專利名稱：一種生產(chǎn)棉花植株的組織培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從植物的特異性組織體外產(chǎn)生大量能存活的棉花植株的組織培養(yǎng)方法。本發(fā)明提供了一種同步化體細(xì)胞胚發(fā)生的方法，開啟了通過現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生物技術(shù)和遺傳工程的方法，獲得農(nóng)學(xué)上改進(jìn)的均一棉花植株群體的新的可能性。該方法提供了利用組織培養(yǎng)技術(shù)成功改進(jìn)棉花項目中的一個重要步驟。
背景技術(shù)：
棉花是一種重要的全球作物，其種植主要為獲得纖維。棉籽為家畜的重要食物來源。棉花影響全世界許多國家的經(jīng)濟發(fā)展。因此，通過農(nóng)業(yè)生物技術(shù)的現(xiàn)代方法改進(jìn)棉花的項目引起了全世界興趣。這增加了發(fā)展組織培養(yǎng)以促進(jìn)遺傳工程的現(xiàn)代技術(shù)應(yīng)用于棉花植株的重要性。盡管棉花具有重要的經(jīng)濟價值，由于缺乏重現(xiàn)性好、耗時少和效率高的方法高頻再生棉花的機體組織和植株，通過遺傳工程的棉花改進(jìn)僅以相對緩慢的速度進(jìn)行。
已很好地建立了通過組織培養(yǎng)技術(shù)再生植物。雖然植物細(xì)胞的全能性是眾所周知的現(xiàn)象，但各種植物或植物各部分需要專業(yè)研究，以創(chuàng)造這種高效高頻再生的條件。似乎多數(shù)人認(rèn)為，成功誘導(dǎo)分化依賴于外植體的類型、外植體的生理條件和外植體在培養(yǎng)過程中的理化環(huán)境。因此，組織培養(yǎng)科學(xué)涉及優(yōu)化來源植物的生理條件、外植體的類型、培養(yǎng)條件及植物生長調(diào)節(jié)劑或用于起始組織反應(yīng)的其它培養(yǎng)基附加物。
在體外器官發(fā)生中或通過體細(xì)胞胚發(fā)生，已成功再生了各種各樣的植物品種。選擇的再生模式常基于植物品種遺傳轉(zhuǎn)化方法的相對情況、效率和適用性。不以分生組織為基礎(chǔ)的方法，即體細(xì)胞胚發(fā)生的方法通常是一種優(yōu)選的模式，因為其排除了假陽性或嵌合轉(zhuǎn)化體的可能性。
通過體細(xì)胞胚發(fā)生從外植體再生包括幾個生長時期。最常見的是，在無菌條件下給予來自成熟植物部分或器官或萌發(fā)籽苗的外植體以化學(xué)成分明確的營養(yǎng)培養(yǎng)基。培養(yǎng)時，在人工控制的光線、溫度和光周期條件下，切除的植物部分將產(chǎn)生分化的細(xì)胞團(tuán)塊，稱為愈傷組織。
在一系列合適的理化環(huán)境下，即營養(yǎng)物、光線、溫度、光周期以及通過加入合適組合的和合適濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑，或通過突然去除這些因素，作為這種條件下培養(yǎng)的結(jié)果，據(jù)報道一些植物品種的愈傷組織產(chǎn)生了胚形成愈傷組織，這些愈傷組織反過來又通過體細(xì)胞胚發(fā)生的過程形成體細(xì)胞胚。
體細(xì)胞胚是體細(xì)胞發(fā)育出來的胚芽。每個體細(xì)胞胚都是能發(fā)育成完整植株的有序組織團(tuán)塊。體細(xì)胞胚與種子發(fā)育的合子胚非常相似，除了它們的發(fā)育不包括減數(shù)細(xì)胞分裂(減數(shù)分裂)，并且尺寸常常更大。
一種或多種培養(yǎng)基成分濃度的變化可導(dǎo)致植物組織體外發(fā)育和分化的變化。有報道磷酸肌醇介導(dǎo)的信號途徑會影響植物的發(fā)育和胚發(fā)生。在特定時期使組織肌醇饑餓一定時間可使組織發(fā)育同步化，而不降低其生存能力。然而，在完成植物或體外胚發(fā)育的同步化過程中以前未有使用肌醇的報道，其是本發(fā)明的最重要方面。
迄今，已有幾篇關(guān)于棉花體細(xì)胞胚發(fā)生技術(shù)的報道已出版或授予了專利權(quán)。經(jīng)過特定處理的外植體種體細(xì)胞胚發(fā)生頻率通常較低。此外，從每個外植體獲得的胚數(shù)不高。體外胚發(fā)生所需時間周期長和方法的基因型依賴性進(jìn)一步增加了棉花體細(xì)胞胚發(fā)生的難度。
如果能開發(fā)一種用于棉花模式品種的方法以提供一套能改善體細(xì)胞胚發(fā)生頻率的配方設(shè)計和條件，并且如果該方法需要較少的時間將是有利的。同步化發(fā)育利于收獲更多數(shù)量的再生植株。同步化發(fā)育不僅生產(chǎn)大量的植株，而且同一生長期的所有植物群體均一。簡化步驟和配方設(shè)計能進(jìn)一步增強該方法的適用性。使用液體培養(yǎng)基進(jìn)一步利于遺傳轉(zhuǎn)化(轉(zhuǎn)基因植物發(fā)育)過程中的高效選擇，因為在液體培養(yǎng)中的選擇壓力(例如，對抗生素的抗性)能更均勻地穿透細(xì)胞。所有這些方面在本發(fā)明中已實現(xiàn)。棉花胚的同步化發(fā)育以前未曾提及并且是本發(fā)明的一個重要方面。
現(xiàn)有技術(shù)的描述有幾篇公布的報道研究了導(dǎo)致棉花胚發(fā)生和植物再生的組織培養(yǎng)條件。
Davidonis和Hamilton在Plant Sci.Letter(1983)3289-93和美國專利No.4,672,035(1987)中報道了2歲G.hirsutum愈傷組織中的體細(xì)胞胚發(fā)生。Shoemaker等人，1986年表征了17個棉花栽培品種中的體細(xì)胞胚發(fā)生和植株再生(Plant Cell Rep.3178-181)。Trolinder和Goodin(1987)及Finer(1988)報道了棉花懸浮培養(yǎng)中的體細(xì)胞胚發(fā)生(Plant Cell Rep 6231-234；Plant Cell Rep.7399-402)。這些方法花了幾個月時間發(fā)育再生的植物。這些方法高度依賴于基因型(Trolinder和Xhixian，1989 Plant CellRep.8133-136)，因此，僅可應(yīng)用于少數(shù)棉花栽培品種。由于培養(yǎng)時間長，這些方法發(fā)育的植物常報道為不育或具有細(xì)胞遺傳學(xué)異常(Trolinder andGoodin，1987 Plant Cell Rep.6231-234)。Rangan(1993)在美國專利no.5,244,802和Rangan and Rajasekaran(1997)在美國專利No.5,695,999中報道了幾種棉花變種中來自籽苗的外植體的胚發(fā)生。Gawel和Robacker(1990)在Plant Cell Tiss.Organ Cult.23201-204中比較了半固體和液體增殖培養(yǎng)基上棉花的體細(xì)胞胚發(fā)生。Kumar等人，1998年報道了利用改進(jìn)的Trolinder和Goodin方法在Coker 310與印度棉花變種的F1雜種中的體細(xì)胞胚發(fā)生。Zhang等人，2000年在Plant Cell Tiss.Organ Cult.6089-94中描述了源于異常體細(xì)胞胚衍生的外植體的體細(xì)胞胚發(fā)生。
已將其中的幾種方法或其改進(jìn)用于Agrobacterium介導(dǎo)的棉花轉(zhuǎn)化(Umbeck et al.，1987 Bio/Technology 5263-266；Firoozabady et al.，1987Plant Mol.Biol.10105-116)或粒子轟擊介導(dǎo)的棉花轉(zhuǎn)化(Finer andMcMullen，1990 Plant Cell Rep.8586-589)。已將某些細(xì)菌基因，如那些編碼除草劑抗性的基因(Bayley et al.，1992 Theo.Appl.Genet.83645-649)以及蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)內(nèi)毒素基因(Perlak et al.，1990Bio/Technology 8939-943)在轉(zhuǎn)基因植物中成功表達(dá)。Strickland(1998)在美國專利No.5,846,797中報道了轉(zhuǎn)化的外植體在不含生長調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基上再生。一旦有可用的高效再生方法，特別是體細(xì)胞胚發(fā)生，就可將其便利地用于棉花的轉(zhuǎn)化或遺傳工程。
將以前的各種技術(shù)之間的比較提供如下表1表1 誘導(dǎo)體細(xì)胞胚發(fā)生的現(xiàn)有棉花再生技術(shù)的綜述
表1中的報道4聲稱開發(fā)植物為不育的，而本申請描述的方法給出了可育的健康植物。相對于從田間生長的植株收集的籽苗外植體隨機選擇庫，本方法給出了高頻率的體細(xì)胞胚發(fā)生。這是在早期報道基礎(chǔ)上的重要進(jìn)步，其中外植體取自已經(jīng)篩選而用于體細(xì)胞胚發(fā)生的樣品(表1的報道11和12)。此外，至今未有公開報道描述棉花體細(xì)胞胚發(fā)生的同步化。此外，沒有報道描述任何其它植物將肌醇饑餓法用作工具以在體細(xì)胞胚發(fā)育中誘導(dǎo)同步化。對于棉花來說，體細(xì)胞胚同步化發(fā)育在現(xiàn)有技術(shù)中是不可能的，而其是本發(fā)明的一個非常重要的成就。
本發(fā)明的成功依賴于用于在外植體誘導(dǎo)愈傷組織的植物生長調(diào)節(jié)劑的濃度和組合，以及使用本發(fā)明的包括短期肌醇饑餓階段的方法培養(yǎng)愈傷組織的方式。一旦誘導(dǎo)出愈傷組織，該方法任何后續(xù)步驟中就不需要任何外源的植物生長調(diào)節(jié)劑或其它培養(yǎng)基添加劑(例如，報道4和6中額外的KNO3以及報道11和12中的活性炭)。體細(xì)胞胚在簡化液體萌發(fā)培養(yǎng)基中發(fā)芽和生根，該培養(yǎng)基位于以非膠凝劑為基礎(chǔ)的便宜且簡單的載體(例如，蛭石)上。在這方面，本發(fā)明描述了適于商品化的簡單且更便宜的方法。
本發(fā)明首次描述了肌醇影響體外生長的植物細(xì)胞的發(fā)育和分化。該方法詳細(xì)描述了為了使體細(xì)胞胚同步化發(fā)育而在特定時間和時間段使用不含肌醇的培養(yǎng)基。當(dāng)選擇的胚發(fā)生細(xì)胞團(tuán)塊經(jīng)受8-12天肌醇饑餓后，將培養(yǎng)物放回含有肌醇的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，此時發(fā)現(xiàn)幾乎所有胚處于球形期。進(jìn)一步生長10天后，絕大部分胚(92％)處于心形期。在隨后的傳代培養(yǎng)中約82％的胚處于魚雷期。當(dāng)胚發(fā)生團(tuán)塊經(jīng)受8-12天2個周期的肌醇饑餓，在球形期后未觀察到所述的發(fā)育同步化。此外，短期的肌醇饑餓不僅使胚發(fā)育同步化，而且最終回收的胚數(shù)令人驚訝地增加至4-5倍的高值。
關(guān)于棉花的本領(lǐng)域早期專利為美國專利No.4,672,035；美國專利No5,244,802；美國專利No.5,695,999；EP 344302和美國專利No.5,846,797，其中發(fā)明者公開了通過體細(xì)胞胚發(fā)生從棉花愈傷組織再生植株的方法；美國專利No.5,846,797；美國專利No.5,004,863；美國專利No.5,159,135及EP 344302，其中發(fā)明者公開了一種轉(zhuǎn)化棉花的方法，包括基于體細(xì)胞胚發(fā)生的再生方法，以及WO A1 9215675，其中發(fā)明者公開了一種轟擊介導(dǎo)的棉花胚軸轉(zhuǎn)化方法，由此處發(fā)育轉(zhuǎn)基因植物。
本發(fā)明中描述的方法非常簡單，適于商品化；并且快速、具有重現(xiàn)性以及便于在植物遺傳工程中應(yīng)用。與本領(lǐng)域其它現(xiàn)有技術(shù)不同，本方法不會導(dǎo)致形態(tài)學(xué)和細(xì)胞遺傳學(xué)異常的植物形成，不同于Stelly等人，1989，并且不會在轉(zhuǎn)化試驗中產(chǎn)生假陽性轉(zhuǎn)化體，不同于Sunilkumar andRathore，2001。
發(fā)明目的本發(fā)明的一個重要目的是提供一種方法，其用于在發(fā)育學(xué)上同步化棉花體細(xì)胞胚發(fā)生，并支持從特定植物組織再生大量植株。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種通過體細(xì)胞胚發(fā)生再生棉花的改進(jìn)方法，在該方法中再生的植物生長、成熟并形成可育的植物。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種簡單且具有重現(xiàn)性的體細(xì)胞胚發(fā)生方法，至少涉及外部補充的植物生長調(diào)節(jié)劑和任何其它額外培養(yǎng)基添加劑。
發(fā)明概述本發(fā)明首次提供了一種通過發(fā)育學(xué)上同步化體細(xì)胞胚發(fā)生再生棉花植株的高效方法。本發(fā)明的方法簡單、快速、具有重現(xiàn)性并且便于在植物遺傳工程中應(yīng)用。新穎性的最重要方面是通過肌醇饑餓的步驟實現(xiàn)了同步化體細(xì)胞胚發(fā)生。該重要方面在申請者已知的任何現(xiàn)有技術(shù)中未被提及或甚至未被暗示。
本發(fā)明的方法使用了不同于早期報道中所用的生長調(diào)節(jié)劑組合(2，4二氯苯氧基乙酸和苯甲基腺嘌呤)從籽苗外植體誘導(dǎo)愈傷組織。本發(fā)明的方法實現(xiàn)了愈傷組織介導(dǎo)的體細(xì)胞胚發(fā)生，其花費的時間更短，且產(chǎn)生更多數(shù)量的正?？捎参铩?br> 因此，根據(jù)本發(fā)明，提供了一種通過從下胚軸段或中胚軸段或子葉片同步化體細(xì)胞胚發(fā)生而再生大量能存活和可育棉花植株的方法，所述的方法包括-
(i)以消毒劑處理棉花種子，以去除任何有害的污染物。
(ii)將來自步驟(i)的處理過的種子培養(yǎng)于第一培養(yǎng)基中，以便發(fā)芽，該培養(yǎng)基由下述物質(zhì)組成(a)任何傳統(tǒng)培養(yǎng)基使用的鹽，(b)任何傳統(tǒng)培養(yǎng)基使用的維生素，(c)肌醇，以及(d)碳源pH范圍為5.2-6.0，用高壓鍋滅菌培養(yǎng)基，將培養(yǎng)物于23-33℃溫度光照(以30-60μmol/m2/s的強度)或黑暗中培育6-12天。
(iii)培養(yǎng)來自步驟(ii)中獲得的籽苗的外植體。
(iv)在第二固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)從步驟(iii)獲得的外植體以誘導(dǎo)愈傷組織，該固體培養(yǎng)基由下述物質(zhì)組成(a)任何傳統(tǒng)培養(yǎng)基使用的鹽，(b)任何傳統(tǒng)培養(yǎng)基使用的維生素，(c)肌醇，(d)碳源，(e)2，4D和BA組合的植物生長調(diào)節(jié)劑，以及(f)膠凝劑在pH范圍為5.4-6.2，用高壓鍋滅菌該培養(yǎng)基，將培養(yǎng)物培育于23-33℃、至少90μmol/m2/s強度的光照、16h光周期條件下；(v)繼續(xù)培養(yǎng)3-5周時間直到從傷口邊緣形成愈傷組織。
(Vi)將來自步驟2產(chǎn)生的愈傷組織以600-1000mg愈傷組織/50ml培養(yǎng)基的填充密度轉(zhuǎn)移至第三液體培養(yǎng)基中，所述的培養(yǎng)基包括(a)任何傳統(tǒng)培養(yǎng)基使用的鹽，(b)任何傳統(tǒng)培養(yǎng)基使用的維生素，(c)肌醇，以及(d)碳源pH范圍為5.2-6.0，用高壓鍋滅菌培養(yǎng)基，將培養(yǎng)物于23-33℃、20-40μmol/m2/s強度的光照、16h光周期下培育12-32天，足以形成胚發(fā)生團(tuán)塊。
(vii)通過不同網(wǎng)孔大小的金屬篩篩濾細(xì)胞懸浮液，選擇篩目尺寸40上收集的細(xì)胞/團(tuán)塊，然后進(jìn)一步將選擇的團(tuán)塊傳代培養(yǎng)于如步驟(vi)中的液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基中。
(viii)將胚發(fā)生的細(xì)胞/團(tuán)塊短時間(8-12天)傳代培養(yǎng)于步驟(vi)的但不含有肌醇的液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，即第四培養(yǎng)基中。
(ix)進(jìn)一步將胚發(fā)生的細(xì)胞/團(tuán)塊以8-12天的規(guī)則間隔傳代培養(yǎng)于步驟(vi)的液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基中。
(x)將步驟(viii)和(ix)中的培養(yǎng)物以與步驟(vi)中的溫度、光照、光周期相同的條件培育。
(xi)在旋轉(zhuǎn)搖床上以110-130rpm搖動步驟(vi)、(viii)和(ix)的培養(yǎng)物。
(xii)將雙極的成熟體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)移至第五胚萌發(fā)培養(yǎng)基上，該培養(yǎng)基包括(a)任何傳統(tǒng)培養(yǎng)基使用的鹽，(b)任何傳統(tǒng)培養(yǎng)基使用的維生素，(c)減少至四分之一正常濃度的肌醇，以及(d)碳源pH范圍為5.2-6.0，用高壓鍋滅菌培養(yǎng)基，將培養(yǎng)物培育于23-33℃、至少60μmol/m2/s強度的光照、16h光周期的條件，直到長出幼苗。
本發(fā)明中，術(shù)語外植體指子葉片或下胚軸或中胚軸段。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，所述的第一至第五培養(yǎng)基包括MS培養(yǎng)基的鹽、Gamborg B5培養(yǎng)基的維生素以及碳源。
第一和第五培養(yǎng)基包括MS培養(yǎng)基的鹽和Gamborg B5培養(yǎng)基的維生素的標(biāo)準(zhǔn)濃度的一半，而第二、三、四培養(yǎng)基包括這些成分標(biāo)準(zhǔn)濃度。MS培養(yǎng)基的最優(yōu)選的鹽及其標(biāo)準(zhǔn)濃度包括下述的表2中顯示的成分表2Murashige和Skoog(1962)培養(yǎng)基的鹽-成分濃度(mg/L)NH4NO31650KNO31900CaCl2.2H2O 440
MgSO4.7H2O370KH2PO4170KI 0.83H3BO36.2MnSO4.4H2O22.3ZnSO4.7H2O8.6Na2MoO4.2H2O 0.25CuSO4.5H2O0.025CoCl2.6H2O0.025Na2.EDTA 37.3FeSO4.7H2O27.8Gamborg B5培養(yǎng)基的優(yōu)選維生素包括表3中所示的下述成分表3成分 濃度(mg/L)煙酸 1.0鹽酸吡哆醇1.0鹽酸硫胺 10第一培養(yǎng)基中的優(yōu)選碳源選自蔗糖和葡萄糖，這種碳源使用濃度范圍為1-3％wt./vol.。
第二、三、四培養(yǎng)基中的優(yōu)選碳源基本為葡萄糖，這種碳源使用濃度范圍為1.5-45.％wt./vol.。
第五培養(yǎng)基中的優(yōu)選碳源基本為蔗糖，這種碳源使用濃度范圍為1-3％wt./vol.。第二培養(yǎng)基中的優(yōu)選膠凝劑選自瓊脂(使用濃度范圍為0.6-0.8％wt./vol.)和phytagel(使用濃度范圍為0.15-0.29％wt./vol.)。第一、二、三和五培養(yǎng)基中的優(yōu)選有機物基本為肌醇，在第一至三培養(yǎng)基中以100mg/L使用，在第五中以25mg/L使用。
在第二培養(yǎng)基中使用的植物生長調(diào)節(jié)劑選自作為植物生長素的2，4D和作為細(xì)胞分裂素的BA。
在另一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的方法包括(i)通過常規(guī)方法滅菌棉花植物種子，以去除污染物，如細(xì)菌/真菌；(ii)將滅菌的種子培養(yǎng)于表4中所示的培養(yǎng)基中，以便發(fā)芽；(iii)從步驟(ii)中獲得的籽苗切下外植體；(iv)將步驟(iii)中獲得的外植體培養(yǎng)于表5中所示的培養(yǎng)基中，pH范圍為5.4-6.2，用高壓鍋滅菌培養(yǎng)基；(v)將外植體于23-33℃的溫度、至少90μmol/m2/s強度的光照中以16h光周期培養(yǎng)3-5周時間，直到形成足夠的愈傷組織；(vi)將愈傷組織轉(zhuǎn)移至表6中所示的具有下述組合物的胚發(fā)生誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，pH范圍為5.2-6.0，用高壓鍋滅菌培養(yǎng)基；(vii)在23-33℃、20-40μmol/m2/s強度的光照、16h光周期下培養(yǎng)2-5周時間直到形成胚發(fā)生的團(tuán)塊；(viii)篩選胚發(fā)生的團(tuán)塊并轉(zhuǎn)移至不含肌醇的具有表7中所示的組合物的培養(yǎng)基中，pH范圍為5.2-6.0，用高壓鍋滅菌培養(yǎng)基，并于23-33℃的溫度在20-40μmol/m2/s強度的光照中以16h光周期短時間培養(yǎng)8-12天；(ix)將滲透壓休克的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至步驟(vi)的液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，繼續(xù)在此培養(yǎng)基上培養(yǎng)，體細(xì)胞胚在此同步化；(x)將成熟的雙極體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)移至表8中所示的胚萌發(fā)培養(yǎng)基中，pH范圍為5.2-6.0，用高壓鍋滅菌培養(yǎng)基；(xi)包含于23-33℃、至少60μmol/m2/s強度的光照、16h光周期下培養(yǎng)，直到幼苗足以發(fā)育，使取出后能適應(yīng)環(huán)境；(xii)使再生的植株適應(yīng)盆栽混合物環(huán)境，該盆栽混合物包括2∶1∶1∶1的比例的栽培土壤∶沙子∶蛭石∶pectmoss；表4種子萌發(fā)培養(yǎng)基-a.較多的鹽成分 濃度(mg/L)NH4NO3825KNO3950
CaCl2.2H2O220MgSO4.7H2O185KH2PO485b.較少的鹽成分濃度(mg/L)KI 0.425H3BO33.6MnSO4.4H2O11.15ZnSO4.7H2O4.3Na2MoO4.2H2O 0.125CuSO4.5H2O0.0125CoCl2.6H2O0.0125Na2.EDTA 18.65FeSO4.7H2O13.9c.有機物肌醇 100d.維生素成分 濃度(mg/L)煙酸 0.5鹽酸吡哆醇0.5鹽酸硫胺 5e.碳源蔗糖或葡萄糖 20g/lpH范圍為5.2-6.0，用高壓鍋滅菌培養(yǎng)基表5愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基a.較多的鹽成分 濃度(mg/L)NH4NO31650
KNO31900CaCl2.2H2O 440MgSO4.7H2O 370KH2PO4170b較少的鹽成分濃度(mg/L)KI 0.83H3BO36.2MnSO4.4H2O 22.3ZnSO4.7H2O 8.6Na2MoO4.2H2O 0.25CuSO4.5H2O 0.025CoCl2.6H2O 0.025Na2.EDTA 37.3FeSO4.7H2O 27.8c.有機物肌醇100d.維生素成分濃度(mg/L)煙酸1.0鹽酸吡哆醇 1.0鹽酸硫胺10e.碳源葡萄糖 30g/lf.膠凝劑瓊脂8g/l或Phytagel 2.2g/lg.植物生長調(diào)節(jié)劑植物生長素0.44至4.4μM細(xì)胞分裂素0.22μM至2.2μM
表6胚發(fā)生誘導(dǎo)培養(yǎng)基a.較多的鹽成分 濃度(mg/L)NH4NO31650KNO31900CaCl2.2H2O440MgSO4.7H2O370KH2PO4170b.較少的鹽成分 濃度(mg/L)KI 0.83H3BO36.2MnSO4.4H2O22.3ZnSO4.7H2O8.6Na2MoO4.2H2O 0.25CuSO4.5H2O0.025CoCl2.6H2O0.025Na2.EDTA 37.3FeSO4.7H2O27.8c.有機物肌醇 100d.維生素成分 濃度(mg/L)煙酸 1.0鹽酸吡哆醇1.0鹽酸硫胺 10e.碳源葡萄糖30g/l
表7缺乏肌醇的培養(yǎng)基a.較多的鹽成分濃度(mg/L)NH4NO31650KNO31900CaCl2.2H2O 440MgSO4.7H2O 370KH2PO4170b.較少的鹽成分濃度(mg/L)KI 0.83H3BO36.2MnSO4.4H2O 22.3ZnSO4.7H2O 8.6Na2MoO4.2H2O 0.25CuSO4.5H2O 0.025CoCl2.6H2O 0.025Na2.EDTA 37.3FeSO4.7H2O 27.8c.維生素成分濃度(mg/L)煙酸1.0鹽酸吡多辛 1.0鹽酸硫胺10d.碳源葡萄糖 30g/l表8胚萌發(fā)培養(yǎng)基
a.較多的鹽成分濃度(mg/L)NH4NO3825KNO3950CaCl2.2H2O 220MgSO4.7H2O 185KH2PO485b.較少的鹽成分濃度(mg/L)KI 0.425H3BO33.6MnSO4.4H2O 11.15ZnSO4.7H2O 0.43Na2MoO4.2H2O 0.125CuSO4.5H2O 0.0125CoCl2.6H2O 0.0125Na2.EDTA 18.65FeSO4.7H2O 13.9c.有機物肌醇25d.維生素成分濃度(mg/L)煙酸0.5鹽酸吡哆醇 0.5鹽酸硫胺5e.碳源蔗糖20g/l根據(jù)本發(fā)明的實施方案，基礎(chǔ)的胚發(fā)生團(tuán)塊能經(jīng)受進(jìn)一步的多輪肌醇饑餓和隨后的同步化胚發(fā)生及植株再生。
發(fā)明詳述在本發(fā)明的方法中，體外培養(yǎng)前將種子表面滅菌以使其不帶有細(xì)菌/真菌污染物。表面滅菌包括以包含任何一種消毒劑，如次氯酸鈉、次氯酸鈣、氯化汞、乙醇、溴化十六烷基三甲銨等的溶液處理種子。種子的表面滅菌可通過下述方法完成，即連續(xù)攪拌下以0.05-0.5％w/v氯化汞水溶液處理種子3-11分鐘，然后以滅菌蒸餾水充分洗滌(4-8次)，再將種子浸入精餾酒精(50-100％v/v)中10-20sec，然后在酒精燈火焰中灼燒5-10sec。
表面滅菌的種子可置于濾紙船上發(fā)芽，濾紙船以種子萌發(fā)培養(yǎng)基浸潤，該培養(yǎng)基包含濃度稀釋至一半的Murashige和Skoog鹽、濃度稀釋至一半的Gamborg B5培養(yǎng)基、100mg/L肌醇以及任何碳源，如葡萄糖或蔗糖1-3％wt./vol.，再將培養(yǎng)基的pH至5.2-6.0，并用高壓鍋于121℃，16psi滅菌16min而使其無菌。
為了發(fā)芽，可將種子于23-33℃下光照(以30-60μmol/m2/s的強度)或黑暗中培育，直到種子發(fā)芽并形成成熟的籽苗。
優(yōu)選地，于無菌環(huán)境，即本領(lǐng)域已知的層流中，以鋒利的消毒解剖刀和刀片切下發(fā)芽后6-12d大的籽苗而獲得外植體(子葉片、下胚軸段或中胚軸段)。
將切下的外植體置于培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基包含表2所示濃度的Murashige和Skoog鹽、表3所示濃度的Gamborg B5維生素、100mg/L肌醇、優(yōu)選為1.5-4.5％wt./vol.葡萄糖的碳源、優(yōu)選為0.6-0.8％wt./vol。瓊脂或0.15-0.29％wt./vol.phytagel的凝膠劑以及植物生長調(diào)節(jié)劑0.44-4.44μM的2，4D和0.22-2.22μM的BA。將培養(yǎng)基pH調(diào)節(jié)至5.4-6.2，然后于121℃、16psi滅菌16min。將用于誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基成分列于表5中。將培養(yǎng)物于23-33℃、至少90μmol/m2/s的白色熒光中以16h光周期培育3-5周時間。此時，從外植體切割邊緣形成足夠的愈傷組織。愈傷組織外表可為淺黃色至褐色，脆性質(zhì)地。
可將從外植體的切割邊緣長出的愈傷組織以600-1000mg愈傷組織/50ml培養(yǎng)基的填充密度轉(zhuǎn)移至250ml瓶的液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基成分如表6所示。培養(yǎng)基不包括任何生長調(diào)節(jié)劑或膠凝劑，將其pH調(diào)節(jié)至5.2-6.0，然后于121℃、16psi滅菌16min?？蓪⒂鷤M織的細(xì)胞于該培養(yǎng)基中在旋轉(zhuǎn)搖床上以110-130轉(zhuǎn)/分鐘搖動，搖床設(shè)置為23-33℃、20-40μmol/m2/s光強度、16hrs光周期?？蓪⒓?xì)胞于該培養(yǎng)基和該培育條件中培養(yǎng)12-32天時間，直到在細(xì)胞懸浮培養(yǎng)中形成胚發(fā)生的團(tuán)塊。
可篩選搖動的液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基中發(fā)育的細(xì)胞懸浮液以選擇培養(yǎng)物中的胚發(fā)生細(xì)胞團(tuán)快/群體?？纱┻^10、40和100篩目尺寸的金屬篩的組合進(jìn)行選擇。篩目尺寸10的金屬篩收集較大的組織塊，100目的金屬篩收集小的細(xì)胞懸浮物。在篩目尺寸40的金屬篩上收集可轉(zhuǎn)變?yōu)榕甙l(fā)生的含有較小團(tuán)塊的細(xì)胞部分。將選擇的細(xì)胞部分轉(zhuǎn)移至新鮮的液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，間隔8-12天規(guī)則地傳代培養(yǎng)，或可將其轉(zhuǎn)移至缺乏肌醇的培養(yǎng)基中8-12天時間，該培養(yǎng)基為液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基減去肌醇，成分列于表7中，然后將肌醇放回新鮮液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基，再以8-12天的間隔規(guī)則地傳代培養(yǎng)。在這兩種情況中，體細(xì)胞胚都能發(fā)育但具有不同的發(fā)育命運。在前者中，在每個8-12天的周期中可以獲得相似頻率的各個發(fā)育期的胚，在后者中，胚發(fā)育得以同步化，幾乎所有的胚都保持在同一發(fā)育時期。本發(fā)明策略是選擇第二種方法培養(yǎng)胚發(fā)生的團(tuán)塊。
此外，將成熟的雙極魚雷期胚取出懸浮液用于發(fā)芽后，基部的胚發(fā)生團(tuán)塊用于進(jìn)一步的的循環(huán)，即肌醇缺失、發(fā)育同步化以及隨后收獲成熟胚用于發(fā)芽。
可將胚發(fā)生的團(tuán)塊和同步化的胚培養(yǎng)于110-130次擺動/分鐘的旋轉(zhuǎn)搖床上的搖動培養(yǎng)基中，溫度為23-33℃，光的強度為20-40μmol/m2/s，光周期為16hrs.。
可將成熟的雙極體細(xì)胞胚取出液體培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移至固體支持物上，該支持物優(yōu)選以胚萌發(fā)培養(yǎng)基飽和的蛭石，該培養(yǎng)基成分列于表8中。將培養(yǎng)基pH調(diào)節(jié)至5.2-6.0，然后于121℃、16psi滅菌16min?？蓪⑴囵B(yǎng)物于23-33℃、至少為60μmol/m2/s的光照中以16h的光周期培育?？上虬l(fā)芽胚中加入新鮮的液體培養(yǎng)基，每周一次。將胚生長于胚萌發(fā)培養(yǎng)基中一定時間，使其足以形成具有發(fā)育良好的根的4-5葉期(leaf stage)幼苗。此時，可取出幼苗轉(zhuǎn)移至以2∶1∶1∶1比例的栽培土壤∶沙子∶蛭石∶泥煤苔的盆栽混合物中。使用透明聚乙烯袋覆蓋植物，內(nèi)表面灑水，給予新發(fā)育的幼苗良好的濕潤條件。在這些條件以及23-33℃的溫度、強度至少為90μmol/m2/s的熒光和16h的光周期下將幼苗培養(yǎng)一段時間，使其足以適應(yīng)環(huán)境后，如果需要，可將植物轉(zhuǎn)移至田間。
現(xiàn)在將參考下述非限制性的實施例對本發(fā)明進(jìn)行更具體的描述。
實施例1外植體誘導(dǎo)體細(xì)胞胚發(fā)生的培養(yǎng)基依賴性效應(yīng)將棉籽(Ghirsutum L.Coker 312)以0.1％w/v氯化汞處理7分鐘，以滅菌蒸餾水洗滌6次，然后將種子浸入精餾酒精中10秒，再以火焰熏燒。滅菌的種子置于濾紙船上發(fā)芽，該濾紙船以種子萌發(fā)培養(yǎng)基浸潤，該培養(yǎng)基包含濃度稀釋至一半的Murashige和Skoog鹽、濃度稀釋至一半的Gamborg B5維生素、100mg/L肌醇以及2％w/v蔗糖(高壓鍋滅菌前調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH至5.6)。為了發(fā)芽，將種子于28±2℃、白色熒光(30μmol/m2/s)下以16h的光周期培育。繼續(xù)培養(yǎng)，直到種子發(fā)芽產(chǎn)生胚根和胚芽，具有伸展良好的子葉。
將9天大的籽苗用于提供作為外植體的下胚軸段和子葉片。用鋒利、消毒的解剖刀切下外植體。將外植體置于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基CIM1上，該培養(yǎng)基包含Murashige和Skoog鹽、Gamborg B5維生素、100mg/l肌醇、3％w/v葡萄糖、750mg/l MgCl2和0.22％w/v phytagel，補充了2.2μM2，4-D和0.88μM BA(高壓鍋滅菌調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH至5.8)。
將外植體于該培養(yǎng)基上28±2℃、90μmol/m2/s強度的光照中以16h的光周期培育3-4周。將從外植體的切割邊緣長出的愈傷組織切下，以800mg愈傷組織/50ml培養(yǎng)基的填充密度接種于250ml Ehrlenmeyer瓶的液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基包含Murashige和Skoog鹽、Gamborg B5維生素、100mg/l肌醇、3％w/v葡萄糖，pH5.6。將培養(yǎng)基以高壓鍋于121℃、16psi滅菌16min。將培養(yǎng)物于旋轉(zhuǎn)搖床上以120rpm搖動，溫度為28±2℃、光的強度為30μmol/m2/s、光周期為16h。
用于誘導(dǎo)愈傷組織的外植體還可在培養(yǎng)基CIM2、CIM3和CIM4上培養(yǎng)，這些培養(yǎng)基包含Murashige和Skoog鹽、Gamborg B5維生素、100mg/l肌醇、3％w/v葡萄糖、750mg/l MgCl2和0.22％w/v phytagel，補充了不同的生長調(diào)節(jié)劑組合，如0.45μM 2，4-D加上2.32μM Kin.(CIM2中)；10.7μM NAA加上4.64μM Kin.(CIM3中)；2.68μM NAA加上2.4μM 2iP(CIM4中)。將培養(yǎng)物培育于相同的溫度和光照條件中。將愈傷組織轉(zhuǎn)移至液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基中并以類似的方式培養(yǎng)。
培養(yǎng)物在液體培養(yǎng)基中生長20-22天后，產(chǎn)生的懸浮物過不同篩孔尺寸(10、40和100目，SIGMA化學(xué)公司，St.Louis)的金屬篩進(jìn)行篩選。棄去篩目尺寸10上收集的較大團(tuán)塊和篩目尺寸100上收集的小懸浮物。將篩目尺寸40上收集的較小細(xì)胞/團(tuán)塊傳代培養(yǎng)于新鮮的液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基中并記錄體細(xì)胞胚的存在。在胚發(fā)生團(tuán)塊存在的基礎(chǔ)上，計算誘導(dǎo)體細(xì)胞胚發(fā)生(SE)的頻率，并相應(yīng)地記錄各種培養(yǎng)基組合中的每個外植體獲得的體細(xì)胞胚數(shù)。獲得的結(jié)果總結(jié)于表9中。
表9在選擇的培養(yǎng)基組合物下不同外植體類型的胚發(fā)生效應(yīng)
*顯示胚發(fā)生的愈傷組織誘導(dǎo)的外植體百分比體細(xì)胞胚發(fā)生(SE)誘導(dǎo)和成熟胚形成的臨界差，對于子葉外植體分別為17.69和3.43(n＝5，重復(fù)2次)，對于下胚軸外植體分別為13.14和2.16(n＝6，重復(fù)3次)。
從結(jié)果看來，很明顯，生長調(diào)節(jié)劑組合和濃度方面的變化導(dǎo)致體細(xì)胞胚發(fā)生誘導(dǎo)頻率和每個外植體獲得的成熟體細(xì)胞胚數(shù)方面的不同效應(yīng)。因此，可將該發(fā)現(xiàn)用于開發(fā)棉花植物再生的最佳條件。
實施例2重復(fù)實施例1的方法，除了將種子于黑暗中發(fā)芽和生長9天，直到黑暗中發(fā)育出胚根和胚芽，并具有伸展良好的子葉?；旧汐@得了相同的結(jié)果。
實施例3重復(fù)實施例1的方法，除了種子萌發(fā)培養(yǎng)基包含2％w/v葡萄糖作為碳源。獲得了相同的結(jié)果。
實施例4重復(fù)實施例2的方法，除了種子萌發(fā)培養(yǎng)基包含2％葡萄糖以取代蔗糖。獲得了相似的結(jié)果。
實施例5以棉花變種Coker 310重復(fù)實施例1和2的方法。獲得了相似的結(jié)果。
實施例6在一定程度上重復(fù)實施例1的方法，直到在懸浮物中獲得胚發(fā)生團(tuán)塊，該懸浮物來源于在2，4-D和BA的組合上產(chǎn)生的愈傷組織。將胚發(fā)生團(tuán)塊傳代培養(yǎng)于缺乏肌醇的液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基(BM)中。將傳代培養(yǎng)于包含肌醇的液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的胚發(fā)生團(tuán)塊作為對照。將團(tuán)塊以約800mg細(xì)胞/50ml培養(yǎng)基的填充密度接種，并在旋轉(zhuǎn)搖床上以實施例1中的光照、溫度和光周期條件培育。在缺乏肌醇的培養(yǎng)基中進(jìn)行1-2次的10天傳代培養(yǎng)后，將培養(yǎng)物返回到包含肌醇的基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基中。記錄兩種條件下每單位重量中不同發(fā)育時期胚的頻率和數(shù)量。將獲得的數(shù)據(jù)顯示于表10中。
表10使用肌醇饑餓法的體細(xì)胞胚發(fā)生的同步化
從結(jié)果可明顯看出，在無肌醇缺乏時，獲得了不同步的胚發(fā)生。因此，胚發(fā)生團(tuán)塊在包含肌醇的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的連續(xù)傳代培養(yǎng)產(chǎn)生了幾乎相似頻率的處于各個發(fā)育時期的胚。然而，當(dāng)將胚發(fā)生團(tuán)塊傳代培養(yǎng)于不含肌醇的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中一個10天的單循環(huán)，然后返回到包含肌醇的基礎(chǔ)培養(yǎng)基時，產(chǎn)生了體細(xì)胞胚的同步化發(fā)育(在基礎(chǔ)培養(yǎng)基上的一次傳代培養(yǎng)后，處于球形期的胚占100％；在基礎(chǔ)培養(yǎng)基上的2次傳代培養(yǎng)后，處于心形期的胚占91.66％；以及在3次傳代培養(yǎng)后，處于魚雷期的胚占81.99％)。每個外植體產(chǎn)生的成熟胚的總數(shù)增高4-5倍。當(dāng)傳代培養(yǎng)于不含肌醇的培養(yǎng)基中2個循環(huán)時，胚發(fā)生團(tuán)塊在胚發(fā)育時期的均一性出現(xiàn)減小。因此，需要單循環(huán)的肌醇饑餓誘導(dǎo)高水平的胚發(fā)生同步化。
實施例7
如實施例1，將棉籽(G.hirsutum L.Coker)滅菌和發(fā)芽。將外植體浸入Agrobacterium(土壤桿菌屬)懸浮液中10-15分鐘，擦干，然后接種于共培養(yǎng)培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基包括Murashige和Skoog鹽、Gamborg B5維生素、100mg/l肌醇、3％w/v葡萄糖、750mg/l MgCl2和0.22％w/v phytagel，補充了2.2μM 2，4-D和0.88μM BA(高壓鍋滅菌將培養(yǎng)基的pH調(diào)節(jié)至5.8)。將培養(yǎng)物于28±2℃、90μmol/m2/s的光照中以16h的光周期培育3天。3天后，將外植體以無菌水洗滌，再次擦干，然后接種于培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基具有類似于共培養(yǎng)培養(yǎng)基的成分，除了補充了250mg/l沃格孟汀(augmentin)和50mg/l卡那霉素。按照實施例1和實施例6進(jìn)一步培養(yǎng)外植體。在體細(xì)胞胚發(fā)生和轉(zhuǎn)化植物的再生方面獲得了相似的結(jié)果。
用于本試驗的Agrobacterium株是一種普通的試驗株LBA 4404，荷載二元載體pIG衍生物，其具有作為選擇標(biāo)記物的nptII和作為報告基因的具有內(nèi)含子的gusA。
從轉(zhuǎn)化的外植體獲得的再生來看，很明顯，當(dāng)所有回收胚為GUS+ve并在組化試驗后顯示均一藍(lán)色時，在選擇試劑(在此試驗中為卡那霉素)存在下培養(yǎng)液體培養(yǎng)基中的推定轉(zhuǎn)化細(xì)胞更不易產(chǎn)生假陽性選擇體(selectant)。此外，以轉(zhuǎn)化的外植體獲得體細(xì)胞胚發(fā)生誘導(dǎo)頻率和每個外植體的成熟體細(xì)胞胚數(shù)，用與不用Agrobacterium tumefaciens(根瘤土壤桿菌)處理的結(jié)果相似。
實施例8重復(fù)實施例7的方法，除了將外植體在黑暗中共培養(yǎng)?；旧汐@得了相似的結(jié)果。
權(quán)利要求
1.一種通過體細(xì)胞胚發(fā)生、采用短期肌醇饑餓后基本同步化胚發(fā)育而再生棉花的方法，所述的方法包括下述步驟(i)從萌發(fā)的棉花籽苗上切下外植體，該外植體選自子葉、下胚軸、中胚軸及其混合物；(ii)為了誘導(dǎo)愈傷組織，將所述外植體培養(yǎng)于第一固體培養(yǎng)基中，包含作為碳源的葡萄糖，補充了Gamborg B5維生素、2，4-D和BA以及肌醇的培養(yǎng)用培養(yǎng)基中，溫度為23-33℃，光強度為至少90μmol/m2/s，光周期為16h，時間為3-5周，以使從所述外植體形成去分化的愈傷組織；(iii)將愈傷組織從第一固體愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基的液體培養(yǎng)基中，該基礎(chǔ)培養(yǎng)基包含作為碳源的葡萄糖，并補充了Gamborg B5維生素，然后將其產(chǎn)生的懸浮物在23-33℃、20-40μmol/m2/s降低的光強度、光周期為16h條件下培養(yǎng)足以形成胚發(fā)生團(tuán)塊的一段時間；(iv)通過不同篩孔尺寸的金屬篩篩選所述細(xì)胞懸浮物，以選擇胚發(fā)生細(xì)胞和/或團(tuán)塊，并將包含體細(xì)胞胚的所述胚發(fā)生愈傷組織傳代培養(yǎng)于所述的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中；(v)將所述胚發(fā)生塊/團(tuán)塊傳代培養(yǎng)于所述的缺乏肌醇的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中一段足夠的時間以讓其經(jīng)受肌醇缺乏，然后將該培養(yǎng)物返回到包含肌醇的培養(yǎng)基中，以使所述體細(xì)胞胚在發(fā)育上同步化；(vi)將雙極的體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)移至支持物上的胚萌發(fā)培養(yǎng)基，然后讓所述胚于胚萌發(fā)培養(yǎng)基中生長發(fā)育至足夠能轉(zhuǎn)移至土壤的幼苗期；(vii)進(jìn)一步將所述幼苗轉(zhuǎn)移至盆栽混合物中以適應(yīng)環(huán)境，然后再轉(zhuǎn)移至田間。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的外植體來源于棉花或任何其它植物籽苗。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的外植體來源于棉花栽培品種Coker 312，并且所述的籽苗以下述方法發(fā)育(i)將棉花種子于0.1％HgCl2的滅菌液中滅菌5-10min，優(yōu)選7min，(ii)以滅菌水洗滌種子4-6次，(iii)將所述種子于酒精燈火焰中熏燒5-10秒，(iv)將所述種子接種于種子萌發(fā)培養(yǎng)基上，(v)讓所述種子于種子培養(yǎng)基中在光照或黑暗中于23-33℃生長6-12天時間，優(yōu)選9-10天，(vi)從所述籽苗切下所述外植體。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中種子萌發(fā)培養(yǎng)基為液體培養(yǎng)基，包括一半濃度的Murashige和Skoog鹽和Gamborg B5維生素。
5.如權(quán)利要求3所述的方法，其中種子萌發(fā)培養(yǎng)基中的碳源選自1-3％wt./vol.范圍內(nèi)的蔗糖和葡萄糖。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的第一固體愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基包括Murashige和Skoog培養(yǎng)基的下列成分成分 濃度(mg/L)a.Murashige和Skoog(1962)培養(yǎng)基的鹽NH4NO31650KNO31900CaCl2.2H2O 440MgSO4.7H2O 370KH2PO4170KI 0.83H3BO36.2MnSO4.4H2O 22.3ZnSO4.7H2O 8.6Na2MoO4.2H2O 0.25CuSO4.5H2O 0.025CoCl2.6H2O 0.025Na2.EDTA37.3FeSO4.7H2O 27.8b.有機物肌醇 100。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中Gamborg B5維生素，無論在什么情況下都包括成分濃度(mg/L)煙酸1.0鹽酸吡哆醇 1.0鹽酸硫胺10。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其中第一固體愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中作為外源提供的植物生長素的2，4-D選自0.44至4.4μM的范圍，優(yōu)選1.76至2.64μM。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其中第一固體愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中作為外源提供的細(xì)胞分裂素的BA選自0.22μM至2.2μM的范圍，優(yōu)選0.66μM至1.00μM。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的第一固體愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的膠凝劑選自0.6-0.8％wt./vol.范圍、優(yōu)選0.7％的瓊脂以及0.15-0.29％wt./vol.范圍、優(yōu)選0.22％wt./vol.的phytagel。
11.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的第一固體愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基包含作為首要碳源的葡萄糖。
12.如權(quán)利要求1所述的方法，其中將所述的外植體培養(yǎng)于所述的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，溫度為23-33℃，優(yōu)選27-29℃，光強度為至少90μmol/m2/s，光周期為16h，時間不超過3-5周，以使去分化的愈傷組織能從任何所述的外植體形成。
13.如權(quán)利要求1所述的方法，實質(zhì)上包括下述步驟，即將愈傷組織從所述的第一固體愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至Ehrlenmeyer瓶中的液體培養(yǎng)基，填充密度為600至1000mg愈傷組織/50ml培養(yǎng)基，優(yōu)選800mg/50ml，然后于旋轉(zhuǎn)搖床上以110-130rpm搖動此步驟和隨后所有步驟中的培養(yǎng)物，直到將體細(xì)胞胚取出用于發(fā)芽。
14.如權(quán)利要求1和13所述的方法，其中所述的胚發(fā)生誘導(dǎo)培養(yǎng)基為基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基，包括M&S鹽、Gamborg B5維生素、肌醇和作為碳源的葡萄糖。
15.如權(quán)利要求1和13所述的方法，其中將液體培養(yǎng)基中的植物細(xì)胞懸浮物胚發(fā)生團(tuán)塊及其產(chǎn)生的體細(xì)胞胚在23至33℃的溫度，優(yōu)選27-29℃、光強度為20-40μmol/m2/s，典型地為27-33μmol/m2/s、光周期為16h的條件下培育。
16.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的胚發(fā)生塊/團(tuán)塊于肌醇缺乏的培養(yǎng)基中經(jīng)受肌醇缺乏8-12天時間，優(yōu)選為10天，所述肌醇缺乏培養(yǎng)基包括MS基本的鹽、Gamborg B5維生素、作為碳源的葡萄糖，但沒有肌醇，導(dǎo)致體細(xì)胞胚的發(fā)育同步化。
17.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的第一固體愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的pH范圍為5.4-6.2，所述方法中的全部液體培養(yǎng)基的pH范圍為5.2-5.8，并于121℃，16psi高壓滅菌16分鐘而無菌。
18.如權(quán)利要求1所述的方法，其中盆栽混合物包括2∶1∶1∶1比例的栽培土壤∶沙子∶泥煤苔∶蛭石。
19.如權(quán)利要求1所述的方法，其中將體細(xì)胞胚發(fā)生的發(fā)育同步化用于優(yōu)良棉花栽培品種的繁殖或轉(zhuǎn)基因棉花栽培品種的發(fā)育。
20.如權(quán)利要求1所述的方法，其中將所述的肌醇缺乏用于除棉花以外的植物品種，以增強組織培養(yǎng)中的胚發(fā)生。
21.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的培養(yǎng)用培養(yǎng)基和基礎(chǔ)培養(yǎng)基包括Murashige和Skoog培養(yǎng)基。
22.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的足以形成胚發(fā)生團(tuán)塊的時間為12-32天。
23.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的包含體細(xì)胞胚的胚發(fā)生愈傷組織傳代培養(yǎng)于所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基以8-12天的間隔進(jìn)行。
24.如前述任一項權(quán)利要求所述的方法，其中將所述的胚發(fā)生塊/團(tuán)塊經(jīng)受肌醇缺乏8-12天時間，優(yōu)選為10天。
25.如權(quán)利要求1所述的方法，其中用于所述的胚萌發(fā)培養(yǎng)基的所述支持物包括蛭石。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種通過發(fā)育同步化的體細(xì)胞胚發(fā)生在棉花中再生植株的方法。本發(fā)明簡單、快速、重現(xiàn)性好并且便于應(yīng)用于植物遺傳工程中，通過肌醇饑餓步驟實現(xiàn)了同步化的體細(xì)胞胚發(fā)生。
文檔編號A01H4/00GK1886041SQ200380110957
公開日2006年12月27日 申請日期2003年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月31日
發(fā)明者拉克什·圖麗, 米西勒什·庫馬爾 申請人:科學(xué)與工業(yè)研究委員會