)測(cè)定即通過實(shí)驗(yàn)室棉花葉片接蟲及田間接蟲來直接測(cè)定棉花對(duì)棉鈴蟲的抗性。結(jié)果表明，以上3種方法的檢測(cè)結(jié)果高度一致。于是對(duì)抗蟲植株進(jìn)行產(chǎn)量品質(zhì)性狀選擇(優(yōu)中選優(yōu))，選育出轉(zhuǎn)Bt+CpTI基因抗蟲棉品系“SGK321′”。與原基礎(chǔ)材料相比，選育后的“SGK321′”的農(nóng)藝性狀有較大改善(表1)。對(duì)棉鈴蟲有顯著抗性，苗期葉片對(duì)初孵棉鈴蟲幼蟲的抗性達(dá)100％?！癝GK321′”與一些陸地棉高產(chǎn)品種(系)雜交獲F1，各F1進(jìn)行系統(tǒng)的比較試驗(yàn)和多點(diǎn)試驗(yàn)，篩選出雜交組合“南抗7號(hào)”(圖2)?！癝GK321′”為抗蟲親本，另一親本為“蘇棉12號(hào)”?！疤K棉12號(hào)”經(jīng)濟(jì)性狀優(yōu)(表3)，高抗枯萎病(病指5以下)，感黃萎病(病指30以上)，2.5％纖維跨長31.2mm，比強(qiáng)度21.4cN/tex，麥克隆值4.7。“南抗7號(hào)”綜合了雙親的優(yōu)點(diǎn)，既具有抗蟲性，優(yōu)質(zhì)的特點(diǎn)，產(chǎn)量又高于兩個(gè)親本，雜種優(yōu)勢(shì)明顯，并有廣泛的適應(yīng)性。表3.南抗7號(hào)及親本產(chǎn)量、品質(zhì)性狀表(2000-2001年平均，以泗棉3號(hào)、南抗3號(hào)為對(duì)照)“南抗7號(hào)”的主要特點(diǎn)1、產(chǎn)量高、品質(zhì)好示范試驗(yàn)表明，“南抗7號(hào)”具有較好的豐產(chǎn)性和適應(yīng)性，在常規(guī)治蟲情況下，兩年平均“南抗7號(hào)”的籽棉產(chǎn)量為275.4千克/畝，皮棉產(chǎn)量為117.6千克/畝，而對(duì)照“泗棉3號(hào)”分別為236.5千克/畝、101.2千克/畝，對(duì)照“南抗3號(hào)”分別為266.4千克/畝、109.0千克/畝(2000-2001年平均)。2000年“南抗7號(hào)”分別參加了江蘇省特種棉、河南省雜交棉、山西省雜交棉的區(qū)域試驗(yàn)。在常規(guī)治蟲情況下，“南抗7號(hào)”的籽棉產(chǎn)量和皮棉產(chǎn)量均極顯著地超過了當(dāng)?shù)氐膶?duì)照品種(表4)。表4.南抗7號(hào)各區(qū)試點(diǎn)產(chǎn)量性狀表(2000年)“南抗7號(hào)”纖維品質(zhì)適合紡織工業(yè)要求，皮棉樣品經(jīng)中國棉花研究所檢測(cè)(2000年)，長度30.8mm，比強(qiáng)度21.9cN/tex，馬克隆值4.8。2、高抗棉鈴蟲“南抗7號(hào)”對(duì)棉鈴蟲具有極顯著的抗性，苗期、初花期葉片室內(nèi)喂養(yǎng)棉鈴蟲初孵幼蟲5天后，幼蟲死亡率達(dá)100％，盛花期以后，葉片的室內(nèi)抗蟲性有所下降，對(duì)初孵幼蟲的抗性達(dá)70％-90％，對(duì)蕾的抗性下降很小。二代棉鈴蟲發(fā)生期，按每株300頭幼蟲的蟲量接蟲，頂尖、蕾鈴葉片無危害，植株上未發(fā)現(xiàn)存活幼蟲。在江蘇、河南等地試種表明，一、二代棉鈴蟲發(fā)生期可不用化學(xué)防治，三、四代棉鈴蟲發(fā)生期酌情防治1-3次，較常規(guī)品種約減少用藥70％-90％。3、抗病性強(qiáng)試驗(yàn)表明，“南抗7號(hào)”高抗枯萎病，耐黃萎病。在人工病圃枯萎病指為0-5，黃萎病指為15-25。4、綜合性狀優(yōu)“南抗7號(hào)”具有較好的豐產(chǎn)性和適應(yīng)性，適于長江流域和黃河流域棉區(qū)種植，皮棉畝產(chǎn)90-150千克/畝；皮棉樣品經(jīng)中國農(nóng)科院棉花研究所檢測(cè)，纖維品質(zhì)適合紡織工業(yè)要求；抗病性強(qiáng)?！澳峡?號(hào)”屬性中屬，生育期130天左右。株型為塔形，株高105cm左右，葉片中等大小，葉色較深，結(jié)鈴性強(qiáng)，鈴卵圓形，單鈴重5.6g，籽指9.9g。衣分42.0％以上。吐絮暢，絮白?！澳峡?號(hào)”指紋圖譜利用微衛(wèi)星(SSR)分子標(biāo)記手段，構(gòu)建了雜交種及其親本的指紋圖譜。這為“南抗7號(hào)”的純度鑒定，品種的產(chǎn)權(quán)保護(hù)和大面積生產(chǎn)時(shí)保證種子質(zhì)量打下了基礎(chǔ)。具體方法為棉花基因組DNA的分離參考Paterson等(PatersonAH，BrubakerCL，WendelJF.Arapidmethodforextractionofcotton(Gossypiumspp.)genomicDNAsuitableforRFLPorPCRanalysis.PlantMolecularBiologyReporter，1993，11(2)122-127)的方法提取基因組DNA。微衛(wèi)星的PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系(67mMTris-HCL(pH8.8)，16mM(NH4)2SO4，0.002％明膠，0.2mMdNTPs，2.5mMMgCL2，正向引物和反向引物(MapPairsTM產(chǎn)品)各0.6uM，0.25uTaqDNA聚合酶(上海Sangon公司產(chǎn)品)，模板DNA20ng)10ul，反應(yīng)程序?yàn)?5℃變性2分鐘；94℃變性40秒、57℃退火45秒、72℃延伸60秒，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸7分鐘。擴(kuò)增產(chǎn)物的PAGE/銀染檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，凝膠濃度10％，凝膠大小為180×120×2mm，電泳緩沖液為1×TBE，恒壓電泳。電泳結(jié)束后，凝膠用蒸餾水稍微沖洗。銀染方法參考吳冠蕓等(吳冠蕓潘華珍吳翚主編，生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)常用數(shù)據(jù)手冊(cè)，P263?？茖W(xué)出版社，1999)介紹的方法。雜交種的SSR指紋圖譜“南抗7號(hào)”雜交種及其親本的SSR指紋圖譜見圖1，箭頭所示的是雜交種具有雙親譜帶的共顯性特征帶。SSR1231標(biāo)記可將“南抗7號(hào)”雜交種與它的親本及其它栽培品種加以區(qū)分，因而可用于這些雜交種的分子鑒定和種子純度的檢測(cè)。這是“南抗7號(hào)”特有的分子檢測(cè)特征，可作為“南抗7號(hào)”的鑒定標(biāo)準(zhǔn)。權(quán)利要求1.一種轉(zhuǎn)基因抗棉鈴蟲棉花雜交種的選育方法，包括1)以中國農(nóng)科院生物技術(shù)中心發(fā)放的轉(zhuǎn)Bt+CpTI基因抗蟲棉“SGK321”為基礎(chǔ)材料，采用卡那霉素抗生素標(biāo)記和Bt+CpTI基因PCR分子標(biāo)記、抗蟲性生物學(xué)測(cè)定方法相結(jié)合檢測(cè)抗蟲性；2)根據(jù)產(chǎn)量、品質(zhì)、抗蟲性狀進(jìn)行連續(xù)4-5代的系統(tǒng)選育，獲得抗蟲性純合(100％)、皮棉產(chǎn)量比原基礎(chǔ)材料“SGK321”提高9.5％的抗蟲棉品系“SGK321′”；3)以“SGK321”為父本，“蘇棉12號(hào)”為母本雜交，培育出畝產(chǎn)皮棉90-150千克的轉(zhuǎn)Bt+CpTI雙價(jià)基因抗蟲雜交種(南抗7號(hào))。2.據(jù)權(quán)利要求1所述的一種轉(zhuǎn)基因抗棉鈴蟲棉花雜交種的選育方法，其特征在于，以上述方法育成的轉(zhuǎn)Bt+CpTI雙價(jià)基因抗棉鈴蟲棉花雜交種(南抗7號(hào))簡單重復(fù)序列(SSR)指紋圖譜具有雙親譜帶的共顯性特征帶。全文摘要本發(fā)明一種轉(zhuǎn)基因抗棉鈴蟲棉花雜交種的選育方法,專用于轉(zhuǎn)Bt+CpTI雙價(jià)基因抗棉鈴蟲棉花雜交種的選育。對(duì)轉(zhuǎn)基因抗蟲棉“SGK321”進(jìn)行抗蟲性鑒定、選育,獲得抗蟲性純合(100%)、皮棉產(chǎn)量比原材料提高9.5%的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉“SGK321′”。以“SGK321′”作父本,“蘇棉12號(hào)”作母本選育出抗蟲雜交種“南抗7號(hào)”。該雜交種產(chǎn)量高(畝產(chǎn)皮棉90－150千克),高抗棉鈴蟲且能克制棉鈴蟲對(duì)棉花可能產(chǎn)生的抗性(圖1為南抗7號(hào)及親本的SSR1231指紋圖譜)。文檔編號(hào)A01H1/00GK1373992SQ0211696公開日2002年10月16日申請(qǐng)日期2002年4月28日優(yōu)先權(quán)日2002年4月28日發(fā)明者張?zhí)煺?朱協(xié)飛,唐燦明,郭旺珍申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)