一種評價轉基因抗蟲水稻水生環(huán)境安全性的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及轉基因作物生態(tài)風險評價技術領域，具體涉及一種評價轉基因抗蟲水 稻水生環(huán)境安全性的方法。
【背景技術】
[0002] 水稻是我國的主要農(nóng)作物之一，通過轉基因育種方法增強水稻自身的抗性為病蟲 害防治提供了高效的解決途徑。目前已經(jīng)成功地培育出了一批具有高產(chǎn)、抗病蟲以及抗除 草劑等性狀的轉基因水稻品種，其中一些轉基因水稻品系已經(jīng)進入了環(huán)境釋放試驗等國家 生物安全評價階段，為我國的糧食安全保障提供了技術儲備。然而，轉基因作物的種植可能 會帶來一系列的安全問題，因而引起了全球的廣泛關注和爭論。由于水稻在我國的重要性， 環(huán)保和農(nóng)業(yè)等部門對轉基因水稻安全性的關注似乎超出任何一個其它轉基因作物，有關轉 基因水稻生態(tài)風險評價的研宄受到了高度重視。
[0003] 近年來，就一些轉基因抗蟲水稻品系的基因漂流、靶標害蟲的抗性風險、對非靶標 生物和稻田節(jié)肢動物群落的影響以及毒蛋白在土壤中的殘留等方面已經(jīng)取得了一些進展， 為轉基因水稻的安全性評價積累了一定的經(jīng)驗和技術。以往的研宄多數(shù)只限于考查轉基因 抗蟲水稻對稻田節(jié)肢動物的影響，而很少對稻田淡水生態(tài)系統(tǒng)中其它重要的類群一一水生 原生動物（魚類的重要餌料）加以關注。對于轉基因水稻的大規(guī)模種植是否會對水體原生 動物群落帶來不利影響，有多大的影響，目前這方面的研宄報道和結果積累甚少。因此，在 評價轉基因水稻環(huán)境安全的過程中，有必要補充和加強對水生環(huán)境安全影響的部分。
[0004] 轉基因作物對土壤生態(tài)系統(tǒng)的影響是近年來關注的一個焦點，因為土壤是物質和 能量循環(huán)的重要場所，外源蛋白最先進入土壤，理論上土壤生態(tài)系統(tǒng)最可能受到潛在的負 面影響。2000 年，美國 EPA(US Environmental Protection Agency)將轉基因作物對土壤 生態(tài)系統(tǒng)的影響列為風險評價的重要組成部分，轉基因作物對土壤生態(tài)系統(tǒng)的影響是繼轉 基因作物與近緣物種基因流、目標害蟲抗性問題和對非目標生物影響之后的又一個熱點問 題。一項新研宄表明大面積種植轉基因玉米可能會對附近水生生態(tài)系統(tǒng)造成影響。該研宄 證明轉基因玉米的花粉及其他部分可以流入玉米地周圍的溝渠中，并用試驗揭示轉基因玉 米的附產(chǎn)物可增加一種被稱作石蛾的水生昆蟲的死亡率，降低其增長率。
[0005] 在我國的許多地方，稻田和魚塘往往交織在一起，而且素有稻田養(yǎng)魚、稻鴨共生等 傳統(tǒng)生態(tài)種植模式，再加上水稻田的特殊灌溉方式，即從上游田到下游田的串聯(lián)灌溉。如果 轉基因水稻存在對水體生態(tài)系統(tǒng)存在類似轉基因玉米的安全性問題，則極易波及到下流的 水田和魚塘生態(tài)系統(tǒng)。因此，轉基因水稻對水田及下游水生生態(tài)系統(tǒng)是否有安全性問題更 加值得注意。
[0006] 中國專利CN104361251A中涉及轉基因棉花對生物安全性評價的方法，通過架設 頻振式殺蟲燈誘集棉田昆蟲的成蟲；通過肉眼調查整株棉花上的體形較大的節(jié)肢動物；采 用吸蟲器吸取棉花全株以及地面范圍內的所有體形較小的節(jié)肢動物；利用體式顯微鏡檢驗 吸蟲器收集回的節(jié)肢動物進行分類。沒有涉及對水生浮游動物安全性評價的內容。
[0007] 中國專利CN104133054A提供了一種評價轉基因棉花對大草蛉影響的生物測定方 法，用取食轉基因棉花葉片1-3天的棉鈴蟲幼蟲飼喂大草蛉幼蟲；觀察大草蛉幼蟲生長發(fā) 育情況，從而評價轉基因棉花對大草蛉的影響，該生物測定方法適用廣泛，對利用"轉基因 植物-害蟲-捕食性天敵"營養(yǎng)關系評價轉基因植物中高劑量蛋白對捕食性天敵的影響都 能夠進行有效測定。
[0008] 中國專利CN102986462A涉及一種利用雙斑青步甲評價轉Bt基因棉花抗蟲性的檢 測方法。該方法利用棉田生態(tài)系統(tǒng)中的食物鏈關系、即雙斑青步甲-棉鈴蟲-棉花，以捕食 者種群的數(shù)量反映轉Bt基因棉花對靶標生物-鱗翅目昆蟲（棉鈴蟲）的致死程度。在多 年種植轉Bt棉花棉田和對照棉花棉田內，利用陷阱法和引誘劑法相結合誘捕雙斑青步甲， 比較兩種棉花棉田內的雙斑青步甲數(shù)量。沒有涉及對水生浮游動物安全性評價的內容。
[0009] 中國專利CN102948399A涉及一種水生生物大型蚤的飼養(yǎng)方法?？朔藗鹘y(tǒng)大型 蚤毒理實驗技術的缺陷，建立了一套純稻米飼養(yǎng)大型蚤的方法，包括：營養(yǎng)液配置，米粉溶 液配置，幼蚤的飼養(yǎng)和收集。本發(fā)明使用純稻米飼養(yǎng)大型蚤，克服了常規(guī)方法中大型蚤選擇 性攝取綠藻等天然食物而不取食或很少取食稻米的缺陷；且消除了因綠藻營養(yǎng)成分不確定 而易影響實驗結果的不利因素，為評價轉基因水稻安全性提供了可靠的實驗保障。此方法 只適用于轉基因植物環(huán)境安全室內評價。
[0010] 中國專利CN102169117A涉及一種基于模糊數(shù)學和典范對應分析方法來評價轉基 因植物種植對土壤微生態(tài)影響的技術體系及其應用。提供了一種綜合考慮土壤微生物與物 理化學指標的評價方法，應用該方法可有效評價轉基因作物種植對土壤微生態(tài)系統(tǒng)帶來的 影響。沒有涉及對水生浮游動物安全性評價的內容。
[0011] 從以上分析可以看出，對轉基因抗蟲水稻環(huán)境安全評價僅強調了對地上生態(tài)系統(tǒng) 的影響，對土壤生物以及水生生物的影響研宄較少。理論上，轉基因抗蟲水稻的毒蛋白可 以通過根系的分泌進入土壤和水體，也可以通過水稻的碎肩甚至是地上部分的殘體進入土 壤，從而對地下或水生微小生物和小型動物產(chǎn)生影響。因此，亟需發(fā)明一種適用于對水生生 物安全評價的方法。

【發(fā)明內容】

[0012] 本發(fā)明的目的是提供一種評價轉基因抗蟲水稻水生環(huán)境安全性的方法，通過設計 稻田布置、水層和淤泥中外源蛋白的測定、浮游生物的分離與測定等步驟，可以系統(tǒng)地評估 轉基因抗蟲水稻的水生環(huán)境安全性。
[0013] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術方案如下：
[0014] 一種評價轉基因抗蟲水稻水生環(huán)境安全性的方法，包括如下過程：
[0015] (1)轉基因稻田和非轉基因稻田布置和管理；
[0016] (2)稻田水層和淤泥中外源蛋白的測定；
[0017] (3)稻田水層中浮游生物的分離；
[0018] (4)稻田水層中浮游生物種類和豐度的測定；
[0019] (5)轉基因抗蟲水稻的種植對浮游生物的安全性評價。
[0020] 根據(jù)以上方案，所述轉基因稻田和非轉基因稻田布置和管理包括如下步驟：
[0021] 1)選擇地勢平整、水源方便的田塊3至5塊（即用于環(huán)境安全評價的3至5次重 復），田塊面積400-600m2,長寬比范圍2 : 1至I : 1，田周邊及水源無生活污水污染；
[0022] 2)將步驟1)中的田塊劃分成小區(qū)，田塊周圍筑不透水田埂及硬化溝渠；為防止暴 雨漫灌，田塊周邊建立良好排水溝；
[0023] 3)在步驟2)中的上游小區(qū)種植轉基因抗蟲水稻，下游小區(qū)種植非轉基因水稻，中 間兩塊非轉基因小區(qū)用上游轉基因小區(qū)的田水灌溉，兩側的兩塊小區(qū)直接用水源中的水灌 溉；
[0024] 4)從移栽至成熟期，不施用化學農(nóng)藥，人工除草，中期不曬田。
[0025] 根據(jù)以上方案，所述田塊劃分成小區(qū)的具體方案為：靠近水源的上游小區(qū)并列設 置兩塊轉基因小區(qū)，位于轉基因小區(qū)下游的下游小區(qū)并列設置4塊非軒基因小區(qū)；所述兩 塊轉基因小區(qū)的上游與水源之間分別設立連通溝渠、下游分別與中間的兩塊非轉基因小區(qū) 通過溝渠連通；所述非轉基因小區(qū)的外側兩塊分別通過溝渠與所述水源連通；所述4塊非 軒基因小區(qū)分別設置排水溝渠。
[0026] 根據(jù)以上方案，所述稻田水層和淤泥中外源蛋白的測定，包括樣本的預處理和外 源蛋白的抽提與通過酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA法）測定，具體包括如下步驟：
[0027] 1)水樣采集及預處理：水樣采集小區(qū)包括所有轉基因小區(qū)和非轉基因小區(qū)，用 IOml離心管進行田間水樣采集，各小區(qū)分別取5管，取上層清水，拿回室內，將每份樣品轉 到新的IOml離心管中，然后進行冷凍，冷凍后封上封口膜，用針頭在膜上扎空，然后放入冷 凍干燥機進行濃縮至干；將干燥后的樣品放入4°C低溫保存，24小時內待測；
[0028] 2)淤泥樣品采集及預處理：土樣采集小區(qū)包括所有轉基因小區(qū)和非轉基因小區(qū)， 各拔5蔸水稻取根圍淤泥，裝入50ml離心管，帶回室內放入-20°C冰箱冷凍，然后放入冷凍 干燥機進行濃縮至干，將干燥后的淤泥碾碎，過80目篩除去根毛，準確稱取每份樣品0. 5g， 轉入到I. 5ml離心管中，放入4°C低溫保存，24小時內待測；
[0029] 3)外源蛋白抽提緩沖液配制：100mM Na2CO3, IOOmM NaCl，5mM乙二胺四乙酸，IOmM 二硫蘇糖醇，50mM Na4P2O7* IOH20,1% (v/v)聚乙二醇辛基苯基醚，pH值為1