抑制產(chǎn)氣莢膜梭菌感染的重組α蛋白及其制備方法與應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了抑制產(chǎn)氣莢膜梭菌感染的重組α蛋白及其制備方法與應(yīng)用。該重組α蛋白為a)或b)或c)：a)由SEQ ID No.2的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；b)由SEQ ID No.2第51?353位所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；c)在a)或b)所示的蛋白質(zhì)的羧基端或/和氨基端融合蛋白標(biāo)簽得到的融合蛋白。該重組α蛋白免疫動物后可使動物產(chǎn)生較高的血清抗體水平，并且可抵抗產(chǎn)氣莢膜梭菌的攻擊。該重組α蛋白可溶性好，純化簡易，可作為診斷抗原、制備成單克隆抗體或進(jìn)一步對蛋白功能與構(gòu)象關(guān)系進(jìn)行研究。
【專利說明】
抑制產(chǎn)氣莢膜梭菌感染的重組α蛋白及其制備方法與應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中抑制產(chǎn)氣莢膜梭菌感染的重組α蛋白及其制備方法與 應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium Perfringens)也稱魏氏梭菌，是一種重要的人畜共 患病，該病原是創(chuàng)傷性氣性壞疽和人類食物中毒以及羊快疫、羔羊痢疾、牛羊壞死性腸炎、 牛羊腸毒血癥的主要病原之一，對畜牧業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。產(chǎn)氣莢膜梭菌主要的致 病因素是其分泌的外毒素，種類多達(dá)13種，其中α、β和ε是最主要的外毒素，根據(jù)產(chǎn)生外毒素 的種類不同，可將產(chǎn)氣莢膜梭菌分為A、B、C、D、E這五個血清型。產(chǎn)氣莢膜梭菌的α毒素導(dǎo)致 動物傳染病的防控是當(dāng)前困擾動物疫病防控工作著的主要難題之一。傳統(tǒng)疫苗在治療和預(yù) 防動物產(chǎn)氣莢膜梭菌疾病方面雖然取得了一定的效果。但是，這些疫苗在使用過程中仍然 暴露了一些缺陷，例如傳統(tǒng)疫苗免疫易引起動物局部炎癥以及毒性反應(yīng)等。研發(fā)能表達(dá)α外 毒素抗原蛋白，并且不破壞α外毒素抗原蛋白的免疫原性，對產(chǎn)氣莢膜梭菌α外毒素引起的 疫病起到防控作用的基因工程疫苗是急需解決的技術(shù)難題。
[0003] 李娜(李娜.羊源產(chǎn)氣莢膜梭菌的分離鑒定與a毒素的原核表達(dá)和免疫原性研究. 石河子大學(xué)碩士學(xué)位論文.2013)對羊源產(chǎn)氣莢膜梭菌的進(jìn)行分離鑒定并對α毒素的原核表 達(dá)和免疫原性進(jìn)行了研究。該課題組針對產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素的全基因序列，設(shè)計針對α毒 素成熟肽序列的引物，采用PCR方法擴(kuò)增α毒素成熟肽序列，將其插入質(zhì)粒pET_28b構(gòu)建重組 表達(dá)載體pET-28b-cpa。該課題組用重組蛋白制備亞單位疫苗免疫小鼠，結(jié)果表明，重組α毒 素可以刺激產(chǎn)生抗α毒素抗體免疫應(yīng)答反應(yīng)，免疫抗體在免疫后28天達(dá)到最高水平（1: 6400)，并能夠?qū)γ庖咝∈筇峁┮欢ǖ拿庖弑Ｗo(hù)作用。但是該重組質(zhì)粒表達(dá)出的蛋白為部分 可溶性蛋白，可溶性蛋白表達(dá)量占菌體可溶性蛋白的34.6 %。
[0004] 現(xiàn)有技術(shù)中對產(chǎn)氣莢膜梭菌主要外毒素蛋白的表達(dá)與純化方法相對復(fù)雜，表達(dá)產(chǎn) 物通常以不溶性的包涵體形式存在，可溶性蛋白表達(dá)的報道在國內(nèi)外非常少。因為包涵體 中的表達(dá)產(chǎn)物不具有生物學(xué)活性，因而需要進(jìn)行變性與復(fù)性處理。蛋白的變性與復(fù)性是一 個極其復(fù)雜的過程，不同蛋白的復(fù)性條件各異，復(fù)性率往往很難提高。這是限制其應(yīng)用的主 要制約因素。采用可溶性表達(dá)方式可很好的克服這一問題。如何構(gòu)建可溶性表達(dá)載體并且 優(yōu)化可溶性蛋白的高效表達(dá)方法，是本領(lǐng)域長期以來一直研究的熱點課題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的一個技術(shù)問題是如何獲得抑制產(chǎn)氣莢膜梭菌感染的可溶性蛋 白質(zhì)疫苗。
[0006] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了制備重組α蛋白的方法。
[0007] 本發(fā)明所提供的制備重組α蛋白的方法，包括使重組α蛋白的編碼基因在生物中進(jìn) 行表達(dá)得到所述重組α蛋白的步驟;所述生物為微生物、植物或非人動物；
[0008] 所述重組α蛋白為a)或b)或c)或d):
[0009] a)由SEQ ID No.2的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
[0010] b)由SEQ ID No.2第51-353位所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
[0011] c)在a)或b)所示的蛋白質(zhì)的羧基端或/和氨基端融合蛋白標(biāo)簽得到的融合蛋白；
[0012] d)將SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺 失和/或添加得到的可溶性蛋白質(zhì)。
[0013]上述方法中，￡1)的蛋白質(zhì)名稱為(1-1^，13)的蛋白質(zhì)名稱為€^ (^0 1〇如.2由353 個氨基酸殘基組成。
[0014] 上述方法中，蛋白標(biāo)簽是指利用DNA體外重組技術(shù)，與目的蛋白一起融合表達(dá)的一 種多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表達(dá)、檢測、示蹤和/或純化等。
[0015] 上述方法中，所述使重組α蛋白的編碼基因在生物中進(jìn)行表達(dá)包括所述重組α蛋白 的編碼基因?qū)胧荏w微生物，得到表達(dá)所述重組α蛋白的重組微生物，培養(yǎng)所述重組微生 物，表達(dá)得到所述重組α蛋白。
[0016] 上述方法中，所述受體微生物可為C1)_C4)中的任一種：
[0017] C1)原核微生物；
[0018] C2)革蘭氏陰性細(xì)菌；
[0019] C3)埃希氏菌屬細(xì)菌；
[0020] C4)大腸桿菌 BL21(DE3)。
[0021] 上述方法中，所述蛋白質(zhì)的編碼基因為如下1)或2)或3)或4)所示的基因：
[0022] 1)編碼序列是SEQ ID No.l所示的DNA分子；
[0023] 2)編碼序列是SEQ ID No.l的第151-1062位所示的DNA分子；
[0024] 3)與1)或2)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且編碼所述重組α蛋白。
[0025] 其中，SEQ ID No.l由1068個核苷酸組成，其名稱為α-hisY基因，編碼氨基酸序列 是SEQIDNo.2的蛋白質(zhì)a-his。SEQIDNo.l的第151-1062位所示的DNA分子是a-Y基因，編 碼由SEQ ID No.2第51-353位所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)a-Y。
[0026]上述方法中，所述重組微生物為將pET30a-a-Y導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)得到的表 達(dá)氨基酸序列是SEQ ID No.2的重組α蛋白的重組微生物，所述重組微生物命名為BL21 (DE3) /pET30a-a-Y，所述pET30a-a-Y為將載體pET30a (+)的BamHI和Xho I位點之間的序列替 換為SEQ ID No.l第151-1062位所示的DNA片段得到的重組載體。
[0027] 上述方法中，所述表達(dá)為誘導(dǎo)表達(dá)，所述誘導(dǎo)表達(dá)是用0.75mM的IPTG在16°C誘導(dǎo) 13-16小時或13-24小時或13小時或16小時。
[0028] 下述任一種產(chǎn)品也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍：
[0029] P1)重組α蛋白，所述重組α蛋白為a)或b)或c)或d):
[0030] a)由SEQ ID No.2的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
[0031] b)由SEQ ID No.2第51-353位所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
[0032] c)在a)或b)所示的蛋白質(zhì)的羧基端或/和氨基端融合蛋白標(biāo)簽得到的融合蛋白；
[0033] d)將SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺 失和/或添加得到的可溶性蛋白質(zhì)；
[0034] P2)與所述重組α蛋白相關(guān)的生物材料，所述生物材料為下述B1)至B16)中的任一 種：
[0035] B1)編碼所述重組α蛋白的核酸分子；
[0036] Β2)含有Β1)所述核酸分子的表達(dá)盒；
[0037] Β3)含有Β1)所述核酸分子的重組載體；
[0038] Β4)含有Β2)所述表達(dá)盒的重組載體；
[0039] Β5)含有Β1)所述核酸分子的重組微生物；
[0040] Β6)含有Β2)所述表達(dá)盒的重組微生物；
[0041 ] Β7)含有Β3)所述重組載體的重組微生物；
[0042] Β8)含有Μ)所述重組載體的重組微生物；
[0043] Β9)含有Β1)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因動物細(xì)胞系；
[0044] Β10)含有Β2)所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因動物細(xì)胞系；
[0045] Β11)含有Β3)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因動物細(xì)胞系；
[0046] Β12)含有M)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因動物細(xì)胞系；
[0047] Β13)含有Β1)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系；
[0048] Β14)含有Β2)所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系；
[0049] Β15)含有Β3)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系；
[0050] Β16)含有M)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系；
[0051] Ρ3)預(yù)防動物產(chǎn)氣莢膜梭菌感染的疫苗，其含有所述重組α蛋白或所述生物材料。 [0052] 上述產(chǎn)品中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因組DNA或重組DNA;所述核酸分 子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
[0053] 這里使用的術(shù)語"同一性"指與天然核酸序列的序列相似性。同一性可以用肉眼或 計算機(jī)軟件進(jìn)行評價。使用計算機(jī)軟件，兩個或多個序列之間的同一性可以用百分比（％ ) 表示，其可以用來評價相關(guān)序列之間的同一性。
[0054] 上述產(chǎn)品中，所述重組α蛋白按照上述任一種方法制備；
[0055] 所述核酸分子為如下1)或2)或3)所示的基因：
[0056] 1)編碼序列是SEQ ID No.l所示的DNA分子；
[0057] 2)編碼序列是SEQ ID No.l的第151-1062位所示的DNA分子；
[0058] 3)與1)或2)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且編碼所述蛋白質(zhì)的DNA分子；
[0059] 所述重組載體為所述pET30a-a-Y;
[0060] 所述重組微生物為El)或E2):
[0061] E1)所述重組微生物為將所述重組α蛋白的編碼基因?qū)胧荏w微生物，得到表達(dá)所 述重組α蛋白的重組微生物，所述受體微生物為Cl )_C4)中的任一種：
[0062] C1)原核微生物；
[0063] C2)革蘭氏陰性細(xì)菌；
[0064] C3)埃希氏菌屬細(xì)菌；
[0065] C4)大腸桿菌 BL21(DE3);
[0066] 所述重組微生物為所述BL21(DE3)/pET30a-a-Y;
[0067] 所述預(yù)防動物產(chǎn)氣莢膜梭菌感染的疫苗的活性成分為所述重組α蛋白或所述生物 材料。
[0068] 下述任一種應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍：
[0069] Y1)所述重組α蛋白在制備抗產(chǎn)氣莢膜梭菌疫苗中的應(yīng)用；
[0070] Υ2)所述生物材料在制備抗產(chǎn)氣莢膜梭菌疫苗中的應(yīng)用；
[0071 ] Υ3)所述方法在制備抗產(chǎn)氣莢膜梭菌疫苗中的應(yīng)用；
[0072] Υ4)所述重組α蛋白在制備產(chǎn)氣莢膜梭菌病診斷抗原中的應(yīng)用；
[0073] Υ5)所述重組α蛋白在制備單克隆抗體中的應(yīng)用。。
[0074] 本發(fā)明中，所述產(chǎn)氣莢膜梭菌可為A、B、C、D和Ε這5種型產(chǎn)氣莢膜梭菌中的任5種、 任4種、任3種、任2種或任1種。
[0075] 本發(fā)明中，所述抗產(chǎn)氣莢膜梭菌疫苗具體可為上述預(yù)防動物產(chǎn)氣莢膜梭菌感染的 疫苗。
[0076] 在實際應(yīng)用中，可以將本發(fā)明的重組α蛋白或其相關(guān)生物材料作為藥物直接給予 病人、或者與適宜的載體或賦形劑混合后給予病人，以達(dá)到治療產(chǎn)氣莢膜梭菌感染的目的。 這里的載體材料包括但不限于水溶性載體材料(如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、有機(jī)酸等）、 難溶性載體材料(如乙基纖維素、膽固醇硬脂酸酯等）、腸溶性載體材料(如醋酸纖維素酞酸 酯和羧甲乙纖維素等）。其中優(yōu)選的是水溶性載體材料。使用這些材料可以制成多種劑型， 包括但不限于片劑、膠囊、滴丸、氣霧劑、丸劑、粉劑、溶液劑、混懸劑、乳劑、顆粒劑、脂質(zhì)體、 透皮劑、口含片、栓劑、凍干粉針劑等。可以是普通制劑、緩釋制劑、控釋制劑及各種微粒給 藥系統(tǒng)。為了將單位給藥劑型制成片劑，可以廣泛使用本領(lǐng)域公知的各種載體。關(guān)于載體的 例子是，例如稀釋劑與吸收劑，如淀粉、糊精、硫酸鈣、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化鈉、葡萄糖、 尿素、碳酸鈣、白陶土、微晶纖維素、硅酸鋁等;濕潤劑與粘合劑，如水、甘油、聚乙二醇、乙 醇、丙醇、淀粉漿、糊精、糖漿、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯膠漿、明膠漿、羧甲基纖維素鈉、紫 膠、甲基纖維素、磷酸鉀、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解劑，例如干燥淀粉、海藻酸鹽、瓊脂粉、褐 藻淀粉、碳酸氫鈉與枸櫞酸、碳酸鈣、聚氧乙烯、山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸鈉、甲基 纖維素、乙基纖維素等;崩解抑制劑，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氫化油等;吸收促 進(jìn)劑，例如季銨鹽、十二烷基硫酸鈉等；潤滑劑，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸 鹽、硼酸、液體石蠟、聚乙二醇等。還可以將片劑進(jìn)一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包 衣片、腸溶包衣片，或雙層片和多層片。為了將單位給藥劑型制成丸劑，可以廣泛使用本領(lǐng) 域公知的各種載體。關(guān)于載體的例子是，例如稀釋劑與吸收劑，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可 月旨、氫化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、Gelucire、高嶺土、滑石粉等;粘合劑如阿拉伯膠、黃蓍 膠、明膠、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解劑，如瓊脂粉、干燥淀粉、海藻酸鹽、十二烷 基磺酸鈉、甲基纖維素、乙基纖維素等。為了將單位給藥劑型制成栓劑，可以廣泛使用本領(lǐng) 域公知的各種載體。關(guān)于載體的例子是，例如聚乙二醇、卵磷脂、可可脂、高級醇、高級醇的 酯、明膠、半合成甘油酯等。為了將單位給藥劑型制成注射用制劑，如溶液劑、乳劑、凍干粉 針劑和混懸劑，可以使用本領(lǐng)域常用的所有稀釋劑，例如，水、乙醇、聚乙二醇、1，3_丙二醇、 乙氧基化的異硬脂醇、多氧化的異硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，為了制備等 滲注射液，可以向注射用制劑中添加適量的氯化鈉、葡萄糖或甘油，此外，還可以添加常規(guī) 的助溶劑、緩沖劑、pH調(diào)節(jié)劑等。此外，如需要，也可以向藥物制劑中添加著色劑、防腐劑、香 料、矯味劑、甜味劑或其它材料。使用上述劑型可以經(jīng)注射給藥，包括皮下注射、靜脈注射、 肌肉注射和腔內(nèi)注射等;腔道給藥，如經(jīng)直腸和陰道;呼吸道給藥，如經(jīng)鼻腔;粘膜給藥。上 述給藥途徑優(yōu)選的是注射給藥。
[0077] 本發(fā)明將SEQ ID No.l的第151-1062位所示的DNA分子插入pET30a( + )的BamHI和 Xhol位點，得到表達(dá)SEQ ID No.2的重組蛋白α-his的重組表達(dá)載體pET30a-α-Y。將重組表 達(dá)載體pET30a-a-Y導(dǎo)入大腸桿菌BL21 (DE3)獲得了可溶性的目的蛋白a-his。本發(fā)明優(yōu)化了 a-hisa-his的表達(dá)條件，進(jìn)一步提高了 a-his的表達(dá)量，用0.75mM的IPTG在16°C誘導(dǎo)13-24 小時，a-his的含量達(dá)到菌體總蛋白的90 %，表達(dá)的目的a-his蛋白94 %可溶。a-his免疫動 物后可使動物產(chǎn)生較高的血清抗體水平，并且可抵抗產(chǎn)氣莢膜梭菌的攻擊。a-his在抵抗A 型產(chǎn)氣莢膜梭菌攻擊時的7天內(nèi)的免疫保護(hù)率為100% (20全部只存活），roS對照組小鼠全 部死亡;a-his在抵抗B型產(chǎn)氣莢膜梭菌攻擊時的免疫保護(hù)率為90% (18只存活，2只死亡）， PBS對照組小鼠全部死亡;a-his在抵抗C型產(chǎn)氣莢膜梭菌攻擊時的免疫保護(hù)率為85% (17只 存活，3只死亡），PBS對照組小鼠全部死亡;a-his在抵抗D型產(chǎn)氣莢膜梭菌攻擊時的免疫保 護(hù)率為90% (18只存活，2只死亡），而PBS對照組小鼠全部死亡。第三次免疫a-his后7-14天 抗體效價達(dá)到峰值，最高抗體效價達(dá)1:128000。a-his可溶性好，純化簡易，可作為診斷抗 原、制備成單克隆抗體或進(jìn)一步對蛋白功能與構(gòu)象關(guān)系進(jìn)行研究。
【附圖說明】
[0078] 圖1為各菌株表達(dá)蛋白的SDS-PAGE電泳圖譜。
[0079] 圖中，Μ為Marker，從上到下分別為 130kD、95kD、70kD、62kD、51kD、40kD、29kD，l、$ 導(dǎo)表達(dá)的受體菌全菌蛋白液體，2、未誘導(dǎo)表達(dá)的BL21 (DE3) /pET30a-a-Y全菌蛋白液體，3、 誘導(dǎo)表達(dá)的BL21(DE3)/pET30a-a-Y全菌蛋白液體，4、誘導(dǎo)表達(dá)的BL21(DE3)/pET30a-a-Y含 蛋白上清液，5、誘導(dǎo)表達(dá)的BL21(DE3)/pET30a-a-Y含蛋白沉淀，6、未誘導(dǎo)表達(dá)的BL21 (DE3 )/pET30a-a-W全菌蛋白液體，7、誘導(dǎo)表達(dá)的BL21 (DE3 )/pET30a-a-W全菌蛋白液體，8、 誘導(dǎo)表達(dá)的BL21(DE3)/pET30a-a-W含蛋白上清液，9、誘導(dǎo)表達(dá)的BL21(DE3)/pET30a-a-W含 蛋白沉淀，10、未誘導(dǎo)表達(dá)的BL21 (DE3)/pET30a-pma-W全菌蛋白液體，11、誘導(dǎo)表達(dá)的BL21 (DE3) /pET30a-pma-W全菌蛋白液體，12、誘導(dǎo)表達(dá)的BL21 (DE3) /pET30a-pma-W含蛋白上清 液，13、誘導(dǎo)表達(dá)的BL21 (DE3) /pET30a-pma-W含蛋白沉淀。
[0080] 圖 2 為Western-blot 圖譜。
[00811圖中，1、誘導(dǎo)表達(dá)的受體菌全菌蛋白液體，2、未誘導(dǎo)表達(dá)的BL21(DE3)/pET30a-a-Y全菌蛋白液體，3、誘導(dǎo)表達(dá)的BL21 (DE3 )/pET30a-a-Y全菌蛋白液體，4、誘導(dǎo)表達(dá)的BL21 (DE3 )/pET30a-a-Y含蛋白上清液，5、誘導(dǎo)表達(dá)的BL21 (DE3 )/pET30a-a-Y含蛋白沉淀，6、未 誘導(dǎo)表達(dá)的BL21(DE3)/pET30a-a-W全菌蛋白液體，7、誘導(dǎo)表達(dá)的BL21(DE3)/pET30a-a-W全 菌蛋白液體，8、誘導(dǎo)表達(dá)的BL21(DE3)/pET30a-a-W含蛋白上清液，9、誘導(dǎo)表達(dá)的BL21 (DE3) /pET30a-a-W含蛋白沉淀，10、未誘導(dǎo)表達(dá)的BL21 (DE3) /pET30a-pma-W全菌蛋白液體， 11、誘導(dǎo)表達(dá)的BL21(DE3)/pET30a-pma-W全菌蛋白液體，12、誘導(dǎo)表達(dá)的BL21(DE3)/ pET30a-pma-W含蛋白上清液，13、誘導(dǎo)表達(dá)的BL21 (DE3) /pET30a-pma-W含蛋白沉淀。
[0082]圖3為重組蛋白a-his的AKTA純化鑒定。箭頭所指的為純化的目的蛋白峰。
[0083]圖4為重組蛋白a-his的分子篩純化鑒定。箭頭所指的為純化的目的蛋白峰。
[0084] 圖5為純化的目的蛋白的SDS-PAGE電泳圖譜。箭頭示目的條帶。
[0085] 其中Μ是 Marker，從上到下分別為 130kD、95kD、70kD、62kD、51 kD、40kD、29kD; 1 是誘 導(dǎo)表達(dá)的BL21(DE3)/pET30a-a-Y全菌蛋白液體;2是誘導(dǎo)表達(dá)的BL21(DE3)/pET30a-pma-W 全菌蛋白液體；3是未誘導(dǎo)表達(dá)的BL21(DE3)/pET30a-a-Y全菌蛋白液體；4是誘導(dǎo)表達(dá)的 BL21 (DE3)/pET30a-a-Y含蛋白上清液；5是誘導(dǎo)表達(dá)的BL21 (DE3 )/pET30a-pma-W含蛋白上 清液;6是誘導(dǎo)表達(dá)的BL21(DE3)/pET30a-a-Y含蛋白沉淀;7是分子篩純化的a-his蛋白；8是 分子篩純化的pma-his蛋白。
【具體實施方式】
[0086] 下面結(jié)合【具體實施方式】對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實施例僅為了闡 明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為 常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0087] pET30a( + )為 Novagen 公司產(chǎn)品。pET28a( + )為 Novagen 公司產(chǎn)品。
[0088] A型產(chǎn)氣莢膜梭菌強(qiáng)毒株C57-10、B型產(chǎn)氣莢膜梭菌強(qiáng)毒株C58-5、C型產(chǎn)氣莢膜梭 菌強(qiáng)毒株C59-4、D型產(chǎn)氣莢膜梭菌強(qiáng)毒株C60-11均為中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所產(chǎn)品。
[0089] 實施例1、可溶性表達(dá)a-hisY [0090] 1、合成基因
[0091] 本申請設(shè)計了3種重組a基因，分別為SEQ ID No. 1所示的a-hisY基因 、SEQ ID No.3所示的a-hisW基因、SEQIDNo.4所示的pma-hisW基因。
[0092] a-hisY基因和a-hisW基因均編碼SEQ ID 1^〇.2所不的蛋白質(zhì)<1-]1丨8。口1]1€[-]1丨8￥基因 編碼SEQ ID No.5所示的蛋白質(zhì)pma-hisWw-his是將pma-hisW的第52-146位氨基酸殘基缺 失得到的蛋白質(zhì)。
[0093]用化學(xué)合成的方法合成出SEQ ID No. 1的第151-1062位所示的a-Y基因（編碼SEQ ID No.2的第51-353位氨基酸殘基所示的蛋白質(zhì)），SEQ ID No.3的第151-1062位所示的a-W 基因（編碼SEQ ID No.2的第51-353位氨基酸殘基所示的蛋白質(zhì)），SEQ ID No.4的第151-1347位所示pma-W基因（編碼SEQ ID No.5的第51-448位氨基酸殘基所示的蛋白質(zhì)pma-W)。
[0094] 2、重組表達(dá)載體和重組菌的構(gòu)建
[0095] 以a - Y基因作為模板，利用上游引物F 1 (序列為5 ' -g g a t c c atgttttgggacccggacaccgac-3'）和下游弓丨物 Rl(序列為5'-CTCGAGTTATTTGATGTTATAGGTGCTGT-3 '）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在α-Υ基因的兩端加上BamHI位點（帶 下劃線的序列）和Xhol識別位點（帶下劃線的序列），得到SEQ ID No. 1的第145-1068位所示 的α-Υ基因 PCR產(chǎn)物。
[0096] 以a - W基因作為模板，利用上游引物F 1和下游引物R 2 (序列為5 ' -CTCGAGTCATTTGATGTTGTAGGTGCTGT-3'）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在α-W基因的兩端加上BamHI和Xhol識 別位點，得到SEQ ID No. 3的第145-1068位所示的α-W基因 PCR產(chǎn)物。
[0097] 以p m a - W基因作為模板，利用上游引物F 3 (序列為5'_ ggatccatgaaacgcaaaatctgcaaagccct-3 '）和下游引物R2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在pma-W基因的兩端 加上BamHI和Xhol識別位點，得到SEQ ID No.4的第145-1353位所示的pma-W基因 PCR產(chǎn)物。 [0098] 將上述α-Υ基因 PCR產(chǎn)物用BamHI和Xhol酶切，回收目的片段(α-Υ基因）；同時用 BamHI和Xhol酶切載體pET30a( + )，回收載體大片段;將回收的目的片段與回收的載體大片 段連接，得到目的質(zhì)粒。將目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞。將其均勾涂布于 含卡那霉素的LB平板上，37°C培養(yǎng)16小時。單菌落振蕩培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒用BamHI和Xhol 進(jìn)行雙酶切鑒定，將酶切驗證正確的質(zhì)粒進(jìn)行測序，將測序結(jié)果表明是用SEQ ID No. 1的第 151-1062位所示的α-Υ基因替換pET30a( + )的BamHI和Xhol識別位點間的片段，保持pET30 (+ )的其它序列不變得到的重組表達(dá)載體，命名為pETSOa-a-Y^ETSOa-a-Y含有帶His標(biāo)簽 的a-hiSY基因，a-hi SY基因的核苷酸序列是SEQIDN0.l，編碼SEQIDN0.2所示的蛋白質(zhì) a-his。將含有pET30a-a-Y的重組大腸桿菌命名為BL21(DE3)/pET30a-a-Y。
[0099] 將上述a-W基因 PCR產(chǎn)物用BamHI和Xhol酶切，回收目的片段(a-W基因）；同時用 BamHI和Xhol酶切載體pET30a( + )，回收載體大片段;將回收的目的片段與回收的載體大片 段連接，得到目的質(zhì)粒。將目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞。將其均勾涂布于 含卡那霉素的LB平板上，37°C培養(yǎng)16小時。單菌落振蕩培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒用BamHI和Xhol 進(jìn)行雙酶切鑒定，將酶切驗證正確的質(zhì)粒進(jìn)行測序，將測序結(jié)果表明是用SEQ ID No.3的第 151-1062位所示的α-W基因替換pET30a( + )的BamHI和Xhol識別位點間的片段，保持pET30 (+ )的其它序列不變得到的重組表達(dá)載體，命名為pETSOa-a-W^ETSOa-a-W含有His標(biāo)簽融 合蛋白a-hisW基因，a-hisW基因的核苷酸序列是SEQIDNo.3，編碼SEQIDNo.2所示的蛋 白質(zhì)a-his。將含有pET30a-a-W的重組大腸桿菌命名為BL21(DE3)/pET30a-a-W。
[0100] 將上述pma-W基因 PCR產(chǎn)物用BamHI和Xho頂每切，回收目的片段(pma-W基因）；同時 用BamHI和Xhol酶切載體pET30a( + )，回收載體大片段;將回收的目的片段與回收的載體大 片段連接，得到目的質(zhì)粒。將目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞。將其均勻涂布 于含卡那霉素的LB平板上，37°C培養(yǎng)16小時。單菌落振蕩培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒用BamHI和 Xhol進(jìn)行雙酶切鑒定，將酶切驗證正確的質(zhì)粒進(jìn)行測序，將測序結(jié)果表明是用SEQ ID No.4 的第151 -1347位所示的pma-W基因替換pET30a (+)的BamHI和Xho I識別位點間的片段，保持 pET30( + )的其它序列不變得到的重組表達(dá)載體，命名為pETSOa-pma-WdETSOa-pma-W含有 帶His標(biāo)簽的pma-hisW基因，pma-hisW基因的核苷酸序列是SEQIDNo.4，編碼SEQIDNo.5 所示的蛋白質(zhì)pma-hisW。將含有pET30a-pma-W的重組大腸桿菌命名為BL21(DE3)/pET30a- pma-ff〇
[0101] 3、蛋白表達(dá)形式的分析與鑒定
[0102] 將BL21(DE3)/pET30a-a-Y、BL21(DE3)/pET30a-a-W、BL21(DE3)/pET30a_pma-W和 大腸桿菌BL21(DE3)(簡稱受體菌)這四個菌株分別單獨(dú)接種于含50μg/ml卡那霉素的LB液 體培養(yǎng)基（在LB液體培養(yǎng)基中加入卡那霉素至卡那霉素的濃度為50μg/ml得到的培養(yǎng)基） 中，37°C，采用Thermo MaxQ6000型全溫振蕩器200rpm振蕩培養(yǎng)至OD600值（以含50μg/ml卡那 霉素的LB液體培養(yǎng)基為空白對照）達(dá)到0.6時，取出1 mL菌液作為未誘導(dǎo)表達(dá)的菌液（對 照），其余液體中加入異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。上述四株菌的誘導(dǎo) 表達(dá)均是用〇.75mM的IPTG在16°C誘導(dǎo)13小時。
[0103] 取誘導(dǎo)表達(dá)的菌液和未誘導(dǎo)表達(dá)的菌液用于蛋白表達(dá)形式分析。具體步驟為，取 lmL菌液置于1.5mL離心管中，做好標(biāo)記，4°C條件下8000rpm/min離心30min，棄掉上清液，收 集菌體沉淀。加入lmL PBS重懸沉淀，8000rpm/min離心5min，棄掉上清液。向洗滌好的菌體 沉淀中加入200yL PBS，高壓破碎菌體，裂解至菌液不再粘稠，得到全菌蛋白液體。將全菌蛋 白液體于4°C離心機(jī)中16000rpm/min離心30min，分別收集上清液(命名為含蛋白上清液)和 沉淀(命名為含蛋白沉淀），向含蛋白沉淀中加入50yL PBS重懸洗滌沉淀。向全菌蛋白液體、 含蛋白上清液和含蛋白沉淀中加入l〇yL 5 XSDS-PAGE loading Buffer，充分混勻后，置沸 水浴中煮沸5min，待樣品冷卻后，用掌式離心機(jī)瞬離。取6yL用于SDS-PAGE電泳分析，并且結(jié) 合蛋白灰度分析軟件初步分析蛋白含量。將電泳后的凝膠轉(zhuǎn)印于NC膜，以抗His標(biāo)簽的羊抗 鼠抗體為結(jié)合抗體DAB顯色，進(jìn)行Western-blot鑒定。將上述全菌蛋白液體和含蛋白上清液 用0.22μπι濾膜過濾后上樣至預(yù)先用溶液1(溶質(zhì)及其濃度如下：20mM Tris、150mM NaCl，溶 劑是水，PH8.0的溶液)平衡好的鎳柱。將鎳柱接入AKTA機(jī)器上，分別用10個柱體積的溶液1 與10個柱體積的溶液2(溶質(zhì)及其濃度如下：20mM Tris、150mM NaCl、50mM咪唑，溶劑是水， PH8.0的溶液)清洗鎳柱中的雜質(zhì)蛋白，并在AKTA機(jī)器上監(jiān)測蛋白峰。用溶液3(溶質(zhì)及其濃 度如下：20mM Tris、150mM NaCl、300mM咪唑，溶劑是水，pH8.0的溶液)沖洗鎳柱掛在鎳柱上 的目的蛋白，并使用AKTA收集出現(xiàn)目的蛋白峰的洗脫樣品，將該樣品稱為鎳柱純化目的蛋 白樣品。
[0104] 將鎳柱純化的目的蛋白樣品用GE公司生產(chǎn)的Superdex200凝膠柱通過分子篩進(jìn)一 步純化。流動相使用溶液1。通過分子篩純化后可以除去樣品中的含有的大量咪唑，收集洗 脫峰，得到分子篩純化的目的蛋白樣品，使用NanoDrop2000超微量分光光度計(ND2000)對 得到的分子篩純化的目的蛋白樣品中蛋白（即可溶性目的蛋白）的含量進(jìn)行定量分析。并用 NanoDrop2000超微量分光光度計(ND2000)測定全菌蛋白液體中的蛋白質(zhì)含量，得到菌體總 蛋白含量。將含蛋白沉淀用尿素溶解后，用NanoDrop2000超微量分光光度計(ND2000)測定 含蛋白沉淀中的蛋白質(zhì)的含量。
[0105] 結(jié)果表明誘導(dǎo)表達(dá)的BL21(DE3)/pET30a-a-Y的全菌蛋白液體、含蛋白上清液和含 蛋白沉淀中均含有大小為41kD的目的蛋白a-his，未誘導(dǎo)表達(dá)的BL21(DE3)/pET30a-a-Y的 全菌蛋白液體中不含有大小為41kD的目的蛋白a-his;誘導(dǎo)表達(dá)的BL21(DE3)/pET30a-a-Y 的全菌蛋白液體中目的蛋白a-his占菌體總蛋白（全菌總蛋白）的90 %，誘導(dǎo)表達(dá)的BL21 (DE3)/pET30a-a-Y的含蛋白上清液中的目的蛋白a-his占誘導(dǎo)表達(dá)的BL21(DE3)/pET30a-α-Υ的全菌蛋白液體中目的蛋白α-his的94%，該94%的目的蛋白α-his為可溶性蛋白；誘導(dǎo) 表達(dá)的BL21(DE3)/pET30a-a-Y的含蛋白沉淀中的目的蛋白a-his占誘導(dǎo)表達(dá)的BL21(DE3)/ pET30a-a-Y的全菌蛋白液體中目的蛋白a-his的6%，該6%的目的蛋白a-his為不溶性包涵 體蛋白；說明誘導(dǎo)表達(dá)的BL21(DE3)/pET30a-a-Y的目的蛋白a-his占菌體總蛋白的90%， BL21(DE3)/pET30a-a-Y表達(dá)的目的蛋白a-his中94%為可溶性蛋白，6%為不溶性包涵體蛋 白。誘導(dǎo)表達(dá)的BL21 (DE3)/pET30a-a-W的全菌蛋白液體、含蛋白上清液和含蛋白沉淀中均 含有大小為41kD的目的蛋白a-his，未誘導(dǎo)表達(dá)的BL21(DE3)/pET30a-a-W的全菌蛋白液體 不含有大小為41kD的目的蛋白a-his;誘導(dǎo)表達(dá)的BL21(DE3)/pET30a-a-W的全菌蛋白液體 中目的蛋白a-his占菌體總蛋白的90%，誘導(dǎo)表達(dá)的BL21(DE3)/pET30a-a-W的含蛋白上清 液中的目的蛋白a-his占誘導(dǎo)表達(dá)的BL21 (DE3)/pET30a-a-W的全菌蛋白液體中目的蛋白a-his的8%，該8%的目的蛋白a-his為可溶性蛋白；誘導(dǎo)表達(dá)的BL21(DE3)/pET30a-a-W的含 蛋白沉淀中的目的蛋白a-his占誘導(dǎo)表達(dá)的BL21 (DE3)/pET30a-a-W的全菌蛋白液體中目的 蛋白a-his的92 %，該92 %的目的蛋白a-his為不溶性包涵體蛋白；說明誘導(dǎo)表達(dá)的BL21 (DE3)/pET30a-a-W的目的蛋白a-his占菌體總蛋白的90%，BL21(DE3)/pET30a-a-W表達(dá)的 目的蛋白a-his中8%為可溶性蛋白92%為不溶性包涵體蛋白。未誘導(dǎo)表達(dá)的BL21(DE3)/ pET30a-pma-W的全菌蛋白液體、誘導(dǎo)表達(dá)的BL21 (DE3)/pET30a-pma-W的全菌蛋白液體、含 蛋白上清液和含蛋白沉淀中均不含有大小為51kD的目的蛋白pma-his ;說明BL21 (DE3)/ pET30a-pma-W沒有表達(dá)目的蛋白pma-his。誘導(dǎo)表達(dá)的大腸桿菌BL21 (DE3)的全菌蛋白液體 不含有大小為41kD的目的蛋白a-his;說明大腸桿菌BL21(DE3)沒有表達(dá)目的蛋白a-his。菌 落形成單位(CFU)數(shù)量相同的誘導(dǎo)表達(dá)的BL21(DE3)/pET30a-a-Y和誘導(dǎo)表達(dá)的BL21(DE3)/ pET30a-a-W表達(dá)的菌體總蛋白質(zhì)量相同（圖1和圖2)。
[0106] 4、a-his 的純化
[0107] 將BL21(DE3)/pET30a-a-Y接種于含50μg/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基(在LB液體 培養(yǎng)基中加入卡那霉素至卡那霉素的濃度為50μg/ml得到的培養(yǎng)基）中，37°C，采用Thermo MaxQ6000型全溫振蕩器200rpm振蕩培養(yǎng)至0D6QQ值至0D6Q()值（以含50μg/ml卡那霉素的LB液 體培養(yǎng)基為空白對照)達(dá)到0.6時，加入異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。該 誘導(dǎo)表達(dá)是用〇.75mM的IPTG在16°C誘導(dǎo)13小時。
[0108] 取IPTG誘導(dǎo)表達(dá)13h后的菌液收集菌體沉淀。加入roS重懸沉淀，8000rpm/min離心 5min，棄掉上清液。向洗滌好的菌體沉淀中加入PBS，高壓破碎菌體，裂解至菌液不再粘稠， 于4°C離心機(jī)中16000rpm/min離心30min，收集上清液(命名為含蛋白上清液），棄沉淀。將含 蛋白上清液用〇.22μπι濾膜過濾后上樣至預(yù)先用溶液1(溶質(zhì)及其濃度如下：20mM Tris、 150mM NaCl，溶劑是水，pH8.0的溶液)平衡好的鎳柱。將鎳柱接入AKTA機(jī)器上，分別用10個 柱體積的溶液1與10個柱體積的溶液2(溶質(zhì)及其濃度如下：20mM Tris、150mM NaCl、50mM咪 唑，溶劑是水，PH8.0的溶液)清洗鎳柱中的雜質(zhì)蛋白，并在AKTA機(jī)器上監(jiān)測蛋白峰。用溶液3 (溶質(zhì)及其濃度如下：20mM Tris、150mM NaCl、300mM咪唑，溶劑是水，pH8.0的溶液)沖洗鎳 柱掛在鎳柱上的目的蛋白，并使用AKTA收集出現(xiàn)目的蛋白峰的洗脫樣品，將該樣品稱為鎳 柱純化的α-his(圖3)。
[0109] 將鎳柱純化的a-his用GE公司生產(chǎn)的Superdex200凝膠柱通過分子篩進(jìn)一步純化。 流動相使用溶液1。通過分子篩純化后可以除去樣品中的含有的大量咪唑，收集洗脫峰，得 到分子篩純化的a-his蛋白（圖5)，使用NanoDrop2000超微量分光光度計(ND2000)對得到的 蛋白的純度進(jìn)行定量分析。
[0110] 將純化的α-his進(jìn)行質(zhì)譜分析其氨基酸序列，結(jié)果表明α-his的氨基酸序列如SEQ ID No .2所示。
[0111] 將 BL21(DE3)/pET30a-a-Y、BL21(DE3)/pET30a-pma-W 和大腸桿菌 BL21(DE3)(簡稱 受體菌)這三個菌株分別單獨(dú)接種于含50μg/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基(在LB液體培養(yǎng)基 中加入卡那霉素至卡那霉素的濃度為50μg/ml得到的培養(yǎng)基）中，37°C，采用Thermo MaxQ6000型全溫振蕩器200rpm振蕩培養(yǎng)至0D 6QQ值（以含50μg/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基 為空白對照)達(dá)到0.6時，取出1 mL菌液作為未誘導(dǎo)表達(dá)的菌液(對照），其余液體中加入異 丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。上述三株菌的誘導(dǎo)表達(dá)均是用0.75mM的 IPTG在16°C誘導(dǎo)13小時。
[0112] 取誘導(dǎo)表達(dá)的菌液和未誘導(dǎo)表達(dá)的菌液用于蛋白表達(dá)形式分析。具體步驟為，取 lmL菌液置于1.5mL離心管中，做好標(biāo)記，4°C條件下8000rpm/min離心30min，棄掉上清液，收 集菌體沉淀。加入lmL PBS重懸沉淀，8000rpm/min離心5min，棄掉上清液。向洗滌好的菌體 沉淀中加入200yL PBS，高壓破碎菌體，裂解至菌液不再粘稠，得到全菌蛋白液體。將全菌蛋 白液體于4°C離心機(jī)中16000rpm/min離心30min，分別收集上清液(命名為含蛋白上清液)和 沉淀(命名為含蛋白沉淀），向含蛋白沉淀中加入50yL PBS重懸洗滌沉淀。向全菌蛋白液體、 含蛋白上清液和含蛋白沉淀中加入l〇yL 5 XSDS-PAGE loading Buffer，充分混勻后，置沸 水浴中煮沸5min，待樣品冷卻后，用掌式離心機(jī)瞬離。取6yL用于SDS-PAGE電泳分析。結(jié)果表 明BL21(DE3)/pET30a-a-Y表達(dá)的目的蛋白α-his以可溶性的形式存在于細(xì)菌破碎菌體的上 清液中，可溶性蛋白目的條帶表達(dá)明顯，上清液中雜質(zhì)較少。通過對AKTA機(jī)器純化洗脫條件 的優(yōu)化，可以得到純度更好的可溶性目的蛋白條帶。進(jìn)一步通過分子篩的純化后，可以除去 蛋白樣品中的含有的大量咪唑（圖4)。通過分子篩的純化后的可溶性蛋白可以作為診斷抗 原、制備成單克隆抗體或進(jìn)一步對蛋白功能與構(gòu)象關(guān)系進(jìn)行研究。
[0113] 另外，按照上述方法，將pET28a( + )的限制性內(nèi)切酶Nhel和Notl位點之間的序列替 換為SEQ ID No.l第151-1062位所示的α-Υ基因，保持pET28a( + )的其它序列不變，得到含有 α-Υ基因的重組表達(dá)載體，將該重組表達(dá)載體命名為pET28a-a-Y。將pET28a-a-Y轉(zhuǎn)入大腸桿 菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，將得到的重組大腸桿菌命名為BL21(DE3)/pET28a-a-Y。將BL21 (DE3)/pET28a-a-Y接種于含50μg/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基(在LB液體培養(yǎng)基中加入卡 那霉素至卡那霉素的濃度為50μg/ml得到的培養(yǎng)基）中，37°C，采用Thermo MaxQ6000型全溫 振蕩器200rpm振蕩培養(yǎng)至OD600值（以含50μg/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基為空白對照)達(dá)到 0.6時，取出lmL菌液作為未誘導(dǎo)表達(dá)的菌液(對照），其余液體中加入異丙基硫代-β-D-半乳 糖苷（IPTG)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。該誘導(dǎo)表達(dá)是用0.75mM的IPTG在16°C誘導(dǎo)13小時。取誘導(dǎo)表達(dá) 的菌液和未誘導(dǎo)表達(dá)的菌液按照上述方法進(jìn)行蛋白表達(dá)形式分析。結(jié)果表明，未誘導(dǎo)表達(dá) 的BL21(DE3)/pET28a-a-Y全菌蛋白液體、誘導(dǎo)表達(dá)的BL21(DE3)/pET28a-a-Y全菌蛋白液 體、誘導(dǎo)表達(dá)的BL21(DE3)/pET28a-a-Y含蛋白上清液和誘導(dǎo)表達(dá)的BL21(DE3)/pET28a-a-Y 含蛋白沉淀中均沒有目的蛋白的表達(dá)?？梢?，雖然采用同一種外源目的基因（α-Υ基因），在 不同的BL21(DE3)表達(dá)載體-pET28a( + )和pET30a( + )中，外源目的基因的表達(dá)情況相差很 大，將α-Υ基因通過pET30a( + )導(dǎo)入大腸桿菌BL21 (DE3)可獲得α-Υ基因的高效可溶性表達(dá)， 將α-Υ基因通過pET28a( + )導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)中，α-Υ基因卻沒有表達(dá)。
[0114] 實施例2、a-his的動物免疫保護(hù)性試驗
[0115] 1、抗產(chǎn)氣莢膜梭菌疫苗的制備
[0116] 將實施例1中分子篩純化的a-his蛋白用無菌roS溶解，得到a-his濃度為1000yg/ mL的a-his溶液，用于免疫。將a-his溶液與弗氏佐劑按1:1等體積混合，乳化制備油乳劑疫 苗，將其命名為首免疫苗。將a-his溶液與不完全弗氏佐劑按1:1等體積混合，乳化制備油乳 劑疫苗，將其命名為二免疫苗。
[0117] 取出從中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所購買到的A型產(chǎn)氣莢膜梭菌強(qiáng)毒株C57-10、B型產(chǎn)氣莢 膜梭菌強(qiáng)毒株C58-5、C型產(chǎn)氣莢膜梭菌強(qiáng)毒株C59-4、D型產(chǎn)氣莢膜梭菌強(qiáng)毒株C60-11。在超 凈工作臺中，用75 %酒精棉球仔細(xì)擦拭保存菌種的安瓿瓶外壁，然后用砂輪在安瓶的上三 分之一處做一劃痕，再用干燥的無菌紗布包裹安瓶將其掰開。吸取400yL厭氧肉肝湯液體培 養(yǎng)基反復(fù)吹打安瓶中的菌種，使凍干菌種溶解菌懸液。按照1:100的比例將菌懸液接種到含 有牛肉膏的厭氧肉肝湯的試管中，并在試管上層加蓋l-2cm的液體石蠟隔絕空氣。將接好菌 的試管放入?yún)捬跖囵B(yǎng)箱，置37°C恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)16-24h后，觀察細(xì)菌的生長情況。復(fù)蘇 后的菌種經(jīng)過涂片、染色、鏡檢，確認(rèn)無誤后傳1-2代后使用，并將一部分菌種用30%的甘油 鹽水-80°C冰箱保存。
[0118] 2、A型產(chǎn)氣莢膜梭菌攻毒試驗
[0119] 按照如下方法測試α-his對A型產(chǎn)氣莢膜梭菌強(qiáng)毒株C57-10的抗性試驗：
[0120]將30只體重在18-22g的雌性昆明小鼠，隨機(jī)分成2組(攻毒劑量組20只，并設(shè)10只 小鼠的PBS對照組）。攻毒劑量組，首次免疫、第二次免疫與第三次免疫均采用皮下注射的方 法進(jìn)行免疫，首次免疫用首免疫苗，第二次免疫與第三次免疫用二免疫苗，每次免疫劑量均 為0.2mL/只（α-his免疫劑量為100yg/只）；PBS對照組中的每只小鼠首次免疫、第二次免疫 與第三次免疫，皮下注射〇.2mL PBS。首次免疫之前，先對小鼠進(jìn)行一次割尾采血，分離血 清，用作陰性對照血清。首次免疫后，間隔14d進(jìn)行第二次免疫，二免后14d進(jìn)行第三次免疫。 第三次免疫兩周后每只攻毒劑量組小鼠和每只PBS對照組小鼠腹腔注射1.5 X 109cfu的A型 產(chǎn)氣莢膜梭菌強(qiáng)毒株C57-10進(jìn)行攻毒試驗。自一免后開始，每組小鼠每周采血一次，每組采 5只，分離血清，于-80°C冰箱保存，用于檢測抗體。采用間接ELISA檢測免疫動物抗體水平， 具體方法如下：
[0121] 1)包被:將實施例1中分子篩純化的a-his用0.05mol/L p Η 9.0的碳酸鹽包被緩 沖液進(jìn)行稀釋，然后按1 〇〇μL7孔逐一加入ELISA板中，將加好的ELISA板置4°C冰箱中過夜；
[0122] 2)洗滌:從4°C冰箱中取出ELISA板，棄去板孔內(nèi)的液體，并在濾紙上拍干，向每孔 加入200yL PBST置于洗板機(jī)中進(jìn)行洗版，重復(fù)4次。
[0123] 3)封閉：向ELISA板的每個孔中加入100yL含有5%脫脂乳的PBST溶液，放入37°C溫 箱孵育lh;
[0124] 4)洗滌：向每孔加入200yL PBST置于洗板機(jī)中進(jìn)行洗版，重復(fù)4次；
[0125] 5)加待檢血清:將待檢血清按比例用滅菌ros進(jìn)行稀釋，每孔加100yL，同時設(shè)陰性 對照、陽性對照和空白對照孔，放入37°C溫箱孵育lh;
[0126] 6)洗滌：向每孔加入200yL PBST置于洗板機(jī)中進(jìn)行洗版，重復(fù)4次；
[0127] 7)酶標(biāo)二抗結(jié)合:將HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗用含有5%脫脂乳的PBS封閉緩沖液按 1:20 000-1:40000濃度稀釋后，分別向每孔加入100yL，放入37°C溫箱孵育lh;
[0128] 8)洗滌：向每孔加入200yL PBST置于洗板機(jī)中進(jìn)行洗板，重復(fù)4次；
[0129] 9)顯色反應(yīng):將新鮮配制的TMB顯色液按lOOyL/孔加入到ELISA板的各個孔中，放 入37°C溫箱避光顯色15min;
[0130] 10)終止反應(yīng)：向按照50yL/孔加入2mol/L的濃H2S〇4終止液，放入37°C溫箱反應(yīng) 5min，終止顯色；
[0131 ] 11)讀數(shù):將終止顯色的ELISA板放酶標(biāo)儀中檢測0D·的值。
[0132] 12)判定檢測結(jié)果：用確定好的陰陽性臨界值來判定檢測結(jié)果。陽性臨界值=陰性 樣本的0D4 5Q平均值+3S(S為標(biāo)準(zhǔn)方差）。待檢血清的效價為待檢血清的0D值多陽性臨界值時 所對應(yīng)的血清稀釋度。
[0133] 3、B型產(chǎn)氣莢膜梭菌攻毒試驗
[0134] 除了將A型產(chǎn)氣莢膜梭菌強(qiáng)毒株C57-10替換為B型產(chǎn)氣莢膜梭菌強(qiáng)毒株C58-5，攻 毒劑量調(diào)整為2 X 109cfu外，其它操作完全相同。
[0135] 4、C型產(chǎn)氣莢膜梭菌攻毒試驗
[0136] 除了將A型產(chǎn)氣莢膜梭菌強(qiáng)毒株C57-10替換為C型產(chǎn)氣莢膜梭菌強(qiáng)毒株C59-4，攻 毒劑量調(diào)整為1.5 X 108cfu外，其它操作完全相同。
[0137] 5、D型產(chǎn)氣莢膜梭菌攻毒試驗
[0138] 除了將A型產(chǎn)氣莢膜梭菌強(qiáng)毒株C57-10替換為D型產(chǎn)氣莢膜梭菌強(qiáng)毒株C60-11，攻 毒劑量調(diào)整為1.8 X 109cfu外，其它操作完全相同。
[0139] 攻毒劑量組和PBS對照組實驗小鼠在三免二周后，分別使用各型產(chǎn)氣莢膜梭菌 1MLD 100的劑量對小鼠進(jìn)行攻毒，并于一周內(nèi)觀察和記錄小鼠發(fā)病死亡情況。攻毒結(jié)果表 明，攻毒劑量組(免疫α-his)對各型產(chǎn)氣莢膜梭菌的攻擊均具有一定的免疫保護(hù)效果。攻毒 劑量組(免疫a-his)在抵抗A型產(chǎn)氣莢膜梭菌攻擊時的7天內(nèi)的免疫保護(hù)率為100% (20只存 活，0只死亡），PBS對照組小鼠全部死亡；攻毒劑量組(免疫a-his)在抵抗B型產(chǎn)氣莢膜梭菌 攻擊時的免疫保護(hù)率為90% (18只存活，2只死亡），PBS對照組小鼠全部死亡；攻毒劑量組 (免疫a-his)在抵抗C型產(chǎn)氣莢膜梭菌攻擊時的免疫保護(hù)率為85% (17只存活，3只死亡）， PBS對照組小鼠全部死亡;攻毒劑量組(免疫a-hi s)在抵抗D型產(chǎn)氣莢膜梭菌攻擊時的免疫 保護(hù)率為90% (18只存活，2只死亡），而PBS對照組小鼠全部死亡。將純化后的a-his作為診 斷抗原包被酶標(biāo)板檢測檢測小鼠免疫抗原或者攻毒后的血清抗體，發(fā)現(xiàn)a-his作為診斷抗 原建立的檢測方法均具有非常好的靈敏性與特異性。分別檢測各實驗組中小鼠初免后0-6 周的血清中抗體效價水平，結(jié)果表明a-his融合毒素蛋白免疫組抗體效價有明顯升高，在二 免后抗體效價快速上升，三免后7-14天抗體效價達(dá)到峰值，最高抗體效價達(dá)1:128000。
[0140] 實施例3、a-his誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化
[0141] 1、誘導(dǎo)溫度和時間的優(yōu)化
[0142] 將BL21(DE3)/pET30a-a-Y接種于含50μg/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基(在LB液體 培養(yǎng)基中加入卡那霉素至卡那霉素的濃度為50μg/ml得到的培養(yǎng)基）中，37°C，采用Thermo MaxQ6000型全溫振蕩器200rpm振蕩培養(yǎng)至0D 6QQ值（以含50μg/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基 為空白對照)達(dá)到0.6時，加入異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG)分別進(jìn)行下述6種誘導(dǎo)表 達(dá)。第一種誘導(dǎo)表達(dá)是用0.75mM的IPTG在37°C誘導(dǎo)1小時。第二種誘導(dǎo)表達(dá)是用0.75mM的 IPTG在37°C誘導(dǎo)2小時。第三種誘導(dǎo)表達(dá)是用0.75mM的IPTG在37°C誘導(dǎo)4小時。第四種誘導(dǎo) 表達(dá)是用〇.75mM的IPTG在37°C誘導(dǎo)5小時。第五種誘導(dǎo)表達(dá)是用0.75mM的IPTG在16°C誘導(dǎo) 13小時。第六種誘導(dǎo)表達(dá)是用0.75mM的IPTG在16°C誘導(dǎo)24小時。
[0143] 取lmL誘導(dǎo)后的重組菌液置于1.5mL離心管中，做好標(biāo)記，4°C條件下8000rpm/min 離心30min，棄掉上清液，收集菌體沉淀。加入lmL PBS重懸沉淀，8000rpm/min離心5min，棄 掉上清液。向洗滌好的菌體沉淀中加入200此PBS，高壓破碎菌體，裂解至菌液不再粘稠，得 到全菌蛋白液體。向全菌蛋白液體中加入1〇此5XSDS-PAGE loading Buffer，充分混勾 后，置沸水浴中煮沸5min，待樣品冷卻后，用掌式離心機(jī)瞬離。取6yL用于SDS-PAGE電泳分 析。結(jié)果表明BL21(DE3)/pET30a-a-Y在誘導(dǎo)溫度為37°C，誘導(dǎo)時間在l_4h的條件下，a-his 蛋白表達(dá)量隨時間延長逐漸上升，5h誘導(dǎo)條件下蛋白表達(dá)量有所下降。但是隨著誘導(dǎo)溫度 的降低，a-his表達(dá)量也有所增加，當(dāng)誘導(dǎo)溫度降低至16°C，時間為誘導(dǎo)13h時，a-his表達(dá)量 達(dá)到最高，目的蛋白a-hi s占全菌總蛋白的90 %。繼續(xù)培養(yǎng)至24h，a-hi s的表達(dá)量略有下降， 因此，通過實驗驗證BL21(DE3)/pET30a-a-Y的最佳誘導(dǎo)溫度為16°C，誘導(dǎo)時間為13-24h。
[0144] 2、IPTG濃度的優(yōu)化
[0145] 將BL21(DE3)/pET30a-a-Y接種于含50μg/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基(在LB液體 培養(yǎng)基中加入卡那霉素至卡那霉素的濃度為50μg/ml得到的培養(yǎng)基）中，37°C，采用Thermo MaxQ6000型全溫振蕩器200rpm振蕩培養(yǎng)至0D6QQ值（以含50μg/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基 為空白對照)達(dá)到0.6時，加入異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG)分別進(jìn)行下述6種誘導(dǎo)表 達(dá)。第一種誘導(dǎo)表達(dá)是用O.lmM的IPTG在16°C誘導(dǎo)13小時。第二種誘導(dǎo)表達(dá)是用0.3mM的 IPTG在16°C誘導(dǎo)13小時。第三種誘導(dǎo)表達(dá)是用0.5mM的IPTG在16°C誘導(dǎo)13小時。第四種誘導(dǎo) 表達(dá)是用〇.75mM的IPTG在16°C誘導(dǎo)13小時。第五種誘導(dǎo)表達(dá)是用ImM的IPTG在16°C誘導(dǎo)13 小時。第六種誘導(dǎo)表達(dá)是用OmM的IPTG在16 °C誘導(dǎo)13小時。
[0146] 取lmL誘導(dǎo)后的重組菌液置于1.5mL離心管中，做好標(biāo)記，4°C條件下8000rpm/min 離心30min，棄掉上清液，收集菌體沉淀。加入lmL PBS重懸沉淀，8000rpm/min離心5min，棄 掉上清液。向洗滌好的菌體沉淀中加入200此PBS，高壓破碎菌體，裂解至菌液不再粘稠，得 到全菌蛋白液體。將全菌蛋白液體于4 °C離心機(jī)中16000rpm/min離心30min，收集上清液(命 名為含蛋白上清液），向含蛋白上清液中加入l〇yL 5 XSDS-PAGE loading Buffer，充分混 勻后，置沸水浴中煮沸5min，待樣品冷卻后，用掌式離心機(jī)瞬離。取6yL用于SDS-PAGE電泳分 析。結(jié)果表明α-his在不同濃度的IPTG誘導(dǎo)下，表達(dá)量也有所不同。α-his表達(dá)量與加入IPTG 濃度在〇. 1-0.75mM之間呈遞增關(guān)系。當(dāng)IPTG誘導(dǎo)濃度為ImM時，蛋白表達(dá)量有所減少，這可 能與IPTG本身的毒性有關(guān)。因此選擇IPTG濃度0.75mM為最佳誘導(dǎo)濃度。
[0147] 3、誘導(dǎo)時間的優(yōu)化
[0148] 將BL21(DE3)/pET30a-a-Y接種于含50μg/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基(在LB液體 培養(yǎng)基中加入卡那霉素至卡那霉素的濃度為50μg/ml得到的培養(yǎng)基）中，37°C，采用Thermo MaxQ6000型全溫振蕩器200rpm振蕩培養(yǎng)至0D 6QQ值（以含50μg/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基 為空白對照)達(dá)到0.6時，加入異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG)分別進(jìn)行下述2種誘導(dǎo)表 達(dá)。第一種誘導(dǎo)表達(dá)是用0.75mM的IPTG在16°C誘導(dǎo)13小時。第二種誘導(dǎo)表達(dá)是用0.75mM的 IPTG在16°C誘導(dǎo)16小時。
[0149] 取lmL誘導(dǎo)后的重組菌液置于1.5mL離心管中，做好標(biāo)記，4°C條件下8000rpm/min 離心30min，棄掉上清液，收集菌體沉淀。加入lmL PBS重懸沉淀，8000rpm/min離心5min，棄 掉上清液。向洗滌好的菌體沉淀中加入200此PBS，高壓破碎菌體，裂解至菌液不再粘稠，得 到全菌蛋白液體。
[0150] 向全菌蛋白液體中加入10yL 5 XSDS-PAGE loading Buffer，充分混勻后，置沸水 浴中煮沸5min，待樣品冷卻后，用掌式離心機(jī)瞬離。取6yL用于SDS-PAGE電泳分析。
[0151] 結(jié)果表明BL21(DE3)/pET30a-a-Y在誘導(dǎo)溫度為16°C，誘導(dǎo)時間在13h與16h的條件 下，目的蛋白a-his表達(dá)量變化不大，此時表達(dá)的蛋白幾乎均為可溶性蛋白，沉淀中的不溶 性包涵體蛋白幾乎沒有表達(dá)。當(dāng)誘導(dǎo)溫度為16°C，誘導(dǎo)時間在13h與16h的條件下表達(dá)的可 溶性目的蛋白純度較高，表達(dá)量接近。因此，通過實驗驗證，進(jìn)一步確定了重組菌的最佳誘 導(dǎo)溫度為16°C，誘導(dǎo)時間為13_16h。
【主權(quán)項】
1. 制備重組α蛋白的方法，包括使重組α蛋白的編碼基因在生物中進(jìn)行表達(dá)得到所述重 組α蛋白的步驟;所述生物為微生物、植物或非人動物； 所述重組α蛋白為a)或b)或c)或d): a) 由SEQ ID No.2的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； b) 由SEQ ID No.2第51-353位所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； c) 在a)或b)所示的蛋白質(zhì)的羧基端或/和氨基端融合蛋白標(biāo)簽得到的融合蛋白； d) 將SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/ 或添加得到的可溶性蛋白質(zhì)。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述使重組α蛋白的編碼基因在生物中進(jìn) 行表達(dá)包括將所述重組α蛋白的編碼基因?qū)胧荏w微生物，得到表達(dá)所述重組α蛋白的重組 微生物，培養(yǎng)所述重組微生物，表達(dá)得到所述重組α蛋白。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于:所述受體微生物為Cl )_C4)中的任一種： C1)原核微生物； C2)革蘭氏陰性細(xì)菌； C3)埃希氏菌屬細(xì)菌； C4)大腸桿菌BL21(DE3)。4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于:所述蛋白質(zhì)的編碼基因為如下1) 或2)或3)或4)所示的基因： 1) 編碼序列是SEQ ID No.l所示的DNA分子； 2) 編碼序列是SEQ ID No. 1的第151-1062位所示的DNA分子； 3) 與1)或2)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且編碼所述重組α蛋白。5. 根據(jù)權(quán)利要求2-4中任一所述的方法，其特征在于:所述重組微生物為將pET30a-a-Y 導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)得到的表達(dá)氨基酸序列是SEQ ID No.2的重組α蛋白的重組微生 物，所述重組微生物命名為BL21(DE3)/pET30a-a-Y，所述pET30a-a-Y為將載體pET30a( + )的 BamHI和Xhol位點之間的序列替換為SEQ ID No. 1第151-1062位所示的DNA片段得到的重組 載體。6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于:所述表達(dá)為誘導(dǎo)表達(dá)。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于:所述誘導(dǎo)表達(dá)是用0.75mM的IPTG在16 °C誘 導(dǎo)13-16小時或13-24小時或13小時或16小時。8. 下述任一種產(chǎn)品： P1)重組α蛋白，所述重組α蛋白為a)或b)或c)或d): a) 由SEQ ID No.2的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； b) 由SEQ ID No.2第51-353位所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； c) 在a)或b)所示的蛋白質(zhì)的羧基端或/和氨基端融合蛋白標(biāo)簽得到的融合蛋白； d) 將SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/ 或添加得到的可溶性蛋白質(zhì)； P2)與所述重組α蛋白相關(guān)的生物材料，所述生物材料為下述B1)至B16)中的任一種： Β1)編碼所述重組α蛋白的核酸分子； Β2)含有Β1)所述核酸分子的表達(dá)盒； B3)含有B1)所述核酸分子的重組載體； B4)含有B2)所述表達(dá)盒的重組載體； B5)含有B1)所述核酸分子的重組微生物； B6)含有B2)所述表達(dá)盒的重組微生物； B7)含有B3)所述重組載體的重組微生物； B8)含有Μ)所述重組載體的重組微生物； Β9)含有Β1)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因動物細(xì)胞系； Β10)含有Β2)所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因動物細(xì)胞系； Β11)含有Β3)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因動物細(xì)胞系； Β12)含有Μ)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因動物細(xì)胞系； Β13)含有Β1)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系； Β14)含有Β2)所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系； Β15)含有Β3)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系； Β16)含有M)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系； Ρ3)預(yù)防動物產(chǎn)氣莢膜梭菌感染的疫苗，其含有所述重組α蛋白或所述生物材料。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的產(chǎn)品，其特征在于:所述重組α蛋白按照權(quán)利要求1-7中任一所 述的方法制備； 所述核酸分子為如下1)或2)或3)所示的基因： 1) 編碼序列是SEQ ID No.l所示的DNA分子； 2) 編碼序列是SEQ ID No. 1的第151-1062位所示的DNA分子； 3) 與1)或2)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的DNA 分子； 所述重組載體為權(quán)利要求5中所述pET30a-a-Y; 所述重組微生物為El)或E2): E1)所述重組微生物為將所述重組α蛋白的編碼基因?qū)胧荏w微生物，得到表達(dá)所述重 組α蛋白的重組微生物，所述受體微生物為Cl )_C4)中的任一種： C1)原核微生物； C2)革蘭氏陰性細(xì)菌； C3)埃希氏菌屬細(xì)菌； C4)大腸桿菌BL21(DE3); 所述重組微生物為將權(quán)利要求5中所述BL21 (DE3 )/pET30a-a-Y; 所述預(yù)防動物產(chǎn)氣莢膜梭菌感染的疫苗的活性成分為所述重組α蛋白或所述生物材 料。10. 下述任一種應(yīng)用： Y1)權(quán)利要求8或9中所述重組α蛋白在制備抗產(chǎn)氣莢膜梭菌疫苗中的應(yīng)用； Y2)權(quán)利要求8或9中所述生物材料在制備抗產(chǎn)氣莢膜梭菌疫苗中的應(yīng)用； Y3)權(quán)利要求1-7中任一所述的方法在制備抗產(chǎn)氣莢膜梭菌疫苗中的應(yīng)用； Y4)權(quán)利要求8或9中所述重組α蛋白在制備產(chǎn)氣莢膜梭菌病診斷抗原中的應(yīng)用； Y5)權(quán)利要求8或9中所述重組α蛋白在制備單克隆抗體中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/85GK106008684SQ201610304595
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年5月9日
【發(fā)明人】宋曉暉, 孫雨, 翟新驗, 胡冬梅
【申請人】中國動物疫病預(yù)防控制中心