專利名稱：安祖花無菌苗組織培養(yǎng)和試管苗煉苗移栽技術(shù)的制作方法
1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及名稱為安祖花植物的無菌苗組織培養(yǎng)技術(shù)和試管苗煉苗移栽技術(shù)。在培養(yǎng)中選用無菌外植體，在兩種不同優(yōu)勢的培養(yǎng)基上交替培養(yǎng)，同步產(chǎn)生愈傷組織、側(cè)芽、不定根，在最短時間內(nèi)形成完整植株；然后選用2-3cm高的完整植株用藥劑浸泡處理移栽，提高成活率。本發(fā)明為安祖花工廠化育苗創(chuàng)造良好的條件，而且本發(fā)明還有利于其它植物進(jìn)行工廠化育種的組織培養(yǎng)工作者。
2.背景技術(shù)2.1安祖花組織培養(yǎng)技術(shù)安祖花(Anthurium andreamum)原產(chǎn)于美洲的熱帶地區(qū)，是天南星科安祖花屬多年生草本花卉，花朵鮮艷奪目，花形獨(dú)特，又名紅掌、火鶴花、燈臺花、花燭、蠟燭花。因其花形獨(dú)特、花色艷麗、并具有蠟質(zhì)光澤、非常優(yōu)美可愛，而成為倍受人們歡迎的高檔花卉；且盆花可周年開花、切花瓶插壽命長，在國際市場上是十分暢銷的一種切花材料和盆栽品種。近五年來紅掌成為躋身于國際花卉市場的“新星”。
安祖花通常以分株和扦插方式繁殖，目前采用組織培養(yǎng)技術(shù)育苗越來越多，但是大部分選用的外植體為莖尖、葉片、葉柄莖尖分化率高，生長快，由于分枝少，適宜取材的部位甚少，難以滿足外植體的需求；葉片、葉柄誘導(dǎo)愈傷組織、分化芽時間較長。自1974年P(guān)ierk首次培養(yǎng)安祖花取得成功以來，國內(nèi)外對安祖花愈傷組織誘導(dǎo)的研究報(bào)道，大多是依照外植體一愈傷組織一愈傷組織增殖一芽一生根一完整植株這一技術(shù)路線；從外植體誘導(dǎo)愈傷組織到形成完整植株，需130-180天；而且以上技術(shù)都是采用器官發(fā)生型這條途徑，愈傷組織繼代時間過長，抵抗力差，易染病，移栽不易成活。
本發(fā)明的目的是針對上述問題，提供一種在最短的時間獲得大量試管苗的快速繁殖技術(shù)，該技術(shù)具有穩(wěn)定性好、操作簡便、繁殖速率更快的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明的方法是依照外植體一愈傷組織、芽、不定根一完整植株這一技術(shù)路線，從外植體誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷、芽、不定根的完整植株只需50-62天左右。
本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)實(shí)現(xiàn)A、外植體的選擇選用安祖花幼嫩器官經(jīng)組織培養(yǎng)獲得的2～3cm高且生長健壯、長勢均勻、品質(zhì)良好的無菌苗為材料，切取帶1～2個節(jié)的莖段為外植體進(jìn)行培養(yǎng)。
B、外植體的接種將帶1～2個節(jié)的莖段，接種在I.1/2MS+6-BA0.5～1.0mg/L+NAA0.05mg/L+3％葡萄糖+0.75％瓊脂，II.1/2MS+6-BA1.5～2.0mg/L+NAA0.05mg/L+3％葡萄糖+0.75％瓊脂，III.1/2MS+6-BA1.0～1.5mg/L+NAA0.05mg/L+IAA0.05mg/L+3％葡萄糖+0.75％瓊脂，每瓶培養(yǎng)基接種10～12個莖段。
C、培養(yǎng)條件接種后移到培養(yǎng)室培養(yǎng)，培養(yǎng)室溫度為22～28℃，培養(yǎng)室相對濕度為30～40％，每天光照10～12小時，光照強(qiáng)度為1000～2000lx；培養(yǎng)25～32天左右三種不同培養(yǎng)基上的外植體基部產(chǎn)生愈傷組織，葉腋萌發(fā)1～2個側(cè)芽；再培養(yǎng)25～30天，長至2～3cm高的芽，側(cè)芽基部產(chǎn)生2～5條不定根，形成完整植株。
D、組培苗繼代將帶愈傷和芽的外植體，用II號和III號培養(yǎng)基不斷進(jìn)行交替培養(yǎng)，分化更多健壯的芽苗，同時誘導(dǎo)粗壯不定根進(jìn)行移栽。
本發(fā)明具有如下的優(yōu)點(diǎn)和效果1、利用無菌苗為外植體，穩(wěn)定性好、操作簡便，取材容易，不需經(jīng)過體外消毒，恢復(fù)期短；至今有一篇報(bào)道采用無菌葉、葉柄及莖段為外植體，但45天后才長出愈傷，再轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基培養(yǎng)30天后才能分化出小芽點(diǎn)(黃珺梅等，福建熱帶科技，2002，27(1)12～13)。本發(fā)明25-32天左右同步誘導(dǎo)出愈傷組織和側(cè)芽。
2、按上述培養(yǎng)條件培養(yǎng)，繼續(xù)培養(yǎng)25～30天，芽2～3cm高時，基部產(chǎn)生2～5條不定根，從出愈到完整植株形成，僅需50～62天。比目前報(bào)道最短時間提早了30～60天形成完整植株(見蘭芹英等，園藝學(xué)報(bào)，2003，30(1)107～109)。
3、利用兩種培養(yǎng)基各自的優(yōu)勢交替培養(yǎng)，獲得安祖花組織培養(yǎng)的最佳效果，在目前未見報(bào)道。
4、外植體在I、II、III號培養(yǎng)基上均能同步產(chǎn)生愈傷、側(cè)芽、不定根，且各有優(yōu)勢；目前還未見報(bào)道可同步誘導(dǎo)愈傷、側(cè)芽、不定根的培養(yǎng)基。
5、利用外植體——愈傷組織、芽、不定根——完整植株這一技術(shù)路線，僅需50～62天形成完整植株，4～5個月內(nèi)可獲得大量完整植株，進(jìn)行大規(guī)模工廠化育種。
下面結(jié)合實(shí)施例描述本發(fā)明的最佳實(shí)施方案1、選用組織培養(yǎng)獲得的2～3cm高且生長健壯、長勢均勻、品質(zhì)優(yōu)良的無菌苗，先切除葉片和葉柄，然后切成帶1～2節(jié)的莖段，接種在I、II、III號培養(yǎng)基上，每瓶10～12個外植體。
2、接種后移到培養(yǎng)室培養(yǎng)，培養(yǎng)室溫度為22～28℃，培養(yǎng)室相對濕度為30～40％，每天光照12小時，光照強(qiáng)度為1000～2000lx；3、培養(yǎng)30天左右，平均出愈率達(dá)93％，大部分葉腋萌發(fā)1-2個側(cè)芽(見表1)。
表1不同培養(yǎng)基對安祖花無菌苗愈傷組織形成及芽分化的影響基本培養(yǎng)基 激素(mg/L)接種外植 產(chǎn)生愈傷組 產(chǎn)生愈傷的外 愈傷組織 葉腋長出 側(cè)芽萌發(fā)體數(shù)(塊) 織的天數(shù) 植體數(shù)(塊) 誘導(dǎo)率的側(cè)芽數(shù) 率(％)(天)(％)
I、1/2MS 6BA1.0+NAA0.05 100298484％ 152 89％II、1/2MS6BA2.0+NAA0.05 10025100 100％ 135 85％III、1/2MS 6BA1.0+NAA0.05 100329595％ 194 100％+IAA0.05+100g/LCM(注表中數(shù)據(jù)為培養(yǎng)35天統(tǒng)計(jì)的結(jié)果。)4、上述培養(yǎng)的外植體，繼續(xù)接種在三種培養(yǎng)基上培養(yǎng)，再培養(yǎng)25～30天，當(dāng)長至2～3cm高的芽時，基部長出2～5條不定根，形成完整植株(見表2)。
表2不同培養(yǎng)基增殖對安祖花各器官繁殖的影響培養(yǎng)基 愈傷組織狀況芽苗分化情況 成苗數(shù)及長勢 根狀況葉片狀況I 球莖不規(guī)則，直徑約1 部分愈傷組織上分化 大部分頂芽和側(cè)芽 氣生根較多， 較小，約0.5cm2，厘米，淡綠色或淡黃 出芽點(diǎn)，3-5個萌發(fā)展葉，每塊愈傷 3-5條，2-3cm 淡綠色。
色，質(zhì)地致密。組織上有成苗2-3 長。
株，高1.5-3cm。
II球莖形狀明顯，直徑 大部分愈傷組織分化 大部分頂芽和側(cè)芽 氣生根少而短，較小，約0.5cm2，約2.5cm，淡綠、淡黃 出芽點(diǎn)，數(shù)目較多 萌發(fā)展葉，每塊愈傷 1-2條，0.5-1.5cm 淡綠色。
或黃色，質(zhì)地致密。
(5-10個)。
組織上有成苗1-2 長。
株，高1-2cm。
III 球莖形狀不明顯，直 大部分愈傷組織分化 大部分頂芽和側(cè)芽 2-4條，1-3cm長。
較大，約1cm2，徑約2cm，淡綠、淡黃 出芽點(diǎn)，數(shù)目較多 萌發(fā)展葉，每塊愈傷 濃綠色，光滑。
或黃色，質(zhì)地光滑致 (5-6個)。組織上有成苗4-5密。
株，高2-3cm，粗壯。
(注表中數(shù)據(jù)為培養(yǎng)62天統(tǒng)計(jì)結(jié)果)5、從表1、表2可以看出I號培養(yǎng)基愈傷組織小而不規(guī)則，分化芽點(diǎn)少，芽苗長勢一般，但氣生根多而長；II號培養(yǎng)基上愈傷組織大而形狀明顯，分化芽點(diǎn)多，但成苗弱而少，氣生根少而短；III號培養(yǎng)基愈傷組織較小，但分化芽點(diǎn)數(shù)比較多，成苗多而壯，氣生根比II號培養(yǎng)基多而長。因此外植體先接種在II號培養(yǎng)基上，然后轉(zhuǎn)入III號培養(yǎng)基，再轉(zhuǎn)入II號培養(yǎng)基進(jìn)行交替培養(yǎng)，分化更多健壯的芽苗、粗壯不定根，即可切取移栽。
2.2安祖花煉苗移栽技術(shù)安祖花喜較高溫度，生長適溫為20～30℃，越夏溫度不高于31℃，越冬溫度不低于10℃，喜溫潤，故每天需向葉面噴霧。然而試管苗在瓶苗階段都是在人工條件下，提供各種最適宜生長條件，完成生長過程的；因此，同外界自然環(huán)境條件差異很大，為了使瓶苗能適應(yīng)外界的自然環(huán)境條件，就必須讓試管苗有一個過渡的適應(yīng)過程，即煉苗。
大部分植物在試管繁殖中能不斷生長、增殖，但不生根而無法移栽；國內(nèi)外安祖花組織培養(yǎng)技術(shù)報(bào)道的方法大多是經(jīng)過25～40天生根再移栽(見黃珺梅等，福建熱帶科技，2002，27(1)12～13；蔡維藩，亞熱帶植物科學(xué)，2002，31(3)66-68等)。
試管苗移栽時，因組織幼嫩，易于滋生雜菌，且安祖花試管苗的根、莖、葉均會發(fā)病，發(fā)病時受害植物首先停止生長，然后受害部位淡褐色，后期莖干布滿白色或粉紅色霉層，最后全株枯萎死亡，降低了移栽成活率。
本發(fā)明的目的是針對以上技術(shù)的不足，發(fā)明一種同步誘芽和根的培養(yǎng)方法，試管苗不必另行壯苗生根便能形成根葉具全的小苗；且在移栽時用不同藥劑浸泡處理，減少病菌來源，預(yù)防病害，加快生長。
本發(fā)明提供一種安祖花試管苗煉苗移栽技術(shù)，主要按以下步驟和方法進(jìn)行A、選用II、III號培養(yǎng)基交替培養(yǎng)所獲得的壯苗，無需轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基，即可形成完整植株；因此在培養(yǎng)過程中隨著不定根的出現(xiàn)，即可出瓶移栽，簡化繁殖程序。
B、移栽預(yù)處理用500～2000倍的高錳酸鉀、多菌靈、代森錳鋅、甲基托布津、家用鏈霉素等藥劑浸泡5～25分鐘。
C、栽培基質(zhì)移栽時選用椰糠∶泥炭土∶珍珠巖＝2∶2∶1為基質(zhì)；移栽前用同濃度浸泡藥劑淋透放置2～3天，然后再移栽。
D、移栽后管理移栽后，轉(zhuǎn)入煉苗室，用薄膜密封進(jìn)行煉苗，溫度控制在22～28℃，濕度60～80％，2～7天向膜內(nèi)噴水一次，20～40天后慢慢打開薄膜；移栽后10天，開始用MS母液噴霧(每周一次)，當(dāng)新葉長出時，轉(zhuǎn)入到溫室培養(yǎng)。
本發(fā)明具有如下的優(yōu)點(diǎn)和效果1、采用培養(yǎng)基交替培養(yǎng)同步誘芽和根，不必另行壯苗生根便能形成根葉具全的小苗，長至2～3cm高的時，可切取移栽；愈傷組織和弱苗可繼續(xù)轉(zhuǎn)入培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，此方法簡化繁殖程序。
2、移栽時，幼苗和栽培基質(zhì)都用藥劑進(jìn)行消毒處理，減少病菌來源、增強(qiáng)抵抗力，故而提高成活率、加快生長速度。
3、選用疏松透氣、肥沃，富含有機(jī)質(zhì)，無病蟲害的天然栽培基質(zhì)，移栽前用同濃度浸泡藥劑淋透放置2～3天，保證移栽時基質(zhì)濕度60％左右。
4、在室內(nèi)煉苗，縮小環(huán)境條件變化，實(shí)現(xiàn)高成活、低成本的移栽方式。
下面結(jié)合實(shí)施例描述本發(fā)明的最佳實(shí)施方案1、把長至2～3cm高的小苗切割下來，然后將苗放入清水中把根部的瓊脂清洗干凈，洗苗時注意水溫，冬季宜用溫水，以免水溫過低凍傷幼苗。
2、試管苗洗凈后用500～2000倍的高錳酸鉀、多菌靈、代森錳鋅、甲基托布津、家用鏈霉素等藥劑浸泡5～25分鐘處理。
3、以椰糠∶泥炭土∶珍珠巖＝2∶2∶1的比例配制基質(zhì)，保證基質(zhì)通氣的孔隙度和保水能力以1∶1為佳；移栽前用同濃度浸泡藥劑淋透放置2～3天，保證移栽時基質(zhì)濕度60％左右。
4、移栽時，不能直接把帶根的小苗直接插入基質(zhì)中，因幼苗根部較脆容易折斷，造成傷口感染。先用小木棍或鑷子將穴盤的基質(zhì)挖個小洞，輕輕的把苗放入，再覆蓋基質(zhì)將根部蓋??；不要用力擠壓基質(zhì)，以免基質(zhì)過實(shí)，根系通氣不良而引起根部的腐爛。
5、移栽后，在煉苗室內(nèi)，用薄膜密封煉苗，溫度控制在22～28℃，濕度60～80％；2～7天向膜內(nèi)噴水一次，20～40天后慢慢打開薄膜；移栽10天后，開始用MS母液噴霧(每周一次)，當(dāng)新葉長出時，轉(zhuǎn)入到溫室進(jìn)行培養(yǎng)。
采用以上方法移栽，植株生長健壯，生長速度快，染病率低，移栽成活率達(dá)95％以上。
權(quán)利要求
1.一種安祖花植株組織培養(yǎng)技術(shù)，其特征在于安祖花無菌苗組織培養(yǎng)技術(shù)是按以下步驟和方法進(jìn)行A、外植體的選擇選用安祖花幼嫩器官經(jīng)組織培養(yǎng)獲得的2～3cm高且生長健壯、長勢均勻、品質(zhì)良好的無菌苗為材料，切取帶1～2個節(jié)的莖段為外植體進(jìn)行培養(yǎng)。B、外植體的接種將帶1～2個節(jié)的莖段，接種在I.1/2MS+6-BA0.5～1.0mg/L+NAA0.05mg/L+3％葡萄糖+0.75％瓊脂，II.1/2MS+6-BA1.5～2.0mg/L+NAA0.05mg/L+3％葡萄糖+0.75％瓊脂，III.1/2MS+6-BA1.0～1.5mg/L+NAA0.05mg/L+IAA0.05mg/L+3％葡萄糖+0.75％瓊脂，每瓶培養(yǎng)基接種10～12個莖段。C、培養(yǎng)條件接種后移到培養(yǎng)室培養(yǎng)，培養(yǎng)室溫度為22～28℃，培養(yǎng)室相對濕度為30～40％，每天光照10～12小時，光照強(qiáng)度為1000～2000lx；培養(yǎng)25～32天左右，三種不同培養(yǎng)基上的外植體基部產(chǎn)生愈傷組織，葉腋萌發(fā)1～2個側(cè)芽；繼續(xù)培養(yǎng)25～30天，長至2～3cm高的芽，側(cè)芽基部產(chǎn)生2～5條不定根，形成完整植株。D、組培苗繼代將帶愈傷和小芽的外植體，用II號和III號培養(yǎng)基不斷進(jìn)行交替培養(yǎng)，分化更多健壯的芽苗，同時誘導(dǎo)粗壯不定根進(jìn)行移栽。
2.一種安祖花組織培養(yǎng)技術(shù)，其特征在于安祖花試管苗煉苗移栽技術(shù)是按以下步驟和方法進(jìn)行A、選用II、III號培養(yǎng)基交替培養(yǎng)所獲得的壯苗，無需轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基，即可形成完整植株；因此在培養(yǎng)過程中隨著不定根的出現(xiàn)，即可出瓶移栽，簡化繁殖程序。B、移栽預(yù)處理用500-2000倍的高錳酸鉀、多菌靈、代森錳鋅、甲基托布津、家用鏈霉素等藥劑浸泡5-25分鐘。C、栽培基質(zhì)選擇移栽時選用椰糠∶泥炭土∶珍珠巖＝2∶2∶1為基質(zhì)；移栽前用同濃度浸泡藥劑淋透放置2-3天，然后再移栽。D、移栽后管理移栽后，轉(zhuǎn)入煉苗室，用薄膜密封煉苗，溫度控制在22～28℃，濕度60～80％； 2～7天向膜內(nèi)噴水一次，20～40天后慢慢打開薄膜；移栽后10天，開始用MS母液噴霧(每周一次)，當(dāng)新葉長出時，轉(zhuǎn)入到溫室培養(yǎng)。
全文摘要
安祖花組培新技術(shù)，選用幼嫩組織誘導(dǎo)出來的少量無菌苗莖段作為外植體，接種在I、II、III號培養(yǎng)基上，同步誘導(dǎo)出愈傷組織、側(cè)芽、不定根；試管苗不必另行壯苗生根，長至2－3cm高時即可切取，然后用藥劑浸泡處理移栽，轉(zhuǎn)入煉苗室，移栽成活率達(dá)95％以上。本發(fā)明可在4－5個月內(nèi)形成大量完整植株，為工廠化育種創(chuàng)造了良好的條件。
文檔編號A01H4/00GK1739341SQ20041004669
公開日2006年3月1日 申請日期2004年8月24日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月24日
發(fā)明者易自力, 黃麗芳, 蔣建雄, 蔡能 申請人:易自力, 黃麗芳, 蔡能