專利名稱：棉花纖維的類β微管蛋白及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物蛋白及其編碼基因與應(yīng)用，特別是涉及棉花纖維的類β微管蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。
1992年，John和Crow克隆并分析了第一個(gè)纖維特異表達(dá)基因E6，掀起了克隆纖維特異基因的熱潮。E6轉(zhuǎn)錄子在纖維發(fā)育的整個(gè)過程中都能檢測到。E6的mRNA和蛋白濃度在初生壁合成晚期和次生壁合成早期最高，未發(fā)現(xiàn)與E6基因同源的已知原核或真核基因。然而，將反義基因轉(zhuǎn)入棉花中[John，1996]，未發(fā)現(xiàn)纖維的發(fā)育和品質(zhì)有明顯的表型變化，表明E6基因?qū)τ诶w維的正常發(fā)育和結(jié)構(gòu)完整不是至關(guān)重要的。
1995年，Delmer等克隆到棉纖維特異的GTP結(jié)合蛋白基因Rac13，在發(fā)育的纖維中高效表達(dá)，在由伸長期向次生細(xì)胞壁合成轉(zhuǎn)換期表達(dá)量最高，此時(shí)細(xì)胞骨架正進(jìn)行重新組織。因此Rac13可能在細(xì)胞骨架組織的信號(hào)傳遞中發(fā)揮作用。
1995年，John 克隆到一纖維高表達(dá)基因B6，長1.2kb，它在初生壁和次生壁合成階段都有表達(dá)，蛋白有一個(gè)疏水N末端和兩個(gè)富含Pro的區(qū)域。并獲得了上游2.3kb啟動(dòng)子區(qū)，能引導(dǎo)GUS的瞬時(shí)表達(dá)。但該基因的功能不詳。
1995年，John和Keller 克隆到纖維特異表達(dá)的基因H6，蛋白中富含Pro，存在17個(gè)五氨基基元(motif)Ala(Ser)-Thr(Ser)-Pro-Pro-Pro。其mRNA在初生壁形成早期聚集，但其蛋白在初生壁形成晚期即次生壁合成期開始時(shí)聚集，表明H6可能存在翻譯水平的調(diào)節(jié)并在次生壁裝配中發(fā)揮作用。從它的氨基酸組成和可溶性推測它可能屬于阿拉伯半乳糖蛋白(AGP)，作為細(xì)胞膜嵌入成分參與棉花纖維次生壁的發(fā)育和構(gòu)架。
1995年，Ma等克隆到GH3，它編碼一脂轉(zhuǎn)移蛋白(LTP)，可能定位于纖維細(xì)胞外膜。GH3基因受發(fā)育調(diào)控，在伸長期表達(dá)量最高，可能參與跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)幾丁質(zhì)單體，促進(jìn)幾丁質(zhì)合成。
1996年，Reinhart等克隆到棉纖維特異表達(dá)的基因FbL2A。它的表達(dá)受發(fā)育調(diào)控，在初生壁合成晚期和次生壁合成早期被激活。該基因編碼一個(gè)43.4KD的蛋白，除N端疏水外高度親水，62％由重復(fù)基元組成，有一個(gè)55氨基酸的區(qū)域重復(fù)4次之多。該蛋白在纖維細(xì)胞中的功能不詳。
1997年，Ma等克隆到脂轉(zhuǎn)移蛋白Ltp6基因，與GH3的氨基酸同源性為64％。Ltp6也在纖維細(xì)胞中伸長期表達(dá)量最高，只是表達(dá)水平低些。1999年，Hsu等分離到Ltp6的啟動(dòng)子，Ltp6啟動(dòng)子具有組織表達(dá)特異性。
1997年，Oxford和Timmis克隆到脂轉(zhuǎn)移蛋白FS6(LTP)和一富含Pro蛋白(PRP)FS17，兩者都在纖維發(fā)育早期高表達(dá)。存在的信號(hào)肽序列表明，LTP和PRP都定位于纖維的胞外基質(zhì)中。FS6與以前發(fā)現(xiàn)的棉花LTP GH3[Ma et al.，1995]氨基酸同源性為88％，但兩者疏水性差別很大。FS17可能有強(qiáng)化細(xì)胞壁的功能，它與細(xì)胞壁復(fù)雜的結(jié)構(gòu)相連接，快速伸長的纖維細(xì)胞中富含F(xiàn)S17，可能與這種生長需要持續(xù)供應(yīng)壁物質(zhì)有關(guān)，存在典型的PRP重復(fù)基元(motif)PPVYK，與以前報(bào)道的富含Pro蛋白H6[John and Keller，1995]無顯著相似性。另一纖維特異未知功能的蛋白B6[John，1995]，有兩個(gè)富含Pro的區(qū)域，但這兩個(gè)區(qū)域都與FS17中的重復(fù)序列不相似。
1997年，Song和Allen克隆到棉纖維特異表達(dá)的基因?；d體蛋白(ACP)。Northern blot表明該基因在纖維伸長期高效表達(dá)，Southern blot分析發(fā)現(xiàn)單拷貝的ACP可能在棉花A和D基因組中都存在，在進(jìn)化過程中，ACP基因家族的一員特異表達(dá)成為纖維，可能為迅速伸長的纖維合成膜脂。
1998年，Kawai等克隆到GhCAP(adenyl cyclase-associated)基因。GhCAP編碼471aa的讀碼框。Northern blot表明GhCAP主要在纖維伸長期表達(dá)。GhCAP在微絲組織中起作用，可能在細(xì)胞骨架重組中起信號(hào)傳遞作用。
1998年，Oxford和Timmis克隆到pGhEX1。它編碼expansin。該基因只在棉纖維中表達(dá)，在伸長期受發(fā)育調(diào)控，即16DPA時(shí)最高，之后下降。研究表明它可能與植物細(xì)胞膨壓驅(qū)動(dòng)的生長有關(guān)，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)棉纖維細(xì)胞基因表達(dá)在轉(zhuǎn)錄水平上受到調(diào)控。
1999年，Loguercio等克隆到幾個(gè)可能與棉花纖維分化及發(fā)育相關(guān)的myb類基因。研究了6個(gè)屬于R2R3-MYB家族的棉花myb類基因(GhMYB)在異源四倍體陸地棉中的表達(dá)特性。在反式調(diào)節(jié)區(qū)內(nèi)發(fā)現(xiàn)了可能調(diào)節(jié)GhMYB活性的幾個(gè)結(jié)構(gòu)域和基元。一個(gè)是存在于5個(gè)GhMYB中的恰好位于DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DBD)下游的40個(gè)氨基酸的堿性區(qū)域(TRR1)。并且，存在于一類植物MYB中的保守基元GIDxxH也存在于GhMYB1和GhMYB6TRR1結(jié)構(gòu)域的同一位置。至少兩個(gè)GhMYBs(GhMYB4和GhMYB5)在5’前導(dǎo)序列(5’-uORFs)有未定性的讀碼框，可能在翻譯水平調(diào)節(jié)這些GhMYB蛋白的合成。多個(gè)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DBD)的存在表明GhMYB與苯丙酸合成相關(guān)的植物R2R3-MYB有結(jié)構(gòu)相似性。GhMYB5是與棉花R2R3-MYB關(guān)系最遠(yuǎn)的，與干旱誘導(dǎo)的AtMYBG11同處于一個(gè)孤立的基因簇。除了保守的基元外，序列分析并未發(fā)現(xiàn)GhMYB、MIXTA(AmMYBMx)和G11(AtMYBG11)在DBD和TRR有其他相似性。然而進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，GhMYB2、GhMYB3和GhMYB4屬于包括GLABROUS1的基因簇，而GhMYB1和GhMYB6屬于關(guān)系近的基因簇。半定量RT-PCR分析顯示，GhMYB基因表達(dá)有兩個(gè)不同的類型一型GhMYB(GhMYB-1，-2和-3)轉(zhuǎn)錄子在所有組織中都有，并且比二型豐度高；二型GhMYB(GhMYB-4，-5和-6)在纖維中高表達(dá)。GhMYB表達(dá)的發(fā)育調(diào)控與這些DNA結(jié)合因子在纖維分化和伸長中的功能一致。
1999年，Oxford等克隆到一全長cDNA克隆FS18，它是只編碼71個(gè)氨基酸的蛋白，與LTP有一些相似性，功能不詳。該基因在纖維中高表達(dá)，尤其突出的是它在次生壁合成開始和以后(18-24DPA)表達(dá)量最高。
2001年，Cui等克隆到新基因CFL1，該基因與FKS1酵母β-1，3-葡聚糖(胼胝質(zhì))合酶催化亞基同源。CFL1在纖維初生壁合成期高表達(dá)，它在幼根中表達(dá)量也較高。序列分析和CaM-gel overlay assay推測在它親水性的N末端有一CaM結(jié)合位點(diǎn)。Product-entrapment assay顯示，該蛋白能與體外合成的胼胝質(zhì)沉淀結(jié)合。CFL1是酵母β-1，3-葡聚糖合酶催化亞基FKS1的植物同系物，可能在胼胝質(zhì)合成中起作用。
2001年，Zhao等克隆到10個(gè)纖維特異cDNA。其中5個(gè)分別編碼二磷酸核甘酸酶(bisphosphate nucleotidase)、α-tubulin、β半乳糖甘酶、膜連蛋白(annexin)和可逆糖基化多肽；另5個(gè)功能未定。這10個(gè)cDNA都在纖維細(xì)胞高效表達(dá)，絕大多數(shù)在纖維發(fā)育的早期累積，除了F14，它在纖維發(fā)育晚期表達(dá)量最高。
2001年，Tan等克隆了一個(gè)在棉花纖維和根尖組織中特異表達(dá)的基因ghprp1(proline-rich proteins)，該基因編碼一個(gè)299個(gè)氨基殘基的蛋白質(zhì)，在該蛋白的N端有一疏水信號(hào)肽。該基因存在于棉花基因組的A1，A2，D1和D5染色體上。
2002年，Zhao等從棉花纖維中克隆到GhRGP1(reversibly glycosylated polypeptide)基因，該基因編碼一個(gè)359個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)該基因僅在棉花纖維中表達(dá)，并在伸長期和增厚期大量表達(dá)，該蛋白可能參與了細(xì)胞壁的非纖維多聚糖的生物合成。
雖然對(duì)棉花纖維發(fā)育和伸長方面已經(jīng)作了大量深入細(xì)致的工作，由于棉花纖維發(fā)育和伸長調(diào)節(jié)方面的復(fù)雜性，仍有大量未知的領(lǐng)域有待研究。
本發(fā)明所提供的棉花纖維類β微管蛋白的名稱為Gh-BtubL，是具有序列表中序列2氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，或者是將序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列2的氨基酸殘基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。
序列表中序列2的蛋白質(zhì)由444個(gè)氨基酸殘基組成。
棉花纖維類β微管蛋白Gh-BtubL的編碼基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)與序列表中序列1限定的DNA序列具有85％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
序列1的基因由1580個(gè)堿基組成，該基因的讀碼框?yàn)樽?’端第1到第1335位共1335個(gè)堿基。編碼一個(gè)類β微管樣蛋白Gh-BtubL，和棉花纖維伸長密切相關(guān)，具有使細(xì)胞伸長的功能，和細(xì)胞壁的徑向伸長具有密切關(guān)系，在棉花纖維發(fā)育的啟始期開始轉(zhuǎn)錄，并在伸長期大量轉(zhuǎn)錄。
棉花纖維的發(fā)育和伸長是一個(gè)復(fù)雜的代謝調(diào)控過程，由上百個(gè)基因參與，目前僅克隆到三十多個(gè)與之相關(guān)的基因，其中了解功能的基因有十幾個(gè)。本發(fā)明所提供的Gh-BtubL基因，在棉花纖維中特異表達(dá)，具有促進(jìn)真核細(xì)胞增長的功能。
本發(fā)明證實(shí)，帶有正向Gh-BtubL基因的裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)表現(xiàn)出十分明顯的生理特征，改變了酵母細(xì)胞的形態(tài)特征。正常情況下，在穩(wěn)定期裂殖酵母細(xì)胞的長度約為10μm，然后開始二分分裂進(jìn)行繁殖，而正向表達(dá)Gh-BtubL基因的酵母在誘導(dǎo)表達(dá)20小時(shí)后，其菌體長度可達(dá)到18μm左右，比野生型酵母的長度增加了約1.7倍。
根據(jù)β-tubulin基因的正常功能推斷，Gh-BtubL是微管的一種組成蛋白，在細(xì)胞的許多生命活動(dòng)中發(fā)揮重要功能，例如在植物細(xì)胞中，微管參與細(xì)胞分裂、胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸和細(xì)胞壁的形成等生物過程，所以如果將本發(fā)明的Gh-BtubL全長基因或其功能性融合基因按正向模式連接到如纖維特異性表達(dá)啟動(dòng)子、酵母/大腸桿菌的穿梭質(zhì)粒pREP5N的nmt1啟動(dòng)子或35S啟動(dòng)子那樣能在各種植物組織和器官中高效表達(dá)的啟動(dòng)子的下游，構(gòu)建成植物轉(zhuǎn)化中間載體，然后用農(nóng)桿菌法、基因槍法或花粉管通道法將該基因?qū)肴~類經(jīng)濟(jì)作物基因組中、并篩選在整個(gè)生長期高效表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株，Gh-BtubL基因所介導(dǎo)的持續(xù)而旺盛的細(xì)胞伸長和分裂可能會(huì)大幅度提高轉(zhuǎn)基因植物的單位面積綠色營養(yǎng)組織的產(chǎn)量，顯著提高葉菜類經(jīng)濟(jì)作物的經(jīng)濟(jì)效益。如果將構(gòu)建的植物轉(zhuǎn)化中間載體用農(nóng)桿菌法、基因槍法或花粉管通道法導(dǎo)入竹子等草本植物基因組中，并篩選在整個(gè)生長期高效表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株，Gh-BtubL基因所介導(dǎo)的持續(xù)而旺盛的細(xì)胞伸長和分裂可能會(huì)大幅度提高轉(zhuǎn)基因植物的生長速度和植株高度，顯著提高竹子等草本類植物的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和效益。如果將構(gòu)建的植物轉(zhuǎn)化中間載體用農(nóng)桿菌法、基因槍法或花粉管通道法導(dǎo)入麻等纖維植物基因組中，并篩選在整個(gè)生長期高效表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株，Gh-BtubL基因所介導(dǎo)的持續(xù)而旺盛的細(xì)胞伸長和分裂可能會(huì)大幅度提高轉(zhuǎn)基因植物的纖維生長速度和長度，顯著提高麻等纖維植物的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和效益。本發(fā)明的Gh-BtubL基因具有重要的學(xué)術(shù)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。為實(shí)現(xiàn)人為控制植物細(xì)胞伸長奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
圖2為Gh-BtubL mRNA表達(dá)水平及其與纖維伸長關(guān)系的分析。
圖3為Gh-BtubL在陸地棉和fls突變體胚珠橫切面上的原位雜交結(jié)果。
圖4為裂殖酵母表達(dá)載體的圖譜。
用cDNA差式分析法進(jìn)行棉花纖維特異基因克隆的基本步驟為1、提取野生株和fls突變株細(xì)胞內(nèi)的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA以后用四堿基切割酶消化，以降低整個(gè)cDNA群體的復(fù)雜性；2、分別將上述兩組cNDA加上不同的接頭序列后按1∶100(野生株∶突變株)的比例混合，95℃高溫處理使DNA變性為單鏈，再緩慢降溫到68℃并維持12小時(shí)，使體系中的DNA重新成為雙鏈；3、PCR擴(kuò)增。由于突變株和野生株細(xì)胞中的絕大部分mRNA是相同的，根據(jù)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)原理，野生株樣品中絕大部分cDNA將與突變株樣品形成雜合雙鏈，只有在棉花纖維中特異表達(dá)的基因，因?yàn)闊o法在突變株的樣品中找到互補(bǔ)的cDNA鏈，無法形成雜合雙鏈的樣品，絕大部分cDNA只能按線性形式擴(kuò)增(因?yàn)橹挥幸粭l鏈上帶有與引物相匹配的接頭序列，另一條鏈來自突變株的樣品，不能與所用的引物相互補(bǔ))。由于棉花纖維特異表達(dá)基因的兩條鏈上都有與引物相匹配的接頭序列，它們能被按指數(shù)形式擴(kuò)增，經(jīng)過20-15個(gè)循環(huán)，棉花特異表達(dá)基因被富集數(shù)十萬至上百萬倍，而非特異性表達(dá)的僅僅增加20-25倍。經(jīng)過重復(fù)性雜交和PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系中幾乎百分之百都是棉花纖維中特異表達(dá)的基因片段；4、克隆這些片段后用Northern雜交法驗(yàn)證其表達(dá)特性并以其中一個(gè)片段為探針，篩選棉花纖維cDNA減法文庫，獲得棉花纖維特異性表達(dá)基因Gh-BtubL。
5、通過RT-PCR和機(jī)械手點(diǎn)樣雜交。根據(jù)操作手冊(cè)用S.N.A.P.TMTotal RNAisolation Kit(Invitrogen，USA)從野生棉花的纖維、根、莖、葉和無纖維棉花種子突變體(fls)的胚珠中分別提取總RNA，以5μg總RNA為模板根據(jù)操作手冊(cè)用SUPERSCRIPTTM第一條鏈合成系統(tǒng)合成cDNA第一條鏈，然后以此為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用棉花泛素(Ubiquitin)作陽性對(duì)照。擴(kuò)增產(chǎn)物通過Biomek2000 LaboratoryAutomation workstation(Beckman Coulter Inc.，USA)將PCR產(chǎn)物點(diǎn)在尼龍膜上，用33P標(biāo)記DNA探針，雜交后，用磷屏(Molecular Dyanmics，USA)暴光，數(shù)據(jù)使用ArrayVision 6.0(Imaging Research Inc.，USA)軟件分析，結(jié)果如圖2所示，其中陸地棉纖維(UF)用0-20DPA(開花后天數(shù))衡量，從圖中可以看出本發(fā)明基因表達(dá)的變化趨勢，即該基因在棉花纖維發(fā)育的啟始期開始轉(zhuǎn)錄，并在伸長期大量轉(zhuǎn)錄。
6、原位雜交。根據(jù)Ruan和Chourey的程序?qū)⒃浑s交的樣品用石蠟包埋切片。棉花胚珠樣品采集后立即用FAA(Formalin-Acetic Acid)固定液固定，然后用系列叔丁醇脫水，最后用石蠟包埋，切片。用DIG標(biāo)記的DNA探針和切片雜交，結(jié)果如圖3所示。其中，A是與利用Gh-BtubL cDNA合成的反義RNA探針雜交的陸地棉胚珠橫切面，藍(lán)色信號(hào)表示Gh-BtubL mRNA的存在；B是與上述探針雜交的fls突變體的胚珠的橫切面；C是與利用Gh-BtubL cDNA合成的正義RNA探針雜交的陸地棉胚珠橫切面。D是與利用棉花泛素(ubiquitin)cDNA合成的反義RNA探針雜交的陸地棉胚珠橫切面，圖中F是纖維細(xì)胞；oi是外珠被(outer integument)；ii是內(nèi)珠被(innerintegumen)。從圖中可以看出，在棉花野生株胚珠外珠被成纖維泡狀細(xì)胞中出現(xiàn)很強(qiáng)的雜交信號(hào)，而在其它外珠被表皮細(xì)胞和fls突變體細(xì)胞中檢測不到雜交信號(hào)，顯示本發(fā)明基因的表達(dá)具纖維特異性。
實(shí)施例2、本發(fā)明基因在裂殖酵母中的表達(dá)將用實(shí)施例1方法所克隆的Gh-BtubL基因按正方向插入酵母和大腸桿菌穿梭質(zhì)粒pREP5N，構(gòu)建載體pREP-Btub1(+)(其圖譜如圖4所示)，轉(zhuǎn)化裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)，用限制性培養(yǎng)基篩選陽性克隆子。
該實(shí)施例中所用的培養(yǎng)基及試劑包括1、培養(yǎng)基(對(duì)S.P.Q-01，補(bǔ)加腺嘌呤和尿嘧啶)酵母浸提物(Yeast Extract) 5g葡萄糖(Glucose) 30g腺嘌呤(Adenine 50×)20ml尿嘧啶(Uracil 50×)20ml加水定容至1L，固體培養(yǎng)基加瓊脂至終濃度為20g/L。
2、限制性(MM)培養(yǎng)基(對(duì)S.P.Q-01，補(bǔ)加腺嘌呤和尿嘧啶)組分 添加量 最終濃度鄰苯二鉀酸氫鉀(KH Phthlate) 3g 14.7mMNa2HPO4 2.2g 15.5mM谷氨酸鈉(Glutamate monosodium) 5g 5g/L葡萄糖(Glucose) 20g111mM鹽類母液(Salts Stock 50×) 20ml 1×礦質(zhì)母液(Mineral Stock 10,000×) 0.1ml 1×維生素母液(Vitamins Stock 1,000×) 1ml1×腺嘌呤(Adenine 50×) 20ml 1×尿嘧啶(Uracil 50×) 20ml 1×加水定容至1升，固體培養(yǎng)基加瓊脂至終濃度為20g/L，10Psi/15-20min滅菌。
3、鹽類母液(Salts Stock 50×)組分 添加量(g) 最終濃度(mM)MgCl2-6H2O 53.35.2CaCl2-2H2O 0.735 0.1
KCl 50 13.4Na2SO42 0.28用50ml水分別溶解各組分，混合后定容至1L，凍存或分裝成小體積4℃保存。
4、礦物質(zhì)母液(Mineral Stock 10,000×)組分 添加量(g)最終濃度(μM)H3BO30.5 8.1MnSO40.4 2.37ZnS04-7H2O 0.4 1.39FeCl3-6H2O 0.2 0.74MoO4-2H2O 0.16 0.25KI 0.1 0.6CuS04-5H2O 0.04 0.16檸檬酸(Citric Acid)14.76用5ml水分別溶解各組分，混合后定容至100ml，過濾除菌，凍存或4℃保存。
5、維生素母液(Vitamins Stock 1,000×)組分 添加量(g)最終濃度(μM)煙酸(Nicotinic acid) 181.2肌醇(Inositol)155.5生物素(Biotin)1mg 40.8泛酸(Pantothenic acid)100mg4.2各用10ml水分別溶解各組分，混合后定容至100ml，過濾除菌，凍存或4℃保存。
6、其它成分(Supplements)組分 添加量(g/100ml) 最終濃度(×)精氨酸-HCl(Arginine-HCl) 0.75 100亮氨酸1(Leucine1) 0.75 100賴氨酸-HCl(Lysine-HCl) 0.75 100
谷氨酸鈉2(Glutamic monosodium2) 0.75100組氨酸-HCl(Histidine-HCl) 0.75100腺嘌呤(Adenine)0.375 50尿嘧啶(Uracil) 0.375 50在本培養(yǎng)基中，當(dāng)1是對(duì)Leu 1-32時(shí)，濃度加至250mg/L。當(dāng)2是谷氨酸缺陷型時(shí)，濃度為75mg/L；glu2.5g/L代替NH4Cl。
本實(shí)驗(yàn)的具體操作步驟為1、裂殖酵母在YE液體培養(yǎng)基中，29℃，300rpm搖床中培養(yǎng)至1×107cell/ml，3000rpm離心收集；2、冰冷的1.2M山梨醇(Sorbitol)洗三次后，以1×109cell/ml濃度重懸于1.2M Sorbitol中；3、0.2ml細(xì)胞中加入1ng-1μg DNA，迅速轉(zhuǎn)入冰冷的電擊杯中；4、設(shè)定電擊指數(shù)2.25kv，200Ω，25μF，電擊，通過電擊法將載體pREP-Btub1(+)導(dǎo)入裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)S.P.Q-01(Leul-32h-)；5、電擊后，迅速加入0.5ml冰冷的1.2M Sorbitol；6、用冰冷的1.2M Sorbitol稀釋后(勿超過5倍)，取0.5ml涂到很干的選擇性MM培養(yǎng)基平板上，通過MM培養(yǎng)基的選擇作用，篩選表達(dá)Gh-β-tubulin蛋白的酵母細(xì)胞；7、30℃培養(yǎng)4-6天出現(xiàn)菌落。挑取單克隆，提取質(zhì)粒進(jìn)一步鑒定是否為轉(zhuǎn)化子；8、接種單菌落(pREP+GhFas和pREP)于5ml含2μM VB1的MM液體培養(yǎng)基(+VB1)中，29℃，300rpm搖床中培養(yǎng)20小時(shí)至O.D600＜1.0(0.8最好)；9、均分成兩份，室溫下，3000rpm離心5分鐘；10、用20ml無菌水洗3次，另一份不變；11、洗過的那份轉(zhuǎn)入50mlMM液體培養(yǎng)基；未洗的那份轉(zhuǎn)接入等量的MM液體培養(yǎng)基(+VB1)；12、29℃，300rpm搖床中培養(yǎng)20小時(shí)，取20μl對(duì)數(shù)晚期的培養(yǎng)物放于載玻片上，蓋上蓋玻片，顯微鏡高倍鏡下觀察。
結(jié)果如


圖1所示，圖中A、B、E、D為利用普通明視野顯微鏡拍攝的照片，F(xiàn)、G、I、J為利用熒光顯微鏡拍攝的DAPI染色后的細(xì)胞照片，其中，A和F含有pREP-BtubL(+)的酵母細(xì)胞，非誘導(dǎo)型；B和G含有pREP-BtubL(+)的酵母細(xì)胞，非誘導(dǎo)型；E和I含有pREP5N載體的酵母細(xì)胞，誘導(dǎo)型；D和I未轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞，誘導(dǎo)型，從圖中可以看出，正向表達(dá)的Gh-β-tubulin基因，能顯著地增加酵母細(xì)胞的徑向長度，表明，Gh-BtubL有刺激酵母細(xì)胞伸長的作用，可提高酵母的產(chǎn)量。
序列表<160>2<210>1<211>1580<2 12>DNA<213>棉屬陸地棉(Gossypium hirsutum L.)<400>1atgagagaaa tcctccatgt tcaagccggt cagtgtggta atcaaattgg tggcaagttt 60tgggaagtag tatgtgatga acatgggata gatgccactg gtaactatgt cggcacttcg 120cctgttcagc ttgaaaggct taatgtttac tataatgaag ccagtggtgg cagatatgtg 180cctagagctg tgttaatgga tcttgagcca ggaactatgg acagtttacg aacaggtcct 240tatggaaaat tgtttagacc agataacttt gtgttcggcc aaaatggagc tggcaataac 300tgggctaagg gacattatac tgaaggagct gaattgattg attcagttct tgatgttgtt 360cgtaaagagg ctgagaattg tgattgttta caaggttttc aggtttgcca ttcactggga 420ggtggaacag ggtcagggat ggggacattg ttgatatcaa agatcaggga agaataccct 480gaccggatga tgctaacgtt ctcggtgttt ccatcaccta aagtatcgga tactgtggtt 540gaaccctata atgcgaccct gtcagtgcac cagcttgtgg aaaatgctga tgaatgcatg 600gtccttgaca atgaagctct ttatgatatc tgcttcagaa ctcttaagct cacaaatccc 660agctttggtg acttgaacca tttgatttca acaaccatga gtggagtcac atgctgcctt 720cgcttccctg gccaactcaa ttccgatctt cgaaaactag cagtaaactt gatcccattc 780ccacgcctcc attttttcat ggttggtttt gcacctttaa catcccgggg ttcacaacaa 840taccgagctt taacgatccc cgagctaact caacaaatgt gggattccaa aaacatgatg 900tgcgcggctg atcctcgtca tggaaggtac ttaacagcct cggcaatgtt tcgaggcaaa 960atgagcacca aggaagttga tgaacaaatg atcaatgtcc aaaacaagaa ctcttcgtac 1020tttgtggagt ggattccgaa cgatgttaaa tcaagtgttt gcgacatccc accaactggg 1080ttgacgatgt catcgacgtt tatggggaac tcgacatcga tacaagagat gtttcgacgt 1140gtttcggaac agttcacagt gatgtttagg aggaaagcat ttttgcattg gtatacaggg 1200gaagggatgg atgaaatgga gtttactgag gctgaaagta atatgaatga tttggtttct 1260gaatatcaac aatatcaaga tgctgtggtt gatgaagatg gtgaagggta tgaagatgaa 1320gctgaggaaa attgacggaa ttcttttcaa ctttctatag taatggccta ggaaaaaaaa 1380atcaaatatg gtgctcattt tgatggttct aaataaggag gccatgtttt ttcatttgtg 1440ctgggatttt tagtaatgtg aattgtgaat ttgtatattt atatcaaatg tgaattgtga 1500tttaatgaat ttggagtgta aatttatgta atgaatttgg aatcacaagt ttcaaaattt 1560caagacaaaa aaaaaaaaaa 1580<210>2<211>444<212>PRT<213>棉屬陸地棉(Gossypium hirsutum L.)<400>2Met Arg Glu Ile Leu His Val Gln Ala Gly Gln Cys Gly Asn Gln1 5 10 15Ile Gly Gly Lys Phe Trp Glu Val Val Cys Asp Glu His Gly Ile20 25 30Asp Ala Thr Gly Asn Tyr Val Gly Thr Ser Pro Val Gln Leu Glu35 40 45Arg Leu Asn Val Tyr Tyr Asn Glu Ala Ser Gly Gly Arg Tyr Val50 55 60Pro Arg Ala Val Leu Met Asp Leu Glu Pro Gly Thr Met Asp Ser65 70 75Leu Arg Thr Gly Pro Tyr Gly Lys Leu Phe Arg Pro Asp Asn Phe80 85 90Val Phe Gly Gln Asn Gly Ala Gly Asn Asn Trp Ala Lys Gly His95 100 105Tyr Thr Glu Gly Ala Glu Leu lle Asp Ser Val Leu Asp Val Val110 115 120Arg Lys Glu Ala Glu Asn Cys Asp Cys Leu Gln Gly Phe Gln Val125 130 135Cys His Ser Leu Gly Gly Gly Thr Gly Ser Gly Met Gly Thr Leu140 145 150Leu Ile Ser Lys Ile Arg Glu Glu Tyr Pro Asp Arg Met Met Leu155 160 165Thr Phe Ser Val Phe Pro Ser Pro Lys Val Ser Asp Thr Val Val170 175 180Glu Pro Tyr Asn Ala Thr Leu Ser Val His Gln Leu Val Glu Asn185 190 195Ala Asp Glu Cys Met Val Leu Asp Asn Glu Ala Leu Tyr Asp Ile200 205 210Cys Phe Arg Thr Leu Lys Leu Thr Asn Pro Ser Phe Gly Asp Leu215 220 225Asn His Leu Ile Ser Thr Thr Met Ser Gly Val Thr Cys Cys Leu230 235 240Arg Phe Pro Gly Gln Leu Asn Ser Asp Leu Arg Lys Leu Ala Val245 250 255Asn Leu Ile Pro Phe Pro Arg Leu His Phe Phe Met Val Gly Phe260 265 270Ala Pro Leu Thr Ser Arg Gly Ser Gln Gln Tyr Arg Ala Leu Thr275 280 285Ile Pro Glu Leu Thr Gln Gln Met Trp Asp Ser Lys Asn Met Met290 295 300Cys Ala Ala Asp Pro Arg His Gly Arg Tyr Leu Thr Ala Ser Ala305 310 315Met Phe Arg Gly Lys Met Ser Thr Lys Glu Val Asp Glu Gln Met320 325 330Ile Asn Val Gln Asn Lys Asn Ser Ser Tyr Phe Val Glu Trp Ile335 340 345Pro Asn Asp Val Lys Ser Ser Val Cys Asp Ile Pro Pro Thr Gly350 355 360Leu Thr Met Ser Ser Thr Phe Met Gly Asn Ser Thr Ser Ile Gln365 370 375Glu Met Phe Arg Arg Val Ser Glu Gln Phe Thr Val Met Phe Arg380 385 390Arg Lys Ala Phe Leu His Trp Tyr Thr Gly Glu Gly Met Asp Glu395 400 405Met Glu Phe Thr Glu Ala Glu Ser Asn Met Asn Asp Leu Val Ser410 415 420Glu Tyr Gln Gln Tyr Gln Asp Ala Val Val Asp Glu Asp Gly Glu426 430 435Gly Tyr Glu Asp Glu Ala Glu Glu Asn440 44權(quán)利要求
1.棉花纖維的類β微管蛋白Gh-BtubL，是具有序列表中序列2氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，或者是將序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列2的氨基酸殘基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白，其特征在于它是具有序列表中序列2氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。
3.棉花纖維類β微管蛋白Gh-BtubL的編碼基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)與序列表中序列1限定的DNA序列具有85％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因，其特征在于所述棉花纖維類β微管蛋白Gh-BtubL的編碼基因是序列表中序列1的DNA序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基因，其特征在于該基因的讀碼框?yàn)樽?’端第1到第1335位堿基。
6.含有權(quán)利要求3或4所述基因的表達(dá)載體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的載體，其特征在于所述表達(dá)載體中還含有啟動(dòng)子。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的載體，其特征在于所述啟動(dòng)子為纖維特異性表達(dá)啟動(dòng)子、酵母/大腸桿菌的穿梭質(zhì)粒pREP5N的nmt1啟動(dòng)子或35S啟動(dòng)子。
9.含有權(quán)利要求3或4所述基因的細(xì)胞系。
10.權(quán)利要求3或4所述基因在培育纖維長度增加的植物品種中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了棉花纖維的類β微管蛋白及其編碼基因與應(yīng)用，目的是提供和棉花纖維伸長具有密切相關(guān)的類β微管蛋白及其編碼基因。本發(fā)明所提供的棉花纖維類β微管蛋白的名稱為Gh－BtubL，是具有序列表中序列2氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，或者是將序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列2的氨基酸殘基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。棉花纖維類β微管蛋白Gh－BtubL的編碼基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)與序列表中序列1限定的DNA序列具有85％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
文檔編號(hào)A01H1/00GK1478791SQ0212898
公開日2004年3月3日 申請(qǐng)日期2002年8月26日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月26日
發(fā)明者朱玉賢, 姬生健, 盧迎春, 馮建勛 申請(qǐng)人:北京大學(xué)